Electrodeformación de amplitud modulada para evaluar la fatiga mecánica de células biológicas

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para las pruebas de fatiga mecánica en el caso de glóbulos rojos humanos utilizando un enfoque de electrodeformación de amplitud modulada. Este enfoque general se puede utilizar para medir los cambios sistemáticos en las características morfológicas y biomecánicas de las células biológicas en una suspensión de deformación cíclica.

Resumen

Los glóbulos rojos (RBC) son conocidos por su notable deformabilidad. Sufren repetidamente una deformación considerable al pasar a través de la microcirculación. La deformabilidad reducida se observa en los glóbulos rojos fisiológicamente envejecidos. Las técnicas existentes para medir la deformabilidad celular no se pueden utilizar fácilmente para medir la fatiga, la degradación gradual de las membranas celulares causada por cargas cíclicas. Presentamos un protocolo para evaluar la degradación mecánica en glóbulos rojos a partir de esfuerzos cortantes cíclicos utilizando electrodeformación basada en modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) en un canal microfluídico. Brevemente, los electrodos interdigitados en el canal microfluídico se excitan con una corriente alterna de bajo voltaje a frecuencias de radio utilizando un generador de señales. Los glóbulos rojos en suspensión responden al campo eléctrico y exhiben dielectroforesis positiva (DEP), que mueve las células a los bordes del electrodo. Luego, las celdas se estiran debido a las fuerzas eléctricas ejercidas sobre las dos mitades de la celda, lo que resulta en un estiramiento uniaxial, conocido como electrodeformación. El nivel de esfuerzo cortante y la deformación resultante se pueden ajustar fácilmente cambiando la amplitud de la onda de excitación. Esto permite cuantificar la deformabilidad no lineal de los glóbulos rojos en respuesta a deformaciones pequeñas y grandes con un alto rendimiento. La modificación de la onda de excitación con la estrategia ASK induce electrodeformación cíclica con velocidades y frecuencias de carga programables. Esto proporciona una forma conveniente para la caracterización de la fatiga de los glóbulos rojos. Nuestro enfoque de electrodeformación modulada por ASK permite, por primera vez, una medición directa de la fatiga de los glóbulos rojos a partir de cargas cíclicas. Se puede utilizar como una herramienta para pruebas biomecánicas generales, para análisis de deformabilidad celular y fatiga en otros tipos de células y condiciones enfermas, y también se puede combinar con estrategias para controlar el microambiente de las células, como la tensión de oxígeno y las señales biológicas y químicas.

Introducción

Los glóbulos rojos (RBC) son las células más deformables^{del cuerpo humano}. Su deformabilidad está directamente relacionada con su funcionalidad de transporte de oxígeno. Se ha encontrado que la deformabilidad reducida en los glóbulos rojos se correlaciona con la patogénesis de varios trastornos de los glóbulos rojos². Las mediciones de deformabilidad nos han llevado a una mejor comprensión de las enfermedades relacionadas con los glóbulos rojos³. La vida útil normal de los glóbulos rojos puede variar de 70 a 140 días⁴. Por lo tanto, es importante medir cómo disminuye su deformabilidad junto con el proceso de envejecimiento, por ejemplo, su comportamiento a fatiga debido a los esfuerzos de cizallamiento cíclico³.

La medición de la deformabilidad de los glóbulos rojos con un alto rendimiento es un desafío debido a las fuerzas de escala de piconewton (~ ^10-12 N) que se aplican a las celdas individuales. Durante la última década, se han desarrollado muchas tecnologías para medir la deformabilidad celular⁵. Las mediciones de deformación de los glóbulos rojos a nivel de una sola célula se pueden realizar mediante aspiración con pipeta y pinzas ópticas, mientras que los análisis a granel se realizan mediante ektacitometría de gradiente osmótico. Los análisis de ektacitometría proporcionan una gran cantidad de datos, lo que brinda la oportunidad de diagnosticar trastornos sanguíneos ^6,7. La deformabilidad de los glóbulos rojos también se puede analizar utilizando la teoría viscoelástica mediante microscopía de fuerza atómica de sonda coloidal. En este método, se aplica el análisis computacional para estimar el módulo elástico de los glóbulos rojos, considerando tanto las respuestas dependientes del tiempo como las de estado estacionario. La deformabilidad de los glóbulos rojos individuales se puede medir utilizando el método de matriz de microcámaras de una sola célula. Este método analiza cada célula a través de la membrana y los marcadores fluorescentes citosólicos para proporcionar información sobre la deformabilidad de los glóbulos rojos y la distribución de las características celulares en poblaciones complejas de glóbulos rojos para detectar trastornos hematológicos⁸.

La fatiga es un factor clave en la degradación de las propiedades de los materiales de ingeniería y los biomateriales. Las pruebas de fatiga permiten un análisis cuantitativo de la integridad y longevidad de una estructura sometida a cargas cíclicas. El análisis de la fatiga en las células biológicas se ha visto obstaculizado durante mucho tiempo por la falta de un método general, fácilmente aplicable, de alto rendimiento y cuantitativo para la implementación de la deformación cíclica en las membranas celulares. Esto es posible con la utilización de técnicas de modulación de señales eléctricas y electrodeformación implementadas en un entorno microfluídico. La técnica de modulación por desplazamiento de amplitud (ASK) como modulación digital se aplica a través de la modulación de modulación On-Off (OOK) en este artículo. El concepto de modulación se refiere a la transmisión de señales digitales a través del canal, que requiere una señal portadora de onda sinusoidal para funcionar⁹. Los tiempos de encendido y apagado se pueden igualar. Bajo la codificación ON, los glóbulos rojos entran en un estado deformado mientras se exponen a una fuerza de electrodeformación externa (F_dep)¹⁰ creada por el campo eléctrico no uniforme. Bajo el OFF-keying, los glóbulos rojos están en su estado relajado. Observamos la fatiga de los glóbulos rojos, es decir, una degradación progresiva de su capacidad de estiramiento con el aumento de los ciclos de carga. La pérdida de deformabilidad inducida por la fatiga en los glóbulos rojos puede proporcionar información sobre el daño acumulado en la membrana durante la circulación sanguínea, lo que nos permite investigar más a fondo las conexiones entre la fatiga celular y los estados de enfermedad.

Aquí proporcionamos procedimientos paso a paso sobre cómo se implementan las pruebas de fatiga de los glóbulos rojos en un dispositivo microfluídico a través de la electrodeformación modulada por ASK y la configuración del sistema, como el dispositivo microfluídico, la carga mecánica y la obtención de imágenes microscópicas para la caracterización de la degradación gradual en la deformabilidad mecánica de los glóbulos rojos.

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Protocolo

La sangre entera humana no identificada se obtuvo comercialmente. El trabajo con las muestras de sangre se realizó en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Atlántica de Florida.

1. Preparación del dispositivo microfluídico

1. Pega con cinta adhesiva la oblea maestra de silicio SU-8 para el diseño del canal microfluídico en el interior de una placa de Petri de plástico de 14 cm y límpiala con gas N₂ .
2. Pesar 60 g de base de polidimetilsiloxano (PDMS) y 6 g de agente de curado PDMS en un vaso de papel. Mezcle las dos partes con una espátula de madera hasta que la mezcla tenga un color blanco turbio.
3. Vierta la mezcla de PDMS en la placa de Petri de plástico que contiene la oblea de silicio. Coloque la placa de Petri en un desecador al vacío con una llave de paso de 3 vías. Gire la válvula de la llave de paso para conectar el vacío a la cámara del desecador para eliminar las burbujas de aire del PDMS.
4. Vuelva a introducir aire en la cámara del desecador ajustando la válvula de llave de paso para conectar la cámara del desecador al ambiente en ciclos de aproximadamente 5 minutos. Repita hasta que se eliminen todas las burbujas de aire de las características de los canales.
5. Coloque la placa de Petri dentro de un horno a 70 °C durante 4 h. Una vez transcurrido el tiempo, retire la placa de Petri, deje que se enfríe a temperatura ambiente y colóquela sobre un tapete de corte.
6. Con un bisturí, corte la parte del PDMS que está por encima de la oblea de silicona. Coloque el PDMS recortado entre las dos hojas de película de envoltura de laboratorio. El espacio formado entre la hendidura del microcanal y la película semitransparente facilita la identificación de la ubicación del canal microfluídico, así como su respectiva entrada y salida.
7. Con una cuchilla de afeitar, corte un canal individual del PDMS grande. Perfore un orificio de entrada de 3 mm y un orificio de salida de 1,5 mm con punzones de biopsia correspondientes a los dos tamaños (Figura 1A).
8. Coloque el canal perforado, con el lado del canal hacia arriba, en un portaobjetos de vidrio limpio. Coloque un sustrato de vidrio de 20 mm x 15 mm que contenga electrodos interdigitados de óxido de indio y estaño (ITO) de película delgada en el mismo portaobjetos de vidrio con los electrodos hacia arriba.
9. Coloque suavemente el portaobjetos de vidrio con PDMS y sustrato en un limpiador de plasma. Cierre la válvula de gas, encienda el interruptor de la bomba y espere 2 minutos para obtener una lectura del sensor de 600 a 800 mTorr.
10. Encienda el interruptor de encendido y espere 30 segundos. Gire la perilla de alimentación de RF de baja a alta y espere 1 minuto.
11. Luego, invierta la secuencia girando la perilla de RF a la posición baja, el interruptor de encendido a OFF, el interruptor de la bomba a OFF y abriendo la válvula de gas.
12. Inmediatamente después de abrir la cámara del limpiador de plasma, levante y gire el PDMS de modo que el lado del canal quede hacia abajo (180°). Coloque el canal en la parte superior del sustrato ITO. El proceso de vinculación ha comenzado.
13. Con unas pinzas, presione suavemente las esquinas del PDMS durante unos 3 s. Evite presionar sobre el canal en sí.
    NOTA: El proceso de unión ocurre espontáneamente al entrar en contacto físico entre las dos superficies tratadas.
14. Cargue el medio de cebado en una jeringa de 1 ml con una aguja de 23 G. Humedece con cuidado el canal insertando la aguja directamente en el pocillo de entrada y luego soltando el medio. Opere lentamente. No introduzca burbujas de aire. Incubar durante al menos 3 min.
15. Retire el medio primario con una punta de pipeta de 10 μL. Lave el canal con medio DEP 3 veces insertando el medio DEP en el canal. Mantenga el canal húmedo en todo momento.

