Biyolojik Hücrelerin Mekanik Yorgunluğunu Değerlendirmek için Genlik Modülasyonlu Elektrodeformasyon

Özet

Burada, genlik modülasyonlu bir elektrodeformasyon yaklaşımı kullanan insan kırmızı kan hücreleri durumunda mekanik yorulma testi için bir protokol sunulmaktadır. Bu genel yaklaşım, döngüsel deformasyondan kaynaklanan bir süspansiyondaki biyolojik hücrelerin morfolojik ve biyomekanik özelliklerindeki sistematik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.

Özet

Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) olağanüstü deforme olabilirlikleri ile bilinir. Mikro sirkülasyondan geçerken tekrar tekrar önemli deformasyona uğrarlar. Fizyolojik olarak yaşlanmış eritrositlerde azalmış deformabilite görülür. Hücre deformasyonunu ölçmek için mevcut teknikler, döngüsel yüklerin neden olduğu hücre zarlarındaki kademeli bozulma olan yorgunluğu ölçmek için kolayca kullanılamaz. Mikroakışkan bir kanalda genlik kaydırmalı anahtarlama (ASK) modülasyonu tabanlı elektrodeformasyon kullanarak döngüsel kesme gerilmelerinden kaynaklanan RBC'lerdeki mekanik bozunmayı değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Kısaca, mikroakışkan kanaldaki sayısallaştırılmış elektrotlar, bir sinyal üreteci kullanılarak radyo frekanslarında düşük voltajlı bir alternatif akımla uyarılır. Süspansiyondaki RBC'ler elektrik alanına tepki verir ve hücreleri elektrot kenarlarına hareket ettiren pozitif dielektroforez (DEP) sergiler. Hücreler daha sonra iki hücre yarısına uygulanan elektriksel kuvvetler nedeniyle gerilir ve elektrodeformasyon olarak bilinen tek eksenli gerilmeye neden olur. Kesme gerilimi seviyesi ve ortaya çıkan deformasyon, uyarma dalgasının genliği değiştirilerek kolayca ayarlanabilir. Bu, yüksek verimde küçük ve büyük deformasyonlara yanıt olarak RBC'lerin doğrusal olmayan deforme olabilirliğinin ölçülmesini sağlar. Uyarma dalgasının ASK stratejisi ile değiştirilmesi, programlanabilir yükleme hızları ve frekansları ile döngüsel elektrodeformasyonu indükler. Bu, RBC yorgunluğunun karakterizasyonu için uygun bir yol sağlar. ASK modülasyonlu elektrodeformasyon yaklaşımımız, ilk kez, döngüsel yüklerden kaynaklanan RBC yorgunluğunun doğrudan ölçülmesini sağlar. Genel biyomekanik testler için, diğer hücre tiplerinde ve hastalıklı durumlarda hücre deforme olabilirliği ve yorgunluğunun analizi için bir araç olarak kullanılabilir ve ayrıca oksijen gerilimi ve biyolojik ve kimyasal ipuçları gibi hücrelerin mikro çevresini kontrol etme stratejileri ile birleştirilebilir.

Giriş

Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) insan vücudundaki en çok deforme olabilen hücrelerdir¹. Deforme olmaları, oksijen taşıma işlevleriyle doğrudan ilişkilidir. RBC'lerde azalmış deformabilitenin çeşitli RBC bozukluklarının patogenezi ile ilişkili olduğu bulunmuştur². Deformabilite ölçümleri, RBC ile ilişkili hastalıkları daha iyi anlamamızı sağlamıştır³. RBC'lerin normal ömrü 70 ila 140 gün^{arasında değişebilir 4}. Bu nedenle, yaşlanma süreciyle birlikte deforme olabilirliklerinin nasıl azaldığını, örneğin döngüsel kayma gerilmelerinden kaynaklanan yorulma davranışlarını^{ölçmek önemlidir 3}.

