التقاط التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة بويضة الفأر عبر المقاييس المكانية

Summary

يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق التأثير المادي للهيكل الخلوي على الشكل النووي والعضيات الداخلية الخالية من الغشاء في نظام بويضات الفأر. يمكن تكييف الإطار للاستخدام في أنواع الخلايا والسياقات الأخرى.

Abstract

يتمثل أحد التحديات الرئيسية في فهم أسباب العقم عند النساء في توضيح الآليات التي تحكم تطور الخلايا الجرثومية الأنثوية ، والتي تسمى البويضات. يتميز تطورها بنمو الخلايا والانقسامات اللاحقة ، وهما مرحلتان حرجتان تعدان البويضة للاندماج مع المنوية لبدء التطور الجنيني. أثناء النمو ، تعيد البويضات تنظيم السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية ، وهو حدث ينبئ بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية. في بويضات الفأر ، تبين أن إعادة التنظيم السيتوبلازمي هذه مدفوعة بالهيكل الخلوي ، الذي يولد نشاطه قوى ميكانيكية تثير النواة وتعيد وضعها وتخترقها. وبالتالي ، فإن انتقال القوة السيتوبلازمية إلى النيوكليوبلازمية يضبط ديناميكيات عضيات معالجة الحمض النووي الريبي النووية المعروفة باسم المكثفات الجزيئية الحيوية. يوفر هذا البروتوكول إطارا تجريبيا لتوثيق تأثير الهيكل الخلوي على النواة عبر المقاييس المكانية في بويضات الفأر ، بدقة زمنية عالية. يفصل خطوات التصوير وتحليل الصور والأدوات اللازمة لتقييم أ) نشاط الهيكل الخلوي في سيتوبلازم البويضة ، ب) التحريض القائم على الهيكل الخلوي لنواة البويضة ، و ج) تأثيراته على ديناميكيات المكثفات الجزيئية الحيوية في نوكليوبلازم البويضة. بالإضافة إلى بيولوجيا البويضات ، يمكن تكييف الطرق الموضحة هنا لاستخدامها في الخلايا الجسدية لمعالجة الضبط القائم على الهيكل الخلوي للديناميكيات النووية عبر المقاييس.

Introduction

تحديد المواقع النووية ضروري للوظائف الخلوية والتنموية^{المتعددة 1،2،3،4،5}. تعيد الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات المسماة البويضات تشكيل السيتوبلازم لوضع النواة في مركز الخلية على الرغم من خضوعها لتقسيم غير متماثل في الحجم ، والذي يعتمد على الكروموسوم اللاحق خارج المركز⁶ (الشكل 1). يتنبأ هذا التمركز للنواة بتطور البويضة الناجح في الفئران والبشر ^7,8 ، وبالتالي إمكاناتها الجنينية (

Protocol

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية للجماعة الأوروبية وتمت الموافقة عليها من قبل وزارة الزراعة الفرنسية (الترخيص رقم 75-1170) ومن قبل المديرية العامة للبحوث والابتكار (DGRI; رقم اتفاقية الكائنات المعدلة وراثيا DUO-5291). تم إيواء الفئران في منشأة في دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، مع درجة حرارة محيطة من 22-24 درجة مئوية ورطوبة 40٪ -50٪. تشمل الفئران المستخدمة هنا إناث OF1 (Oncins France 1 ، من 8 إلى 12 أسبوعا) وإناث C57BL / 6 (من 10 إلى 14 أسبوعا).

1. جمع البويضات وإعدادها

1. جمع البويضات من الفئران البالغة من العمر 8 إلى 14 أسبوعا كما هو موضح في¹⁸ و¹⁹.
   ....

النتائج

تظهر لوحات الصور في الشكل 3 أمثلة على بويضة نموذجية كاملة النمو (الشكل 3 أ) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن YFP-Rango (الشكل 3B) ، وبلازما النواة في خلية بيضية كاملة النمو تعبر عن صحيح (اللوحة اليسرى ؛ الشكل 3 ج) أو م.......

Discussion

تشمل الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول الحقن المجهري المناسب للبويضات دون التأثير على بقائها أو وظيفتها الطبيعية^9،10،11 ، بالإضافة إلى الحقن الدقيق لكميات محددة مسبقا من cRNA التي من شأنها أن تسمح بالتصور الصحيح للهياكل ذات الصلة ، مثل الب.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows