Амплитудно-модулированная электродеформация для оценки механической усталости биологических клеток

Резюме

Здесь представлен протокол испытаний на механическую усталость эритроцитов человека с использованием амплитудно-модулированного электродеформационного подхода. Этот общий подход может быть использован для измерения систематических изменений морфологических и биомеханических характеристик биологических клеток в суспензии от циклической деформации.

Аннотация

Красные кровяные тельца (эритроциты) известны своей замечательной деформируемостью. Они многократно претерпевают значительную деформацию при прохождении через микроциркуляцию. Снижение деформируемости наблюдается у физиологически стареющих эритроцитов. Существующие методы измерения деформируемости клеток не могут быть легко использованы для измерения усталости, постепенной деградации клеточных мембран, вызванной циклическими нагрузками. Представлен протокол оценки механической деградации эритроцитов от циклических касательных напряжений с использованием электродеформации на основе модуляции амплитудного сдвига (ASK) в микрофлюидном канале. Вкратце, взаимосвязанные электроды в микрофлюидном канале возбуждаются переменным током низкого напряжения на радиочастотах с помощью генератора сигналов. Эритроциты во взвешенном состоянии реагируют на электрическое поле и проявляют положительный диэлектрофорез (ДЭП), который перемещает клетки к краям электродов. Затем ячейки растягиваются за счет электрических сил, действующих на две половинки ячейки, что приводит к одноосному растяжению, известному как электродеформация. Уровень напряжения сдвига и результирующей деформации можно легко регулировать, изменяя амплитуду волны возбуждения. Это позволяет количественно оценить нелинейную деформируемость эритроцитов в ответ на малые и большие деформации при высокой пропускной способности. Модификация волны возбуждения с помощью стратегии ASK индуцирует циклическую электродеформацию с программируемыми скоростями и частотами нагрузки. Это обеспечивает удобный способ определения усталости эритроцитов. Наш подход к электродеформации с ASK-модуляцией впервые позволяет напрямую измерять усталость эритроцитов от циклических нагрузок. Его можно использовать в качестве инструмента для общего биомеханического тестирования, для анализа деформируемости и усталости клеток в других типах клеток и при заболеваниях, а также можно комбинировать со стратегиями контроля микроокружения клеток, такими как напряжение кислорода и биологические и химические сигналы.

Введение

Эритроциты (эритроциты) являются наиболее деформируемыми клетками в организме человека¹. Их деформируемость напрямую связана с их кислородонесущей функцией. Было обнаружено, что снижение деформируемости эритроцитов коррелирует с патогенезом ряда нарушений эритроцитов². Измерения деформируемости привели нас к лучшему пониманию заболеваний, связанных с эритроцитами³. Нормальная продолжительность жизни эритроцитов может варьироваться от 70 до 140^дней4. Поэтому важно измерить, как их деформируемость уменьшается вместе с процессом старения, например, их усталостное поведение из-....

протокол

Обезличенная цельная человеческая кровь была получена коммерчески. Работа с образцами крови проводилась в лаборатории 2-го уровня биобезопасности с использованием протоколов, утвержденных Институциональным комитетом по биобезопасности Атлантического университета Флориды.

1. Подготовка микрофлюидных устройств

1. Приклейте мастер-кремниевую пластину SU-8 для микрофлюидного канала на внутреннюю сторону пластиковой чашки Петри диаметром 14 см и очистите ее газом_N2 .
2. Взвесьте 60 г полидиметилсилоксанового (ПДМС) основания и 6 г отвердителя ПДМС в бумажном стаканчике. Смешайте две части деревянной лопа....

Результаты

При загрузке клеточной суспензии в микрофлюидный канал наблюдалось относительно равномерное распределение клеток. При выходе сигнала (например, простой синусоиды или фазы ASK) от генератора функций тонкопленочные межцифровые электроды создавали неоднородное электрическое поле перем.......

Обсуждение

Модуляция ASK OOK синусоиды, индуцирующей силу DEP, может быть использована для испытания механической усталости эритроцитов в течение длительного периода времени. В этом протоколе мы ограничили испытание на усталость in vitro 1 часом, чтобы предотвратить потенциальное неблагоприятное метаб?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"