2. Accesorio de prueba

NOTA: El accesorio de prueba está diseñado con software CAD 3D e incluye una unidad de carcasa base y una unidad superior (Figura 1B). Luego, se fabrica utilizando una fresadora CNC de 3 ejes con un límite de tolerancia estándar de alrededor de ± dimensión de 0.005 pulgadas del accesorio de prueba se verifica con un calibrador electrónico (no se muestra). No se requiere esterilidad del accesorio para las pruebas biomecánicas in vitro.

1. Cables de soldadura previa en los extremos de la copa de soldadura de dos juegos de conectores de pistón de resorte.
2. Inserte los conectores del pistón de resorte en la unidad superior y cree una unión permanente agregando una gota de pegamento epoxi.

3. Preparación del tampón de trabajo de electrodeformación

1. Para preparar el medio DEP, pesar 12,75 g de sacarosa y 0,45 g de dextrosa con una báscula.
2. Disuelva ambos polvos en un solo recipiente con 150 ml de agua desionizada (DI) y 3,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Con un probador de conductividad de rango bajo, mida la conductividad y asegúrese de que sea de 0,04 S/m (Figura 2).
   NOTA: Se puede utilizar un valor de conductividad diferente, lo que podría cambiar el signo y la magnitud de la fuerza DEP resultante¹¹. La electrodeformación, sin embargo, requiere una fuerza DEP positiva.
4. Con un osmómetro, confirme que la osmolaridad está dentro del rango normal del plasma sanguíneo, de 275 a 295 mOsm/kg de agua (Figura 3). Conservar a 4 °C. El medio DEP ya está preparado.
5. En un tubo de 15 ml, disolver 0,5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 10 ml del medio DEP. Homogeneizar. El medio principal del dispositivo ya está preparado.

4. Preparación de la suspensión celular

1. Lavar 20 μL de sangre entera centrifugando la sangre con 1 mL de PBS a 268 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante.
2. Vuelva a suspender los glóbulos rojos en 1 ml de PBS. Pipetear suavemente para mezclar. Lavar los glóbulos rojos durante 3 min a 268 x g y desechar el sobrenadante.
3. Extraiga 5 μl de gránulo de glóbulos rojos con una punta de micropipeta de 10 μl y dispense completamente en 1 ml del medio DEP. Lavar las células centrifugando a 268 x g durante 3 min.
4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los glóbulos rojos en 1 mL de medio DEP. Pipetear suavemente para mezclar.
5. Lavar los glóbulos rojos durante 3 min a 268 x g y desechar el sobrenadante. Pipetear 2 μL de gránulo de RBC en 500 μL de medio DEP. La suspensión celular se prepara ahora con una concentración dentro de un rango de 62 - 104 células/μL¹², que puede confirmarse utilizando un portaobjetos de recuento celular estándar.

5. Configuración de electrodeformación y pruebas de fatiga

1. Coloque el dispositivo microfluídico en la parte inferior del dispositivo de prueba. Alinee la parte superior del accesorio con el dispositivo y ensamble las dos partes con dos juegos de tornillos y tuercas de nailon (Figura 4).
2. Coloque el dispositivo de prueba en la platina del microscopio. Localice un conjunto deseado de electrodos bajo el microscopio.
3. Conecte el par correspondiente de cables de electrodos que coincidan con el conjunto de electrodos ubicado al terminal de salida del generador de funciones (Figura 4).
4. Retire 5 μL del medio DEP de la entrada de 3 mm del canal microfluídico. Cargue lentamente 5 μL de la suspensión celular en la entrada con una punta de pipeta de 10 μL.
5. Deje que las células se asienten durante 1 minuto. Si es necesario, agregue un medio DEP adicional a la entrada para empujar las celdas hacia el canal.
6. Observe el canal con un aumento de 20x. Utilice un filtro de paso de banda de 414/46 nm para mejorar el contraste de las imágenes.
7. Presione el botón Sinusoidal y defina una onda sinusoidal con una amplitud_RMS de 2 V a una frecuencia de 3 MHz. Presione el botón Mod para habilitar la modulación. Cambie el modo de onda a ASK pulsando la opción Tipo .
8. Ajuste la frecuencia de modulación a 250 mHz, que corresponde a un período de carga-descarga de 4 s (Figura 5A). Encienda la salida del generador de funciones.
9. Graba un vídeo de 1 minuto cada 10 minutos a 30 fotogramas por segundo (fps).

