التقاط التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة بويضة الفأر عبر المقاييس المكانية

Summary

يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق التأثير المادي للهيكل الخلوي على الشكل النووي والعضيات الداخلية الخالية من الغشاء في نظام بويضات الفأر. يمكن تكييف الإطار للاستخدام في أنواع الخلايا والسياقات الأخرى.

Abstract

يتمثل أحد التحديات الرئيسية في فهم أسباب العقم عند النساء في توضيح الآليات التي تحكم تطور الخلايا الجرثومية الأنثوية ، والتي تسمى البويضات. يتميز تطورها بنمو الخلايا والانقسامات اللاحقة ، وهما مرحلتان حرجتان تعدان البويضة للاندماج مع المنوية لبدء التطور الجنيني. أثناء النمو ، تعيد البويضات تنظيم السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية ، وهو حدث ينبئ بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية. في بويضات الفأر ، تبين أن إعادة التنظيم السيتوبلازمي هذه مدفوعة بالهيكل الخلوي ، الذي يولد نشاطه قوى ميكانيكية تثير النواة وتعيد وضعها وتخترقها. وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي النووية المعروفة باسم المكثفات الجزيئية الحيوية. يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق تأثير الهيكل الخلوي على النواة عبر المقاييس المكانية في بويضات الفأر ، بدقة زمنية عالية. يفصل خطوات التصوير وتحليل الصور والأدوات اللازمة لتقييم أ) نشاط الهيكل الخلوي في سيتوبلازم البويضة ، ب) التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة البويضة ، و ج) تأثيراته على ديناميكيات المكثفات الجزيئية الحيوية في نوكليوبلازم البويضة. بالإضافة إلى بيولوجيا البويضات ، يمكن تكييف الطرق الموضحة هنا لاستخدامها في الخلايا الجسدية لمعالجة الضبط القائم على الهيكل الخلوي للديناميكيات النووية عبر المقاييس.

Introduction

تحديد المواقع النووية ضروري للوظائف الخلوية والتنموية^{المتعددة 1،2،3،4،5}. تعيد الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات المسماة البويضات تشكيل السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية على الرغم من خضوعها لتقسيم غير متماثل في الحجم ، والذي يعتمد على الكروموسوم اللاحق خارج المركز⁶ (الشكل 1). يتنبأ هذا التمركز للنواة بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر ^7,8 ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية (الشكل 1).

إعادة تشكيل السيتوبلازم في بويضات الفئران مدفوعة بشكل أساسي بالهيكل الخلوي للأكتوميوسين⁹ (الشكل 2). يولد نشاطها قوى ميكانيكية تثير النواة¹⁰ وتعيد وضعها وتخترقها (الشكل 2). وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية هذا يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي المرسال المسمى البقع النووية¹¹ ، وهي واحدة من عدة عضيات عديمة الغشاء في النواة تعرف باسم المكثفات الجزيئية الحيوية^{12،13،14،15،16} (الشكل 2).

كان التصوير الحي حاسما في فك رموز الآثار الوظيفية للتحريض النووي. ساهمت أفلام الهجرة النووية على مدار ساعات ، وكذلك أفلام الدقة الزمنية العالية لشبكة الأكتين والسيتوبلازم السائب ، إلى حد كبير في وضع نموذج نظري لتحديد المواقع النووية ، يربط بين جداول زمنية مختلفة⁹. أيضا ، أبرزت الأفلام ذات الدقة الزمنية العالية للسيتوبلازم والمخطط النووي والمكونات النووية مثل الكروماتين والمكثفات النووية دور التحريض القائم على الهيكل الخلوي للنواة على معالجة الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني في بويضات الفئران ، وسد المقاييس الزمانية المكانية المختلفة داخل الخلية^10،11. وإجمالا، قدم هذا النهج العابر للمقياس القائم على التصوير الحي الأساس المنطقي الأول الذي يربط التحريض الخلوي الهيكلي للنواة بالنجاح التنموي للبويضات.

