Амплитудно-модулированная электродеформация для оценки механической усталости биологических клеток

Резюме

Здесь представлен протокол испытаний на механическую усталость эритроцитов человека с использованием амплитудно-модулированного электродеформационного подхода. Этот общий подход может быть использован для измерения систематических изменений морфологических и биомеханических характеристик биологических клеток в суспензии от циклической деформации.

Аннотация

Красные кровяные тельца (эритроциты) известны своей замечательной деформируемостью. Они многократно претерпевают значительную деформацию при прохождении через микроциркуляцию. Снижение деформируемости наблюдается у физиологически стареющих эритроцитов. Существующие методы измерения деформируемости клеток не могут быть легко использованы для измерения усталости, постепенной деградации клеточных мембран, вызванной циклическими нагрузками. Представлен протокол оценки механической деградации эритроцитов от циклических касательных напряжений с использованием электродеформации на основе модуляции амплитудного сдвига (ASK) в микрофлюидном канале. Вкратце, взаимосвязанные электроды в микрофлюидном канале возбуждаются переменным током низкого напряжения на радиочастотах с помощью генератора сигналов. Эритроциты во взвешенном состоянии реагируют на электрическое поле и проявляют положительный диэлектрофорез (ДЭП), который перемещает клетки к краям электродов. Затем ячейки растягиваются за счет электрических сил, действующих на две половинки ячейки, что приводит к одноосному растяжению, известному как электродеформация. Уровень напряжения сдвига и результирующей деформации можно легко регулировать, изменяя амплитуду волны возбуждения. Это позволяет количественно оценить нелинейную деформируемость эритроцитов в ответ на малые и большие деформации при высокой пропускной способности. Модификация волны возбуждения с помощью стратегии ASK индуцирует циклическую электродеформацию с программируемыми скоростями и частотами нагрузки. Это обеспечивает удобный способ определения усталости эритроцитов. Наш подход к электродеформации с ASK-модуляцией впервые позволяет напрямую измерять усталость эритроцитов от циклических нагрузок. Его можно использовать в качестве инструмента для общего биомеханического тестирования, для анализа деформируемости и усталости клеток в других типах клеток и при заболеваниях, а также можно комбинировать со стратегиями контроля микроокружения клеток, такими как напряжение кислорода и биологические и химические сигналы.

Введение

Эритроциты (эритроциты) являются наиболее деформируемыми клетками в организме человека¹. Их деформируемость напрямую связана с их кислородонесущей функцией. Было обнаружено, что снижение деформируемости эритроцитов коррелирует с патогенезом ряда нарушений эритроцитов². Измерения деформируемости привели нас к лучшему пониманию заболеваний, связанных с эритроцитами³. Нормальная продолжительность жизни эритроцитов может варьироваться от 70 до 140^дней4. Поэтому важно измерить, как их деформируемость уменьшается вместе с процессом старения, например, их усталостное поведение из-за циклических касательных напряжений³.

Измерение деформируемости эритроцитов при высокой производительности является сложной задачей из-за сил шкалы Пиконевтона (~^10-12 Н), которые прикладываются к отдельным ячейкам. За последнее десятилетие было разработано множество технологий для измерения^{деформируемости} клеток5. Измерение деформации эритроцитов на уровне отдельных клеток может быть выполнено с помощью пипеточной аспирации и оптического пинцета, в то время как объемный анализ выполняется с помощью эктацитометрии с осмотическим градиентом. Эктацитометрические анализы дают обилие данных, что дает возможность диагностировать заболевания крови ^6,7. Деформируемость эритроцитов также может быть проанализирована с помощью теории вязкоупругости с помощью коллоидной зондовой атомно-силовой микроскопии. В этом методе для оценки модуля упругости эритроцитов применяется вычислительный анализ, учитывающий как нестационарные, так и стационарные отклики. Деформируемость отдельных эритроцитов может быть измерена с помощью метода одноячеистой микрокамерной матрицы. Этот метод анализирует каждую клетку через мембранные и цитозольные флуоресцентные маркеры для получения информации о деформируемости эритроцитов и распределении клеточных характеристик в сложных популяциях эритроцитов для выявления гематологических нарушений⁸.