6. Caracterización de la deformación de los glóbulos rojos

1. Usando una aplicación de edición de video, abra archivos .avi grabados en el paso anterior presionando Ctrl + O. Utilice la línea de tiempo para elegir un fotograma de interés y establezca los fotogramas inicial y final de la selección para que sean idénticos pulsando la tecla Inicio y, a continuación, la tecla Fin del teclado.
2. Exporte el marco de la imagen. Seleccione el formato de salida que será JPEG y presione OK.
3. Abra la aplicación ImageJ y cargue las imágenes guardadas en el paso anterior. Comience por establecer las medidas necesarias pulsando Analizar > Establecer medidas y asegurándose de que las casillas de verificación de Área, Perímetro y Elipse de ajuste estén marcadas. Presione OK.
4. A continuación, convierta la imagen a escala de grises eligiendo Imagen > Tipo > 8 bits.
5. A continuación, convierta la imagen a binaria utilizando Imagen > Ajustar > Umbral. En el cuadro de diálogo Umbral, ajuste los dos controles deslizantes según sea necesario. Presione Aplicar y, a continuación, cierre el cuadro de diálogo Umbral.
6. Elija Analizar > herramientas > Administrador de ROI. En el Administrador de ROI, presione la casilla de verificación Mostrar todo. No cierre esta casilla.
7. Seleccione la herramienta Varita (calco), seleccione una celda aplicable en la imagen y presione T en el teclado. La celda seleccionada estará numerada. Se puede volver a seleccionar una nueva celda. Seleccione todas las celdas aplicables que se van a medir. Las células aplicables se identifican como aquellas que están aisladas de otras células. El número de estas células podría oscilar entre 50 y 200 en un solo campo de visión.
8. Regrese al cuadro Administrador de ROI y presione Medir. Se abrirá el cuadro Resultados. Las columnas etiquetadas como Mayor y Menor son las longitudes de los ejes mayor y menor de la elipse ajustada (en píxeles), respectivamente. Elija Archivo > Guardar como para exportar las medidas como un archivo con formato CSV.
9. Utilizando cualquier software de análisis computacional adecuado, calcule el cociente de Mayor y Menor.

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Resultados

Cuando la suspensión celular se cargó en el canal microfluídico, se observó una distribución relativamente uniforme de las células. Tras la salida de la señal (por ejemplo, una onda sinusoidal simple o una fase de enclave de ASK) del generador de funciones, los electrodos interdigitados de película delgada generaron un campo eléctrico de corriente alterna no uniforme. Las células suspendidas respondieron espontáneamente a esta excitación eléctrica y exhibieron un comportamiento DEP positivo, es decir, se mov...

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Discusión

La modulación ASK OOK de una onda sinusoidal inductora de fuerza DEP se puede utilizar para probar la fatiga mecánica de los glóbulos rojos durante un largo período de tiempo. En este protocolo, limitamos las pruebas de fatiga in vitro a 1 hora para prevenir los posibles efectos metabólicos adversos sobre la deformabilidad celular. Se pueden programar condiciones completas de prueba de fatiga utilizando la técnica de electrodeformación modulada por ASK. Se pueden programar parámetros como la frecuencia de carga, ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balance Scale	ViBRA	HT-224R
Bandpass filter	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm and 3 mm diameter
Blunt needle, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumin	RMBIO	BSA-BSH
Centrifuge	SCILOGEX	911015119999
Conical Tube, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
EC Low Conductivity meter	ecoTestr	358/03
Eppendorf   Snap-Cap MicrocentrifugeTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Graph plotting
Function Generator	SIGLENT	SDG830
Glass/ITO Electrode Substrate	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted Microscope	OLYMPUS	IX81 - SN9E07015
Lab Oven	QUINCY LAB (QL)	MODEL 30GCE	Digital Model
Matlab	MathWorks		Graph plotting
Micro Osmometer - Model 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N: 03050397P
Parafilm Laboratory Wrapping Film	Fisher Scientific	13-374-12
Petri dish	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Plasma Cleaner	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		CAD software
Sucrose	Fisher Scientific	50-188-2419
Vacuum Desiccator	SPBEL-ART	F42400-2121
Wooden spatula	Fisher Scientific	NC0304136	Tongue Depressors Wood NS 6"