RBC'nin yüksek verimde deforme olabilirliğini ölçmek, tek tek hücrelere uygulanan pikonewton ölçek kuvvetleri (~ ^10-12 N) nedeniyle zordur. Son on yılda, hücre deformabilitesini ölçmek için birçok teknoloji geliştirilmiştir⁵. RBC'lerin tek hücre seviyesindeki deformasyon ölçümleri pipet aspirasyonu ve optik cımbız ile yapılabilirken, toplu analizler ozmotik gradyan ektasitometri ile yapılır. Ektasitometri analizleri, kan bozukluklarını teşhis etme fırsatı sağlayan bol miktarda veri sağlar ^6,7. RBC'lerin deforme olabilirliği, kolloid prob atomik kuvvet mikroskobu ile viskoelastik teori kullanılarak da analiz edilebilir. Bu yöntemde, hem zamana bağlı hem de kararlı durum tepkileri dikkate alınarak RBC'lerin elastik modülünü tahmin etmek için hesaplamalı analiz uygulanır. Bireysel RBC'lerin deforme olabilirliği, tek hücreli mikro odacıklı dizi yöntemi kullanılarak ölçülebilir. Bu yöntem, hematolojik bozuklukları tespit etmek için RBC deformabilitesi ve karmaşık RBC popülasyonlarındaki hücresel özelliklerin dağılımı hakkında bilgi sağlamak için her hücreyi membran ve sitozolik floresan belirteçler aracılığıyla analiz eder⁸.

Yorulma, mühendislik malzemelerinin ve biyomalzemelerin özelliklerinin bozulmasında önemli bir faktördür. Yorulma testi, döngüsel yüklemeye maruz kalan bir yapının bütünlüğünün ve uzun ömürlülüğünün nicel bir analizini sağlar. Biyolojik hücrelerde yorgunluğun analizi, hücre zarlarında döngüsel deformasyonun uygulanması için genel, kolayca uygulanabilir, yüksek verim ve kantitatif bir yöntemin olmaması nedeniyle uzun süredir engellenmiştir. Bu, mikroakışkan bir ortamda uygulanan elektrik sinyali modülasyonu ve elektrodeformasyon tekniklerinin kullanılmasıyla mümkündür. Dijital modülasyon olarak genlik kaydırmalı anahtarlama (ASK) tekniği, bu makalede On-Off anahtarlama (OOK) modülasyonu ile uygulanmaktadır. Anahtarlama kavramı,^{9 işlevi için} bir sinüs dalgası taşıyıcı sinyali gerektiren kanal üzerinden dijital sinyallerin iletimini ifade eder. AÇIK ve KAPALI süreleri eşit olarak ayarlanabilir. AÇMA AÇMA altında, RBC'ler, düzgün olmayan elektrik alanı tarafından oluşturulan harici bir elektrodeformasyon kuvvetine (F_dep)¹⁰ maruz kaldıklarında deforme bir duruma girerler. OFF-key altında, RBC'ler rahat durumdadır. RBC'lerin yorgunluğunu, yani artan yükleme döngüleri ile esneme yeteneklerinde aşamalı bir bozulma gözlemliyoruz. RBC'lerde yorgunluğa bağlı deformabilite kaybı, kan dolaşımı sırasında biriken membran hasarı hakkında fikir verebilir ve hücre yorgunluğu ile hastalık durumları arasındaki bağlantıları daha fazla araştırmamızı sağlar.

Burada, ASK modülasyonlu elektrodeformasyon yoluyla bir mikroakışkan cihazda RBC'lerin yorulma testinin nasıl uygulandığına ve RBC'lerin mekanik deformasyonundaki kademeli bozunmanın karakterizasyonu için mikroakışkan cihaz, mekanik yükleme ve mikroskobik görüntüleme gibi sistem ayarlarına ilişkin adım adım prosedürler sunuyoruz.

Protokol

Kimliği belirsiz insan tam kanı ticari olarak elde edildi. Kan örneklerini içeren çalışma, Florida Atlantic Üniversitesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak bir biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuvarında gerçekleştirildi.