Усталость является ключевым фактором ухудшения свойств конструкционных материалов и биоматериалов. Усталостные испытания позволяют провести количественный анализ целостности и долговечности конструкции, подверженной циклическому нагружению. Анализ усталости в биологических клетках долгое время затруднялся отсутствием общего, легко применимого, высокопроизводительного и количественного метода реализации циклической деформации в клеточных мембранах. Это возможно благодаря использованию методов модуляции электрического сигнала и электродеформации, реализованных в микрофлюидной среде. Метод амплитудной манипуляции со сдвигом (ASK) в качестве цифровой модуляции применяется в этой статье с помощью модуляции On-Off (OOK). Концепция манипуляции относится к передаче цифровых сигналов по каналу, для функционирования которой требуется синусоидальный несущий сигнал⁹. Время включения и выключения может быть установлено равным. При ON-манипуляции эритроциты переходят в деформированное состояние под действием внешней силы электродеформации (F_dep)¹⁰ , создаваемой неоднородным электрическим полем. При выключении ключей эритроциты находятся в расслабленном состоянии. Мы наблюдаем усталость эритроцитов, а именно прогрессирующую деградацию их способности растягиваться с увеличением циклов нагружения. Вызванная усталостью потеря деформируемости эритроцитов может дать представление о накопленном повреждении мембран во время кровообращения, что позволит нам глубже исследовать связи между усталостью клеток и болезненными состояниями.

Здесь мы приводим пошаговые процедуры по проведению усталостных испытаний эритроцитов в микрофлюидном устройстве с помощью ASK-модулированной электродеформации и системных настроек, таких как микрофлюидное устройство, механическое нагружение и микроскопическое воображение для характеризации постепенной деградации механической деформируемости эритроцитов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Обезличенная цельная человеческая кровь была получена коммерчески. Работа с образцами крови проводилась в лаборатории 2-го уровня биобезопасности с использованием протоколов, утвержденных Институциональным комитетом по биобезопасности Атлантического университета Флориды.

1. Подготовка микрофлюидных устройств

1. Приклейте мастер-кремниевую пластину SU-8 для микрофлюидного канала на внутреннюю сторону пластиковой чашки Петри диаметром 14 см и очистите ее газом_N2 .
2. Взвесьте 60 г полидиметилсилоксанового (ПДМС) основания и 6 г отвердителя ПДМС в бумажном стаканчике. Смешайте две части деревянной лопаткой, пока смесь не приобретет мутно-белый цвет.
3. Вылейте смесь PDMS в пластиковую чашку Петри, содержащую кремниевую пластину. Поместите чашку Петри в вакуумный эксикатор с 3-ходовым запорным краном. Поверните клапан запорного крана, чтобы подключить вакуум к камере эксикатора для удаления пузырьков воздуха из PDMS.
4. Повторно введите воздух в камеру эксикатора, отрегулировав клапан запорного крана, чтобы подключить камеру эксикатора к окружающей среде примерно через 5-минутные циклы. Повторяйте до тех пор, пока все пузырьки воздуха не будут удалены с особенностей каналов.
5. Поместите чашку Петри в духовку при температуре 70 °C на 4 часа. По истечении времени снимите чашку Петри, дайте ей остыть до комнатной температуры и положите на коврик для резки.
6. С помощью скальпеля вырежьте часть PDMS над кремниевой пластиной. Поместите вырезанный PDMS между двумя листами лабораторной упаковочной пленки. Зазор, образующийся между углублением микроканала и полупрозрачной пленкой, облегчает идентификацию местоположения микрофлюидного канала, а также его соответствующих входных и выходных отверстий.
7. С помощью бритвенного лезвия вырежьте отдельный канал из большого PDMS. Пробейте входное отверстие диаметром 3 мм и выходное отверстие диаметром 1,5 мм с помощью пробойников для биопсии, соответствующих двум размерам (Рисунок 1A).
8. Поместите канал с перфорацией вверх стороной канала на чистое предметное стекло. Поместите стеклянную подложку размером 20 мм x 15 мм, содержащую тонкопленочные электроды из оксида индия-олова (ITO), на том же предметном стекле электродами вверх.
9. Аккуратно поместите предметное стекло с PDMS и подложкой в плазменный очиститель. Закройте газовый клапан, включите переключатель насоса и подождите 2 минуты, чтобы получить показания датчика 600 - 800 мРтр.
10. Включите выключатель питания и подождите 30 секунд. Поверните ручку радиочастотного питания с низкого на высокий и подождите 1 минуту.
11. Затем измените последовательность, повернув ручку RF в положение LOW, выключатель питания в положение OFF, переключатель насоса в положение OFF и открыв газовый клапан.
12. Сразу после открытия камеры плазменного очистителя поднимите и поверните PDMS так, чтобы сторона канала была обращена вниз (180°). Поместите канал на подложку ITO. Процесс склеивания начался.
13. С помощью пинцета аккуратно надавите на углы PDMS примерно на 3 с. Избегайте надавливания на сам канал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс склеивания происходит самопроизвольно при физическом контакте между двумя обрабатываемыми поверхностями.
14. Наполните грунтовочную среду в шприц объемом 1 мл иглой 23 G. Осторожно намочите канал, вставив иглу прямо во впускной колодец, а затем выпустив среду. Работайте медленно. Не вводите пузырьки воздуха. Выдерживать не менее 3 мин.
15. Удалите основную среду с помощью наконечника для пипетки на 10 мкл. Промойте канал средством DEP 3 раза, вставив его в канал. Всегда держите канал влажным.