يوفر البروتوكول خط أنابيب التصوير وتحليل الصور المستخدم لدراسة انتقال القوى السيتوبلازمية (الناتجة بشكل أساسي عن F-actin وجزئيا عن طريق الأنابيب الدقيقة) إلى النواة ومكوناتها الداخلية في بويضات الفئران. نتيجة هذه التجارب هي التقاط سلسلة متصلة من القوى عبر المقاييس المكانية ، من الهيكل الخلوي في السيتوبلازم إلى الداخل النووي عبر أفلام عالية الدقة الزمنية كما هو موضح في دراستين حديثتين^10،11 ، والتي أثبتت العلاقة بين الحركات النشطة السيتوبلازمية ، وتقلبات المخطط النووي ، وكذلك الحركة والتقلبات السطحية لنوع واحد من المكثفات الجزيئية الحيوية النووية: بقع نووية. يمكن تطبيق نفس النهج على أنظمة نموذجية أخرى حيث من المتوقع أن تتغير القوى السيتوبلازمية ، كما هو الحال في سياق الخلايا السرطانية^{الخبيثة 17}.

Protocol

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية للجماعة الأوروبية وتمت الموافقة عليها من قبل وزارة الزراعة الفرنسية (الترخيص رقم 75-1170) ومن قبل المديرية العامة للبحوث والابتكار (DGRI; رقم اتفاقية الكائنات المعدلة وراثيا DUO-5291). تم إيواء الفئران في منشأة في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع درجة حرارة محيطة من 22-24 درجة مئوية ورطوبة 40٪ -50٪. تشمل الفئران المستخدمة هنا إناث OF1 (Oncins France 1 ، من 8 إلى 12 أسبوعا) وإناث C57BL / 6 (من 10 إلى 14 أسبوعا).

1. جمع البويضات وإعدادها

1. جمع البويضات من الفئران البالغة من العمر 8 إلى 14 أسبوعا كما هو موضح في¹⁸ و¹⁹.
   1. باختصار ، قم أولا باستخراج المبايض من الفئران كما هو الحال في¹⁸ إلى وسط M2 + Bovine Serum Albumin (BSA) قبل التسخين (37 درجة مئوية) مع 1 ميكرومتر ميلرينون¹⁹ ، مما يمنع استئناف الانقسام الاختزالي في البويضات.
   2. ثقب بصيلات المبيض بالإبر الجراحية لإطلاق البويضات النامية من بصيلات الغار (نهاية نمو البويضة²⁰).
   3. اجمع البويضات بالحجم اللازم للتجارب (البويضات النامية و / أو كاملة النمو) باستخدام ماصة دقيقة متخصصة في جمع البويضات ، قبل غسلها ونقلها إلى أطباق ذات وسط طازج تحت الزيت المعدني.
2. فصل البويضات ميكانيكيا عن الخلايا الجريبية الغارية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وتركها لتستقر لمدة 1 ساعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية قبل الشروع في الخطوات التجريبية اللاحقة.
   ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالبويضات عند 37 درجة مئوية خلال جميع الخطوات التجريبية. لهذا البروتوكول ، تم جمع أكبر البويضات ، وهي الخلايا كاملة النمو.

2. الحقن المجهري للبويضات

ملاحظة: لالتقاط النشاط القائم على الهيكل الخلوي في السيتوبلازم ، يتم استخدام التصوير الحي برايتفيلد. وبالتالي فإن الحقن المجهري لعلامات الفلورسنت ليس ضروريا ، ويمكن استئناف البروتوكول في الخطوة 3. لتصوير المخطط النووي ، تم استخدام رانجو ، وهو مسبار يعرض علامة YFP في محطته N وعلامة CFP في المحطة C^21,22. عند تصويرها في البويضات عند 488 نانومتر ، فإنها تسمي النواة بأكملها ، باستثناء النواة²³ ، وتعرض مخططا نوويا حادا للغاية. لتصور البقع النووية ، تم استخدام SRSF2-GFP (NM_011358) ، وهي علامة للبقع النووية¹¹. يتم استخدام نفس الوسط لجمع البويضات ، والحقن المجهري ، وترجمة الحمض النووي الريبي التكميلي ، وتصوير الخلايا الحية.

1. خطي بلازميد رانجو مع بلازميد SfiI أو SRSF2-GFP مع إنزيمات تقييد AgeI.
2. توليف الحمض النووي الريبي المجاني المغطى (cRNA) مع مجموعة النسخ المناسبة في المختبر وفقا للمروج (T3 ل Rango و T7 ل SRSF2-GFP) وتنقيتها باستخدام مجموعة تنقية العمود ، كما هو موضح سابقا²⁴.
   ملاحظة: بولي أدينيلات SRSF2-GFP RNA باستخدام مجموعة polyadenylation لزيادة استقرار cRNA. يتم استخدام اثنين من المروجين المختلفين بسبب الاختلافات في العمود الفقري البلازميد.
3. قياس تركيزات cRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume.
4. تمييع رانجو cRNA إلى 1000 نانوغرام / ميكرولتر و SRSF2-GFP cRNA إلى 600 نانوغرام / ميكرولتر في dH₂O.
5. قسامة cRNA للطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل عند 25000 × جم قبل الحقن المجهري.
6. حقن ترميز cRNAs ل YFP-Rango أو SRSF2-GFP كما هو موضح في^11،25 في سيتوبلازم البويضات في وسط 37 °C M2 + BSA + Milrinone باستخدام حاقن دقيق.
7. احتضان البويضات لمدة 2 ساعة على الأقل في وسط الاستزراع عند 37 درجة مئوية لترجمة cRNA.
8. قم بإيداع البويضات في قطرات متوسطة صغيرة (5 ميكرولتر) على طبق زراعة الأنسجة 35 مم مع قاع زجاجي مغطى بالزيت المعدني. ضع بويضة واحدة لكل قطرة لتجنب التبييض الضوئي للبويضات المجاورة.

3. تصوير الخلايا الحية

ملاحظة: تم فحص بويضات الفئران الحية باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مزود بهدف غمر الزيت Plan- APO 40x / 1.25 NA ، وسطح مسح آلي ، وغرفة حضانة (37 درجة مئوية) ، وكاميرا CCD مقترنة بعجلة مرشح ، وقرص دوار. يتم الحصول على صور عالية الدقة الزمنية باستخدام Metamorph (المشار إليه فيما يلي باسم برنامج التصوير) في وضع اكتساب الدفق.

1. افتح نافذة الحصول على برنامج التصوير.
2. اضبط وقت التعرض على 500 مللي ثانية ، ومنطقة الكاميرا على الشريحة الكاملة والتجميع على 1.
3. في علامة التبويب اكتساب ، قم بتعيين الإضاءة للقناة المطلوبة. لتصوير النشاط السيتوبلازمي ، قم بإلقاء الضوء على البويضات بالضوء المنقول. لتصوير النواة الموسومة ب YFP-Rango أو SRSF2-GFP ، قم بإضاءة البويضات بطول موجة إثارة يبلغ 491 نانومتر.
4. بالنسبة للتقليب السيتوبلازمي أو تجارب YFP-Rango ، ركز على نواة البويضة التي يمكن ملاحظتها بسهولة بالضوء المرسل (الشكل 3 أ). سيتم الحصول على طائرة واحدة. بالنسبة لتجارب البقع النووية ، ركز على قطرات SRSF2-GFP (الشكل 3C).
5. في علامة التبويب خاص ، قم بتعيين المعلمات لتحسين سرعة الاستحواذ على النحو التالي.
   غالق الكاميرا: مفتوح للتعريض الضوئي
   وضع المسح: مسح التبعية
6. افتح نافذة الحصول على الدفق لبرنامج التصوير. اضبط معلمات البث وفقا للتجربة. لكلتا الدراستين^10,11 ، استخدم المعلمات الموضحة أدناه.
   1. في علامة التبويب اكتساب ، قم بتعيين المعلمات التالية.
      وضع الاستحواذ: دفق إلى ذاكرة الوصول العشوائي
      عدد الإطارات: 480 (يمكن تخفيضها إلى 240 إطارا لتقليل وقت التصوير)
      معلمات الكاميرا: التقاط الصور بمعدل الإطارات
      عدد الإطارات المراد تخطيها: 0
   2. في علامة التبويب معلمات وحدة تحكم الكاميرا الرقمية ، قم بتعيين المعلمات التالية.
      حالة الكاميرا: HALT
      وضع الغالق: فتح أبدا
      وضع المسح: مسح التبعية
      ملحوظة عدد الإطارات إلى المتوسط: 1
      ملاحظة 1: في وضع البث، بمجرد ضبط وقت التعريض الضوئي، يتم تحديد مدة الفيلم حسب عدد الإطارات. على سبيل المثال ، يولد وقت التعرض 500 مللي ثانية و 480 إطارا فيلما مدته 4 دقائق. يمكن عرض معاينة أثناء الحصول على الصورة.
7. اضبط منطقة الاهتمام (ROI) حول الكائن. يقلل تقليل مساحة عائد الاستثمار من وقت الاستحواذ.
8. انقر فوق اكتساب في نافذة اكتساب البث لبدء تشغيل الفيلم.
9. احفظ الفيلم كملف .tif في نهاية الاستحواذ.
   ملاحظة: لمتابعة الهياكل النووية أثناء الأفلام عالية الدقة الزمنية ، يجب أن تحتوي المسابر النووية (YFP-Rango و SRSF2-GFP) على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية لتسهيل تجزئة الأجسام أثناء الخطوات الإضافية لتحليل الصور. يجب أن تكون ملامح تعبير SRSF2-GFP الخارجية قابلة للمقارنة مع الصبغات المناعية للبقع النووية الداخلية (الشكل 3C-D). قد تعكس التغييرات في ملامح تعبير SRSF2-GFP بالنسبة للتلطيخ الداخلي جرعات عالية من حقن cRNA والترجمة²⁶ (الشكل 3C-D).

4. تحليل الصورة: التحريك السيتوبلازمي

ملاحظة: يتم تحديد التحريك السيتوبلازمي الذي يعكس شدة النشاط الخلوي الهيكلي القائم على الأكتين في البويضات من خلال تحليلات ارتباط الصور باستخدام برنامج من منشور سابق للمختبر⁹ ومتاح في²⁷. يقيس البرنامج مقدار كثافة البكسل المحفوظة بين الصور المتتالية. الناتج هو فقدان الارتباط بين الصور في الوقت المناسب ، بدءا من 1 ويتناقص أضعافا مضاعفة مع مرور الوقت ، كما هو الحال في⁹.

1. قم بمحاذاة صور الفاصل الزمني الأولية (Δt = 0.5 ثانية) باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg (Plugins>StackReg). لتثبيت المكون الإضافي StackReg²⁸ ، قم بتمكين موقع تحديث BIG-EPFL²⁹ للوصول إلى المكون الإضافي.
2. احسب ارتباطات صورة المجال الساطع في 3 إلى 4 مناطق سيتوبلازمية ~ 300 ميكرومتر² باتباع الخطوات أدناه.
   1. اقتصاص المناطق وحفظها كملفات أفلام منفصلة. افتح نافذة المحطة الطرفية.
   2. اكتب البويضة، واضغط على مفتاح المسافة ثم اضغط على مفتاح الإدخال Enter. تظهر نافذة تسمى الإشارة والفتحة. اختر ملفات الأفلام التي تم اقتصاصها والتي سيتم تحليلها.
      ملاحظة: يمكن اختيار عدة أفلام في نفس الوقت.
3. يقوم التطبيق بإرجاع الملفات في نفس المجلد مثل الأفلام. يتم إنشاء ثلاثة ملفات مختلفة مع امتدادات .csv و .eps و .xls. يحتوي .xls الملف على البيانات لرسم مخططات الارتباط لمنطقة واحدة. متوسط قيم الارتباط من مناطق مختلفة داخل الخلية.
4. لأغراض الوضوح البصري ، قم بتحويل قيم الارتباط النهائية عن طريق طرح قيمة كل نقطة زمنية من 1 للحصول على منحنى يشبه الأس المقلوب كما في ¹¹.

