Electrodeformación de amplitud modulada para evaluar la fatiga mecánica de células biológicas

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para las pruebas de fatiga mecánica en el caso de glóbulos rojos humanos utilizando un enfoque de electrodeformación de amplitud modulada. Este enfoque general se puede utilizar para medir los cambios sistemáticos en las características morfológicas y biomecánicas de las células biológicas en una suspensión de deformación cíclica.

Resumen

Los glóbulos rojos (RBC) son conocidos por su notable deformabilidad. Sufren repetidamente una deformación considerable al pasar a través de la microcirculación. La deformabilidad reducida se observa en los glóbulos rojos fisiológicamente envejecidos. Las técnicas existentes para medir la deformabilidad celular no se pueden utilizar fácilmente para medir la fatiga, la degradación gradual de las membranas celulares causada por cargas cíclicas. Presentamos un protocolo para evaluar la degradación mecánica en glóbulos rojos a partir de esfuerzos cortantes cíclicos utilizando electrodeformación basada en modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) en un canal microfluídico. Brevemente, los electrodos interdigitados en el canal microfluídico se excitan con una corriente alterna de bajo voltaje a frecuencias de radio utilizando un generador de señales. Los glóbulos rojos en suspensión responden al campo eléctrico y exhiben dielectroforesis positiva (DEP), que mueve las células a los bordes del electrodo. Luego, las celdas se estiran debido a las fuerzas eléctricas ejercidas sobre las dos mitades de la celda, lo que resulta en un estiramiento uniaxial, conocido como electrodeformación. El nivel de esfuerzo cortante y la deformación resultante se pueden ajustar fácilmente cambiando la amplitud de la onda de excitación. Esto permite cuantificar la deformabilidad no lineal de los glóbulos rojos en respuesta a deformaciones pequeñas y grandes con un alto rendimiento. La modificación de la onda de excitación con la estrategia ASK induce electrodeformación cíclica con velocidades y frecuencias de carga programables. Esto proporciona una forma conveniente para la caracterización de la fatiga de los glóbulos rojos. Nuestro enfoque de electrodeformación modulada por ASK permite, por primera vez, una medición directa de la fatiga de los glóbulos rojos a partir de cargas cíclicas. Se puede utilizar como una herramienta para pruebas biomecánicas generales, para análisis de deformabilidad celular y fatiga en otros tipos de células y condiciones enfermas, y también se puede combinar con estrategias para controlar el microambiente de las células, como la tensión de oxígeno y las señales biológicas y químicas.

Introducción

Los glóbulos rojos (RBC) son las células más deformables^{del cuerpo humano}. Su deformabilidad está directamente relacionada con su funcionalidad de transporte de oxígeno. Se ha encontrado que la deformabilidad reducida en los glóbulos rojos se correlaciona con la patogénesis de varios trastornos de los glóbulos rojos². Las mediciones de deformabilidad nos han llevado a una mejor comprensión de las enfermedades relacionadas con los glóbulos rojos³. La vida útil normal de los glóbulos rojos puede variar de 70 a 140 días⁴. Por lo tanto, es importante medir cómo disminuye su def....

Protocolo

La sangre entera humana no identificada se obtuvo comercialmente. El trabajo con las muestras de sangre se realizó en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Atlántica de Florida.

1. Preparación del dispositivo microfluídico

1. Pega con cinta adhesiva la oblea maestra de silicio SU-8 para el diseño del canal microfluídico en el interior de una placa de Petri de plástico de 14 cm y límpiala con gas N₂ .
2. Pesar 60 g de base de polidimetilsiloxano (PDMS) y 6 g de agente de curado PDMS en un vaso de papel. ....

Discusión

La modulación ASK OOK de una onda sinusoidal inductora de fuerza DEP se puede utilizar para probar la fatiga mecánica de los glóbulos rojos durante un largo período de tiempo. En este protocolo, limitamos las pruebas de fatiga in vitro a 1 hora para prevenir los posibles efectos metabólicos adversos sobre la deformabilidad celular. Se pueden programar condiciones completas de prueba de fatiga utilizando la técnica de electrodeformación modulada por ASK. Se pueden programar parámetros como la frecuencia de carga, .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"