2. Тестовое приспособление

ПРИМЕЧАНИЕ: Испытательное приспособление спроектировано с использованием программного обеспечения 3D CAD и включает в себя базовый корпус и верхний блок (рис. 1B). Затем он изготавливается на 3-осевом фрезерном станке с ЧПУ со стандартным пределом допуска около ± 0,005-дюймовый размер испытательного приспособления проверяется с помощью электронного штангенциркуля (не показан). Стерильность приспособления не требуется для биомеханических испытаний in vitro.

1. Предварительно припаяйте провода к концам паяльных чашек двух комплектов пружинно-поршневых соединителей.
2. Вставьте пружинные поршневые соединители в верхний блок и создайте постоянное соединение, добавив каплю эпоксидного клея.

3. Приготовление электродеформационного рабочего буфера

1. Для приготовления среды DEP взвесьте 12,75 г сахарозы и 0,45 г декстрозы с помощью весов.
2. Растворите оба порошка в одном контейнере со 150 мл деионизированной (DI) воды и 3,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
3. С помощью низкочастотного измерителя проводимости измерьте проводимость и убедитесь, что она составляет 0,04 См/м (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другое значение проводимости, которое может изменить знак и величину результирующей силы DEP¹¹. Электродеформация, однако, требует положительной силы DEP.
4. С помощью осмометра убедитесь, что осмолярность находится в пределах нормального диапазона плазмы крови, от 275 до 295 мОсм/кг воды (рис. 3). Хранить при температуре 4 °C. В настоящее время среда DEP подготовлена.
5. В пробирке объемом 15 мл растворяют 0,5 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 10 мл среды ДЭП. Тщательно перемешайте. Теперь основная среда устройства готова.

4. Приготовление клеточной суспензии

1. Промыть 20 мкл цельной крови, центрифугируя кровь с 1 мл PBS в дозе 268 x g в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
2. Ресуспендируйте эритроциты в 1 мл PBS. Аккуратно пипеткой перемешать. Промойте эритроциты в течение 3 минут при 268 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
3. Извлеките 5 мкл гранулы эритроцитов с помощью наконечника микропипетки на 10 мкл и полностью распределите в 1 мл среды DEP. Промойте клетки центрифугированием при 268 x g в течение 3 мин.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте эритроциты в 1 мл среды DEP. Аккуратно пипеткой перемешать.
5. Промойте эритроциты в течение 3 минут при 268 x g и выбросьте надосадочную жидкость. Пипетка 2 мкл гранулы эритроцитов в 500 мкл среды DEP. В настоящее время клеточная суспензия готовится с концентрацией в диапазоне 62 - 104 клеток/мкл¹², что может быть подтверждено с помощью стандартного предметного стекла для подсчета клеток.