1. Mikroakışkan cihaz hazırlığı

1. Mikroakışkan kanal tasarımı için SU-8 ana silikon gofreti 14 cm'lik plastik bir Petri kabının içine bantlayın ve_N2 gazıyla temizleyin.
2. Bir kağıt kapta 60 g polidimetilsiloksan (PDMS) bazı ve 6 g PDMS kürleme maddesi tartın. Karışım bulanık beyaz bir renk alana kadar tahta bir spatula kullanarak iki parçayı karıştırın.
3. PDMS karışımını silikon gofret içeren plastik Petri kabına dökün. Petri kabını 3 bir musluklu vakumlu bir desikatöre yerleştirin. PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için vakumu kurutucu odasına bağlamak için vananın valfini çevirin.
4. Desikatör haznesini yaklaşık 5 dakikalık döngülerde ortama bağlamak için vana valfini ayarlayarak desikatör haznesine yeniden hava verin. Kanalların özelliklerinden tüm hava kabarcıkları çıkana kadar tekrarlayın.
5. Petri kabını 70 °C'de 4 saat fırına koyun. Zaman geçtikten sonra Petri kabını çıkarın, oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve bir kesme matının üzerine koyun.
6. Bir neşter kullanarak, PDMS'nin silikon gofretin üzerindeki kısmını kesin. Kesik PDMS'yi iki laboratuvar sarma filmi tabakası arasına yerleştirin. Mikrokanalın girintisi ile yarı saydam film arasında oluşan boşluk, mikroakışkan kanalın konumunun yanı sıra ilgili giriş ve çıkışının tanımlanmasını kolaylaştırır.
7. Bir tıraş bıçağı kullanarak, büyük PDMS'den ayrı bir kanal kesin. İki boyuta göre biyopsi zımbaları kullanarak 3 mm'lik bir giriş deliği ve 1.5 mm'lik bir çıkış deliği açın (Şekil 1A).
8. Delikli kanalı, kanal tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir cam kızak üzerine yerleştirin. İnce film İndiyum Kalay Oksit (ITO) interdigitated elektrotlar içeren 20 mm x 15 mm'lik bir cam alt tabakayı, elektrotlar yukarı bakacak şekilde aynı cam slayt üzerine yerleştirin.
9. PDMS ve alt tabaka ile cam sürgüyü yavaşça bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Gaz vanasını kapatın, pompa anahtarını AÇIN ve 600 - 800 mTorr'luk bir sensör okuması elde etmek için 2 dakika bekleyin.
10. Güç anahtarını AÇIN ve 30 saniye bekleyin. RF güç düğmesini düşükten yükseğe çevirin ve 1 dakika bekleyin.
11. Ardından, RF düğmesini düşük, güç anahtarını KAPALI, pompa anahtarını KAPALI konuma getirerek ve gaz vanasını açarak sırayı tersine çevirin.
12. Plazma temizleyicinin haznesini açtıktan hemen sonra, PDMS'yi kanal tarafı aşağı bakacak şekilde (180°) kaldırın ve döndürün. Kanalı ITO alt tabakasının üstüne yerleştirin. Yapıştırma işlemi başladı.
13. Cımbız kullanarak, PDMS'nin köşelerine yaklaşık 3 saniye boyunca hafifçe bastırın. Kanalın kendisine bastırmaktan kaçının.
    NOT: Yapıştırma işlemi, işlem görmüş iki yüzey arasındaki fiziksel temas üzerine kendiliğinden gerçekleşir.
14. Hazırlama ortamını 23 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. İğneyi doğrudan girişe sokarak ve ardından ortamı serbest bırakarak kanalı dikkatlice ıslatın. Yavaş çalıştırın. Hava kabarcıkları sokmayın. En az 3 dakika inkübe edin.
15. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak ana ortamı çıkarın. DEP ortamını kanala sokarak kanalı DEP ortamıyla 3 kez yıkayın. Kanalı her zaman ıslak tutun.

2. Test fikstürü

NOT: Test fikstürü, 3D CAD yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır ve bir taban muhafaza ünitesi ve bir üst ünite içerir (Şekil 1B). Daha sonra, standart tolerans sınırı yaklaşık ± olan 3 eksenli bir CNC freze makinesi kullanılarak üretilir test fikstürünün boyutu elektronik bir kumpas (gösterilmemiştir) kullanılarak kontrol edilir. İn vitro biyomekanik test için fikstürün sterilitesi gerekli değildir.