5. تحليل الصور: خرائط ناقلات السيتوبلازم

ملاحظة: تم إنشاء خرائط ناقلات السيتوبلازم لبويضات الفأر بواسطة المكون الإضافي³⁰ لتحليل ارتباط الصور الزمانية المكانية (STICS) الذي تم تنفيذه مسبقا للكشف عن التدفقات السيتوبلازمية في بويضات الفئران³¹ في فيجي ³² والمتاحة في ³³. تظهر الخرائط حجم سرعة التدفق السيتوبلازمي واتجاهه ، كما في⁹ و¹¹.

1. قم بتحويل صور الفاصل الزمني ذات المجال الساطع (Δt = 0.5 ثانية) إلى تنسيق 32 بت.
2. أعد محاذاة الصور باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg في Plugins > StackReg واختر تحويل الجسم الصلب .
3. باستخدام مكدس المكون الإضافي ، قم بطرح المتوسط المتحرك jru v2 (في أدوات Detrend لمجموعة المكونات الإضافية STICS) ، تخلص من الهياكل الثابتة في الفيلم عن طريق طرح صورة متوسط الوقت للفيلم. خانات الاختيار اطرح المتوسط الثابت والمكدس الفرعي للإخراج، وحدد الحفاظ على المتوسط المكاني واضبط الفترة على 5.
4. ارسم عائد استثمار حول البويضة ، باستثناء القشرة لتجنب التأثيرات الحدودية للمكون الإضافي.
5. قم بتشغيل المكون الإضافي STICS map jru V2 (في أدوات ICS) ، بحجم منطقة فرعية 32 بكسل ، وحجم خطوة 16 بكسل ، وإزاحة STICS الزمنية ل 3 ، وإزاحة X و Y من 0 ، ومضاعف السرعة 8 ، وعتبة الحجم 0 وخانات الاختيار الخاصة بتطبيع طول المتجه ، والمتجهات المركزية ، وسرعات الإخراج ، واستخدام قناع الفيلم.
   ملاحظة: يقوم المكون الإضافي بإنشاء خريطة للبويضة بتنسيق .tif ، وعرض التدفقات السيتوبلازمية كمتجهات بألوان تشير إلى سعة التدفق ، كما في⁹ و¹¹ ، وملف Excel بسرعات تدفق مقاسة.

6. تحليل الصورة: تقلبات المخطط النووي

ملاحظة: يمكن تحديد تقلبات المخطط النووي التي تعكس تحريض الغشاء النووي من أفلام النوى الموسومة ب YFP-Rango (الشكل 4A ، C). يتطلب تحليل الصور لتقلبات المخطط النووي فيجي وتثبيت المكونات الإضافية StackReg (تمكين موقع تحديث BIG-EPFL²⁹ للوصول إلى المكون الإضافي StackReg) و PureDenoise³⁴ و Ovocyte_nucleus. يقوم المكون الإضافي StackReg بتسجيل الصور لتصحيح الحركة العالمية المحتملة. يزيل المكون الإضافي PureDenoise ضوضاء الصور متعددة الأبعاد التي تتلفها ضوضاء Poisson-Gaussian المختلطة وينعم المخطط النووي. يقوم المكون الإضافي Ovocyte_nucleus بتعتبات الإشارة ويملأ الفتحة المقابلة للنواة من أجل إنشاء قناع نواة ثنائي ، وإعادة تنظيمه مع StackRreg وحساب المسافة r من السنترويد لقناع النواة إلى محيط القناع لجميع زوايا θ (θ ° من 0 ° إلى 360 ° بمقدار 1 ° زيادة) ، كما في الشكل 4. يمكن العثور على جميع رموز هذه المكونات الإضافية في ³⁵.