5. Наладка электродеформации и усталостные испытания

1. Поместите микрофлюидное устройство в нижнюю часть испытательного приспособления. Совместите верхнюю часть приспособления с устройством и соберите две части с помощью двух наборов нейлоновых винтов и гаек (Рисунок 4).
2. Поместите испытательное приспособление на предметный столик микроскопа. Найдите один нужный набор электродов под микроскопом.
3. Подсоедините соответствующую пару электродных проводов, соответствующих расположенному набору электродов, к выходной клемме генератора функций (рис. 4).
4. Удалите 5 мкл среды DEP из 3-миллиметрового входного отверстия микрофлюидного канала. Медленно загрузите 5 мкл клеточной суспензии во входное отверстие с помощью наконечника дозатора на 10 мкл.
5. Дайте клеткам успокоиться в течение 1 минуты. При необходимости добавьте дополнительную среду DEP на входное отверстие, чтобы протолкнуть ячейки в канал.
6. Наблюдайте за каналом при 20-кратном увеличении. Используйте полосовой фильтр 414/46 нм для повышения контрастности изображения.
7. Нажмите кнопку Sine (Синусоида) и задайте синусоиду с амплитудой 2 В_RMS на частоте 3 МГц. Нажмите кнопку Mod , чтобы включить модуляцию. Измените волновой режим на ASK, нажав опцию Type .
8. Установите частоту модуляции на 250 мГц, что соответствует периоду загрузки-разгрузки 4 с (рис. 5A). Включите выход генератора функций.
9. Записывайте видео продолжительностью 1 минуту каждые 10 минут с частотой 30 кадров в секунду (fps).

6. Характеристика деформации эритроцитов

1. Используя приложение для редактирования видео, откройте файлы .avi, записанные на предыдущем шаге, нажав Ctrl+O. Используйте временную шкалу, чтобы выбрать интересующий кадр и установить идентичные начальный и конечный кадры выделения, нажав клавишу « Домой », а затем клавишу «Конец» на клавиатуре.
2. Экспортируйте рамку изображения. Выберите выходной формат JPEG и нажмите OK.
3. Откройте приложение ImageJ и загрузите изображения, сохраненные на предыдущем шаге. Начните с установки необходимых измерений, нажав кнопку Analyze > Set Measurements и установив флажки Площадь, Периметр и Подгонка эллипса. Нажмите кнопку ОК.
4. Затем преобразуйте изображение в оттенки серого, выбрав «Изображение» > «Введите > 8 бит».
5. Затем преобразуйте изображение в двоичное изображение с помощью Image > Adjust > Thresholding. В диалоговом окне «Пороговое значение» при необходимости отрегулируйте два ползунка. Нажмите кнопку Применить , а затем закройте диалоговое окно Пороговое значение.
6. Выберите Analyze > Tools > ROI Manager. В Диспетчере ROI установите флажок Показать все. Не закрывайте эту коробку.
7. Выберите инструмент «Палочка (трассировка)», выберите соответствующую ячейку на изображении и нажмите клавишу T на клавиатуре. Выбранная ячейка будет пронумерована. Новая ячейка может быть выбрана снова. Выберите все подходящие ячейки для измерения. Соответствующие клетки идентифицируются как те, которые изолированы от других клеток. Количество этих ячеек может варьироваться от 50 до 200 в одном поле зрения.
8. Вернитесь в поле ROI Manager и нажмите Измерить. Откроется окно Результаты. Столбцы, помеченные как Major и Minor, представляют собой длину большой и малой осей эллипса (в пикселях) соответственно. Выберите « Файл» > «Сохранить как », чтобы экспортировать измерения в виде файла в формате CSV.
9. Используя любое подходящее программное обеспечение для вычислительного анализа, вычислите частное от мажорного и минорного.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При загрузке клеточной суспензии в микрофлюидный канал наблюдалось относительно равномерное распределение клеток. При выходе сигнала (например, простой синусоиды или фазы ASK) от генератора функций тонкопленочные межцифровые электроды создавали неоднородное электрическое поле перем...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модуляция ASK OOK синусоиды, индуцирующей силу DEP, может быть использована для испытания механической усталости эритроцитов в течение длительного периода времени. В этом протоколе мы ограничили испытание на усталость in vitro 1 часом, чтобы предотвратить потенциальное неблагоприятное метаб?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"