1. Telleri iki set yaylı piston konektörünün lehim kabı uçlarına önceden lehimleyin.
2. Yaylı piston konektörlerini üst üniteye yerleştirin ve bir damla epoksi yapıştırıcı ekleyerek kalıcı bir yapıştırma oluşturun.

3. Elektrodeformasyon çalışma tamponunun hazırlanması

1. DEP ortamını hazırlamak için, bir ölçek kullanarak 12.75 g sakaroz ve 0.45 g dekstroz tartın.
2. Her iki tozu da 150 mL deiyonize (DI) su ve 3.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren tek bir kapta çözün.
3. Düşük aralıklı bir iletkenlik test cihazı kullanarak iletkenliği ölçün ve 0,04 S/m olduğundan emin olun (Şekil 2).
   NOT: Ortaya çıkan DEP kuvvetinin¹¹ işaretini ve büyüklüğünü değiştirebilecek farklı bir iletkenlik değeri kullanılabilir. Bununla birlikte, elektrodeformasyon, pozitif bir DEP kuvveti gerektirir.
4. Bir ozmolik kullanarak, ozmolaritenin kan plazmasının normal aralığında, 275 ila 295 mOsm/kg su içinde olduğunu doğrulayın (Şekil 3). 4 °C'de saklayın. DEP ortamı artık hazırlanmıştır.
5. 15 mL'lik bir tüpte, 0.5 g sığır serum albüminini (BSA) 10 mL DEP ortamında çözün. İyice karıştırın. Cihazın ana ortamı şimdi hazırlanmıştır.

4. Hücre süspansiyonunun hazırlanması

1. Kanı 1 mL PBS ile 268 x g'da 3 dakika santrifüj ederek 20 μL tam kanı yıkayın. Süpernatanı atın.
2. RBC'leri 1 mL PBS'de yeniden askıya alın. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. RBC'leri 268 x g'da 3 dakika yıkayın ve süpernatanı atın.
3. 10 μL'lik bir mikropipet ucu kullanarak 5 μL RBC peletini çıkarın ve 1 mL DEP ortamına tamamen dağıtın. Hücreleri 268 x g'da santrifüjleyerek 3 dakika yıkayın.
4. Süpernatanı atın ve RBC'leri 1 mL DEP ortamında yeniden süspanse edin. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
5. RBC'leri 268 x g'da 3 dakika yıkayın ve süpernatanı atın. 2 μL RBC peletini 500 μL DEP ortamına pipetleyin. Hücre süspansiyonu şimdi 62 - 104 hücre/μL¹² aralığında bir konsantrasyonla hazırlanır ve bu konsantrasyon standart bir hücre sayım slaytı kullanılarak doğrulanabilir.

5. Elektrodeformasyon kurulumu ve yorulma testi

1. Mikroakışkan cihazı test fikstürünün alt kısmına yerleştirin. Armatürün üst kısmını cihaza hizalayın ve iki set naylon vida ve somun kullanarak iki parçayı birleştirin (Şekil 4).
2. Test fikstürünü mikroskop tablasına yerleştirin. Mikroskop altında istediğiniz bir elektrot setini bulun.
3. Bulunan elektrot setiyle eşleşen ilgili elektrot kablosu çiftini fonksiyon üretecinin çıkış terminaline bağlayın (Şekil 4).
4. Mikroakışkan kanalın 5 mm girişinden 3 μL DEP ortamını çıkarın. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 5 μL hücre süspansiyonunu yavaşça girişe yükleyin.
5. Hücrelerin 1 dakika oturmasına izin verin. Gerekirse, hücreleri kanala itmek için girişe ek bir DEP ortamı ekleyin.
6. Kanalı 20x büyütme altında gözlemleyin. Görüntülemenin kontrastını artırmak için 414/46 nm bant geçiren filtre kullanın.
7. Sinüs düğmesine basın ve 2 MHz frekansında 3 V_RMS genliğine sahip bir sinüs dalgası tanımlayın. Modülasyonu etkinleştirmek için Mod düğmesine basın. Tip seçeneğine basarak dalga modunu ASK olarak değiştirin.
8. Modülasyon frekansını, 250 s'lik bir yükleme-boşaltma süresine karşılık gelen 4 mHz'e ayarlayın (Şekil 5A). Fonksiyon üretecinin çıkışını AÇIN.
9. Her 10 dakikada bir saniyede 30 kare (fps) hızında 1 dakikalık bir video kaydedin.

6. RBC deformasyonunun karakterizasyonu

1. Bir video düzenleme uygulaması kullanarak, önceki adımda kaydedilen .avi dosyalarını Ctrl+O tuşlarına basarak açın. İlgilendiğiniz bir kareyi seçmek için zaman çizelgesini kullanın ve Ana Ekran tuşuna ve ardından klavyede Bitir tuşuna basarak seçimin başlangıç ve bitiş karelerini aynı olacak şekilde ayarlayın.
2. Görüntü çerçevesini dışa aktarın. JPEG olacak çıktı formatını seçin ve OK tuşuna basın.
3. ImageJ uygulamasını açın ve önceki adımda kaydedilen görüntüleri yükleyin. Analyze > Set Measurement'a basarak ve Area, Perimeter (Çevre ) ve Fit Elips (Elips'e Sığdır ) onay kutularının işaretli olduğundan emin olarak gerekli ölçümleri ayarlayarak başlayın. Tamam'a basın.
4. Ardından, Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek görüntüyü gri tonlamaya dönüştürün.
5. Ardından, Görüntü > Eşik Ayarlama'yı kullanarak görüntüyü ikiliye dönüştürün >. Eşik iletişim kutusunda, iki kaydırıcıyı gerektiği gibi ayarlayın. Apply (Uygula ) düğmesine basın ve ardından Threshold (Eşik) iletişim kutusunu kapatın.
6. ROI Yöneticisi> Analiz > Araçları'nı seçin. ROI Yöneticisi'nde, Tümünü Göster etiketli onay kutusuna basın. Bu kutuyu kapatmayın.
7. Değnek (izleme) Aracı'nı seçin, görüntüde uygun bir hücre seçin ve klavyede T tuşuna basın. Seçilen hücre numaralandırılacaktır. Yeni bir hücre tekrar seçilebilir. Ölçülecek tüm uygun hücreleri seçin. Uygulanabilir hücreler, diğer hücrelerden izole edilenler olarak tanımlanır. Bu hücrelerin sayısı tek bir görüş alanında 50 ila 200 arasında değişebilir.
8. ROI Yöneticisi kutusuna dönün ve Ölç'e basın. Bu, Sonuçlar kutusunu açar. Major (Büyük) ve Minor (Minör) etiketli sütunlar, sırasıyla elips, majör ve minör eksenlerin uzunluklarıdır (piksel cinsinden). Ölçümleri CSV formatlı bir dosya olarak dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet'i seçin.
9. Herhangi bir uygun hesaplamalı analiz yazılımını kullanarak, Majör ve Minör bölümünü hesaplayın.

Sonuçlar

Mikroakışkan kanala hücre süspansiyonu yüklendiğinde, nispeten düzgün bir hücre dağılımı gözlendi. Fonksiyon üretecinden gelen sinyal çıkışı (örneğin, basit bir sinüs dalgası veya ASK'nin Anahtarlama fazı) üzerine, ince film sayısallaştırılmış elektrotlar düzgün olmayan bir alternatif akım elektrik alanı üretti. Asılı hücreler bu elektriksel uyarıma kendiliğinden tepki verdiler ve pozitif bir DEP davranışı sergilediler, yani daha yüksek alan kuvvetine sahip elektrotların ken...

Tartışmalar

Bir DEP kuvveti indükleyen sinüs dalgasının ASK OOK modülasyonu, RBC'lerin mekanik yorgunluğunu uzun bir süre boyunca test etmek için kullanılabilir. Bu protokolde, hücre deformabilitesi üzerindeki olası olumsuz metabolik etkileri önlemek için in vitro yorgunluk testini 1 saat ile sınırladık. Kapsamlı yorulma testi koşulları, ASK modülasyonlu elektrodeformasyon tekniği kullanılarak programlanabilir. Yükleme frekansı, genlik ve yükleme hızı gibi parametrelerin tümü programlanabilir. Yükleme ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"