1. في فيجي ، في الإضافات > قائمة CIRB > Verlhac ، حدد شكل نواة الخلايا البيضوية.
2. في مربع الحوار، قم بإجراء التحديد التالي.
   1. حدد المجلد الذي يحتوي على الأفلام المراد تحليلها.
   2. حدد زاوية θ (يمكن اختيار قيمة من 1 درجة إلى 360 درجة وتم استخدام قيمة 1 درجة للحصول على دقة مخطط تفصيلي مثالية) ، وهوامش الاقتصاص (يوصى باستخدام 5 ميكرومتر من أجل الحفاظ على النواة بأكملها).
   3. حدد معايرة XY والفاصل الزمني. انقر فوق موافق.
      ملاحظة: يتم توفير النتائج كملفات .xls في مجلد صادر في المجلد الذي يحتوي على الأفلام الأصلية. يعرض هذا الملف كل أنصاف الأقطار المقاسة r لكل مرة t وكل زاوية θ. ويرد مثال على ملف الإخراج في الجدول التكميلي 1. يحتوي المجلد الخارجي أيضا على فيلم لقناع النواة.
3. باستخدام جدول بيانات ، احسب متوسط نصف القطر R على جميع النقاط الزمنية t لكل زاوية θ محددة. هذا يسمح برسم الشكل المتوسط بمرور الوقت (الشكل 4 ب). انظر المثال في الجدول التكميلي 2.
4. لكل t و θ اطرح متوسط نصف القطر R بمرور الوقت من نصف القطر r. التباين (r-R)² هو مقياس لتقلبات الغلاف النووي.
5. احسب متوسط التقلبات لجميع النقاط الزمنية t وجميع الزوايا θ لكل نواة وفي النهاية لجميع النوى من حالة واحدة.
   ملاحظة: عندما يتغير شكل النوى بشكل كبير كما في حالة الهيكل الخلوي المتعطل، تدور النوى الموسومة ب YFP-Rango في فيجي لتوجيه الجزء الأملس لأعلى والغزو لأسفل، قبل الشروع في تحليل تقلبات المخطط النووي، كما هو الحال في¹⁰.

7. تحليل الصور: حركات البقع النووية (ديناميات الانتشار)

ملاحظة: يسمح تحليل حركة البقع النووية باستنتاج نوع الديناميكيات (المدفوعة أو المنتشرة أو المحصورة) لتلك العضيات من مساراتها.

1. حدد صور وضع التدفق للبويضات التي تعبر عن قطرات SRSF2-GFP التي تتحرك بشكل أساسي في المحور X-Y.
2. تصحيح لتبييض صور الفاصل الزمني للبويضات التي تعبر عن SRSF2- GFP باستخدام طريقة مطابقة الرسم البياني في فيجي (الصورة > ضبط > تصحيح التبييض).
3. أعد محاذاة الصور باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg.
4. تتبع مراكز قطرات SRSF2-GFP باستخدام المكون الإضافي Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). اضغط على إضافة مسار لبدء التعقب واضغط على إنهاء المسار عند الانتهاء. لا تقم بتنشيط تصحيح التوسيط.
5. انسخ المسارات إلى ملف جدول بيانات لمتابعة حسابات متوسط الإزاحة التربيعية الزمنية (MSD) كما في ¹¹ ، واحسب MSDs الزمنية من كل مسارات قطرات 20 ثانية.
6. تناسب المنحنيات (msd (t) = beta x t^α) مع طريقة Nelder-Mead باستخدام برنامج R لتقدير أس الانتشار ألفا (α).
7. قم بقياس معامل الانتشار الفعال لتتمكن من مقارنة الظروف المختلفة حيث من المتوقع أن يكون الانتشار شاذا (α< 1).
8. احسب معامل الانتشار الفعال D_eff من ملاءمة خطية (alpha = 1) على 40 نقطة أولى (20 ثانية) من منحنى MSD الزمني وقم بالتطبيع حسب حجم القطرة (D_eff في μm² / s x 3/2 πr في μm).

8. تحليل الصورة: تقلبات سطح البقع النووية

ملاحظة: تم قياس تطور كفاف البقع النووية في الوقت المناسب ، وهو قراءة لانتقال القوة النشطة على هذه العضيات ، باستخدام مكون إضافي مصمم خصيصا Radioak³⁶ للاستخدام في فيجي ومتاح في³⁷. يستخرج المكون الإضافي قيم أنصاف أقطار تحديد معين لجميع الزوايا حول مركز التحديد. تم قياس تباين الشكل بمرور الوقت من خلال مقارنة قيمة نصف القطر بالنسبة إلى متوسط قيمته لكل زاوية. يسمح المكون الإضافي بتحديد تقلبات الشكل ويوفر خيارا لتصور هذه الديناميكيات. لتثبيته ، قم بتنزيل ملف Radioak_.jar وضعه في مجلد المكونات الإضافية في فيجي. أعد تشغيل فيجي. هذا المكون الإضافي هو نسخة محدثة من المكون الإضافي المستخدم لتحليل تقلبات المخطط النووي أعلاه وتنفيذ خط أنابيب مماثل.

1. في أفلام البث لقطرات SRSF2-GFP ، حدد قطرات أكبر ذات أحجام مماثلة (نصف القطر ~ 2.5 ميكرومتر).
   ملاحظة: إذا كانت القطرات صغيرة جدا ، فسيؤدي عدم كفاية الدقة إلى قياسات تذبذب السطح الشاذة.
2. قم بقص صور الفاصل الزمني للقطرات التي تمتد لمسافة 15 ثانية (Δt = 0.5 ثانية) عن طريق رسم مستطيل حول القطرة وتحديد Image > Crop (الشكل 5).
3. أعد محاذاة الصور باستخدام المكون الإضافي Fiji StackReg في Plugins > StackReg واختر تحويل الجسم الصلب .
4. قم بتنعيم الصورة لإزالة التشويش حول القطرة باستخدام خيار تنعيم فيجي ضمن معالجة.
5. قم بإنشاء قناع ثنائي للقطرات باستخدام خيار التحويل إلى قناع في فيجي ضمن العملية > ثنائي. استخدم الطريقة الافتراضية والظلام للخلفية (الشكل 5).
6. قم بتحليل قناع القطرة الثنائية الذي تم إنشاؤه باستخدام خيار تحليل الجسيمات في فيجي ضمن تحليل ، وحدد خيارات مسح النتائج وإضافة إلى المدير واحفظ منطقة المصالح (ROIs) في RoiManager (المزيد > حفظ) بتنسيق zip ليتم قراءتها بواسطة Radioak. يجب حفظ عائد الاستثمار في مجلد يسمى الخطوط في نفس مجلد الأفلام ، في ملفات تسمى اسم الصورة _UnetCortex.zip لكل فيلم يتم العثور عليه بواسطة Radioak.
7. في قائمة > مكونات فيجي الإضافية CIRB > Radioak ، حدد إما الحصول على Radii لمعالجة فيلم واحد فقط أو Do One Folder لتحليل جميع الأفلام من نفس المجلد.
   ملاحظة: تنبثق نافذة لتحديد رقم الزاوية والمقياس. تم إطلاق Radioak بزيادات زاوية 1 درجة من 0 درجة إلى 360 درجة (إدخال 360) وتم استخراج قيم أنصاف الأقطار .
8. حدد الفيلم أو المجلد الذي يحتوي على الأفلام المراد تحليلها. يتم توفير النتائج كملفات .xls (ملف واحد لكل فيلم) في دليل radioakres في المجلد الذي يحتوي على الأفلام الأصلية. يعرض كل ملف كل أنصاف الأقطار المقاسة r (بالميكرومتر إذا تم ملء معلمة المقياس) لكل مرة t (في شريحة) وكل زاوية (بالراديان ؛ الشكل 5 ؛ انظر مثال الناتج .xls في الجدول التكميلي 3).
9. في جدول البيانات ، احسب متوسط نصف القطر R على جميع النقاط الزمنية t لكل زاوية محددة (انظر المثال في الجدول التكميلي 4). هذا يسمح لرسم الشكل المتوسط مع مرور الوقت.
10. ارسم التباين (r-R)² في ميكرومتر² والذي يتوافق مع قياس تقلبات سطح القطرة.

النتائج

تظهر لوحات الصور في الشكل 3 أمثلة على بويضة نموذجية كاملة النمو (الشكل 3 أ) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن YFP-Rango (الشكل 3B) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن صحيح (اللوحة اليسرى ؛ الشكل 3 ج) أو م...

Discussion

تشمل الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول الحقن المجهري المناسب للبويضات دون التأثير على بقائها أو وظيفتها الطبيعية^9،10،11 ، بالإضافة إلى الحقن الدقيق لكميات محددة مسبقا من cRNA التي من شأنها أن تسمح بالتصور الصحيح للهياكل ذات الصلة ، مثل الب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows