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要約

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。

要約

女性不妊症の原因を理解する上での大きな課題は、卵母細胞と呼ばれる女性の生殖細胞の発生を支配するメカニズムを解明することです。それらの発達は、細胞の成長とその後の分裂、胚発生を開始するために精子との融合のために卵母細胞を準備する2つの重要な段階によって特徴付けられます。増殖中、卵母細胞は細胞質を再編成して核を細胞中心に配置し、マウスとヒトの卵母細胞の発生の成功を予測し、その結果、胚発生能を予測します。マウス卵母細胞では、この細胞質再編成は細胞骨格によって駆動され、その活動は核を攪拌、再配置、および貫通する機械的力を生成することが示されました。その結果、この細胞質から核質への力の伝達は、生体分子凝縮物として知られる核RNAプロセシングオルガネラのダイナミクスを調整します。このプロトコルは、マウス卵母細胞の空間スケールを渡って核に対する細胞骨格の影響を、高い時間分解能で文書化するための実験フレームワークを提供します。i)卵母細胞細胞質における細胞骨格活性、ii)卵母細胞核の細胞骨格ベースの攪拌、およびiii)卵母細胞核質内の生体分子凝縮物動態に対するその影響を評価するために必要なイメージングおよび画像解析のステップとツールについて詳しく説明します。卵母細胞生物学にとどまらず、ここで詳述した方法は、体細胞での使用にも適用でき、同様に、細胞骨格に基づくスケール全体の核動態の調整に対処できます。

概要

核の位置決めは、複数の細胞および発生機能に不可欠です1,2,3,4,5。卵母細胞と名付けられた哺乳類の雌の生殖細胞は、サイズが非対称に分裂しているにもかかわらず、細胞質をリモデリングして核を細胞の中心に配置します6(図1)。この核の中心化は、マウスとヒトの卵母細胞の発生の成功を予測し7,8、したがって、それらの胚形成能を予測します(図1)。

マウス卵母細胞の細胞質リモデリングは、主にアクトミオシン細胞骨格によって駆動される9(図2)。その活動は、原子核10を攪拌し、再配置し、貫通する機械的な力を発生させる(図2)。その結果、この細胞質から核質への力の伝達は、生体分子凝縮物12,13,14,15,16として知られる核内のいくつかの膜のないオルガネラの1つである核スペックル11と呼ばれる核メッセンジャーRNAプロセシングオルガネラのダイナミクスを調整します(図2)。

ライブイメージングは、核の攪拌の機能的意味を解読する上で決定的であった。何時間にもわたる核移動の動画や、アクチンメッシュやバルク細胞質の高時間分解能の動画は、異なる時間スケールを結びつけて、核の位置決めのための理論モデルの精緻化に大きく貢献した9。また、細胞質、核の輪郭、クロマチンや核凝縮物などの核成分の高時間分解能の動画は、細胞骨格に基づく核の攪拌がマウス卵母細胞のRNAプロセシングと遺伝子発現に及ぼす役割を強調し、細胞内の異なる時空間スケールを橋渡しする10,11。全体として、ライブイメージングに基づくこのようなスケール交差アプローチは、核の細胞骨格の攪拌と卵母細胞の発生の成功を結びつける最初の理論的根拠を提供しました。

プロトコルはマウス卵母細胞の核そして内部部品に細胞質力の伝達を(主にFアクチンによってそして部分的にmicrotubulesによって)調査するのに使用するイメージ投射およびイメージ分析のパイプラインを提供する。これらの実験の結果は、細胞質の活発な動き、核輪郭の揺らぎ、および単一のタイプの核生体分子凝縮物の動きと表面の揺らぎの間の関連性を確立した最近の2つの研究10,11に示されているように、細胞質内の細胞骨格から核内部まで、空間スケールにわたる力の連続体を捕捉することです。 核の斑点。同じアプローチは、悪性癌細胞の状況など、細胞質力が変化すると予想される他のモデル系にも適用され得る17。

プロトコル

すべての動物実験は、欧州共同体のガイドラインに従って実施され、フランス農業省(認可番号75-1170)およびDirection Générale de la Recherche et de l'Innovation(DGRI;GMO契約番号DUO-5291)。マウスは、周囲温度22〜24°C、湿度40%〜50%で、12時間の明暗サイクルで動物施設に収容されました。ここで使用したマウスは、雌のOF1(Oncins France 1、8〜12週齢)と雌のC57BL/6(10〜14週齢)です。

1. 卵母細胞の採取と調製

  1. 8週齢から14週齢のマウスの卵母細胞を18 週齢および19週齢で採取する。
    1. 簡単に説明すると、まず、18 と同様にマウスから卵巣を、卵母細胞の減数分裂の再開を防ぐ1μMのミリノン19を添加した予熱(37°C)M2+ウシ血清アルブミン(BSA)培地に抽出します。
    2. 手術針で卵胞に穿刺し、成長中の卵母細胞を胞状卵胞から放出する(卵母細胞成長の終わり20)。
    3. 卵母細胞採取専用のマイクロピペットで実験に必要な大きさの卵母細胞(成長中の卵母細胞および/または完全に成長した卵母細胞)を採取し、その後、鉱油下で新鮮な培地で洗浄して皿に移します。
  2. ピペッティングで上下にピペッティングして胞子細胞から卵母細胞を機械的に解離し、インキュベーター内で37°Cで1時間安定させてから、その後の実験ステップに進みます。
    注:卵母細胞は、すべての実験ステップで37°Cに保たれます。このプロトコルでは、完全に成長した卵母細胞である最大の卵母細胞が収集されました。

2.卵母細胞マイクロインジェクション

注:細胞質内の細胞骨格ベースの活性を捕捉するために、明視野ライブイメージングが使用されます。したがって、蛍光マーカーのマイクロインジェクションは不要であり、プロトコルはステップ3で再開できます。核の輪郭を画像化するために、N末端にYFPタグ、C末端にCFPタグを表示するプローブであるRango21,22が使用されました。卵母細胞で488 nmで画像化すると、核小体23を除く核全体を標識し、非常に鮮明な核の輪郭を示します。核スペックルを可視化するために、核スペックル11のマーカーであるSRSF2-GFP(NM_011358)を用いた。同じ培地を、卵母細胞の採取、マイクロインジェクション、相補的RNA翻訳、および生細胞イメージングに使用します。

  1. SfiIまたはSRSF2-GFPプラスミドとAgeI制限酵素によるRangoプラスミドの直鎖化。
  2. 前述のように、プロモーターに応じた適切な in vitro 転写キット(Rangoの場合はT3、SRSF2-GFPの場合はT7)でキャップ付き相補RNA(cRNA)を合成し、カラム精製キットを使用して精製します24。
    注:ポリアデニル化キットを使用したポリアデニル酸SRSF2-GFP RNAは、cRNAの安定性を高めます。プラスミド骨格の違いにより、2つの異なるプロモーターが使用されます。
  3. 微量分光光度計を用いてcRNA濃度を測定します。
  4. Rango cRNA を 1000 ng/μL に希釈し、SRSF2-GFP cRNA を 600 ng/μL に希釈します。
  5. cRNAアリコートを4°C、25,000 x g で60分以上遠心分離してから、マイクロインジェクションを行います。
  6. 11,25に記載されているように、YFP-RangoまたはSRSF2-GFPをコードするcRNAを、マイクロインジェクターを使用して37°CのM2 + BSA +ミリノン培地の卵母細胞の細胞質に注入します。
  7. 卵母細胞を37°Cの培地で少なくとも2時間インキュベートし、cRNAを翻訳します。
  8. 卵母細胞を小さな(5 μL)培養液滴に入れ、底面を鉱物油で覆ったカバーガラス付きの35 mm組織培養皿に沈着させます。隣接する卵母細胞の光退色を避けるために、液滴ごとに1つの卵母細胞を配置します。

3. 生細胞イメージング

注:生きたマウス卵母細胞は、Plan-APO 40x / 1.25 NA油浸対物レンズ、電動スキャニングデッキ、インキュベーションチャンバー(37°C)、フィルターホイールに結合されたCCDカメラ、およびスピニングディスクを備えた倒立共焦点顕微鏡で調べられました。高時間分解能の画像は、ストリーム取得モードのMetamorph(以下、イメージングソフトウェア)を使用して取得されます。

  1. イメージングソフトウェアの [取得 ]ウィンドウを開きます。
  2. 露光時間を 500 ミリ秒、カメラ領域を フルチップ 、ビニングを 1 に設定します。
  3. [ 取得] タブで、必要なチャンネルの照明を設定します。細胞質の活動を画像化するには、透過光で卵母細胞を照らします。YFP-RangoまたはSRSF2-GFPで標識された核を画像化するには、励起波長491 nmで卵母細胞を照射します。
  4. 細胞質攪拌実験やYFP-Rango実験では、透過光で容易に観察できる卵母細胞核小体に着目します(図3A)。1 つの平面が取得されます。核スペックル実験では、SRSF2-GFP液滴に着目します(図3C)。
  5. Specialタブでは、取得速度を最適化するためのパラメータを以下のように設定します。
    カメラシャッター: 露出用に開く
    クリアモード: CLEAR PRESEQUENCE
  6. イメージングソフトウェアの[Stream Acquisition]ウィンドウを開きます。実験に従ってストリーミング パラメーターを設定します。10,11の両試験では、以下に説明するパラメータを使用します。
    1. [ 取得] タブで、次のパラメーターを設定します。
      アクイジション・モード: RAMへのストリーミング
      コマ数: 480 コマ(240コマまで減らして撮影時間を短縮可能)
      カメラパラメータ: フレームレートで画像を取得
      スキップするフレーム数(Nb): 0
    2. [デジタル カメラ コントローラーのパラメーター] タブで、次のパラメーターを設定します。
      カメラの状態: HALT
      シャッターモード:OPEN NEVER(オープン・ネバー)
      クリアモード: CLEAR PRESEQUENCE
      平均するフレーム数: 1
      注1:ストリームモードでは、露出時間を設定すると、ムービーの長さはフレーム数によって決まります。例えば、露光時間が 500 ミリ秒、フレームが 480 の場合、4 分間のムービーが生成されます。画像取得中にプレビューを表示できます。
  7. オブジェクトの周囲の関心領域 (ROI) を調整します。ROIの面積を最小化すると、取得時間が短縮されます。
  8. [Stream Acquisition] ウィンドウで [Acquire] をクリックして、ムービーを起動します。
  9. 取得終了時に動画を.tifファイルとして保存します。
    注:高時間分解能の動画で核構造を追跡するには、核プローブ(YFP-RangoおよびSRSF2-GFP)は、画像解析の以降のステップで物体のセグメンテーションを容易にするために、高いS/N比を備えている必要があります。外因性SRSF2-GFP発現プロファイルは、内因性核スペックル免疫染色と同等です(図3C-D)。内因性染色と比較したSRSF2-GFP発現プロファイルの変化は、高用量のcRNA注入および翻訳を反映している可能性がある26(図3C-D)。

4.画像解析:細胞質攪拌

注:卵母細胞におけるアクチンベースの細胞骨格活性の強度を反映する細胞質攪拌は、ラボの以前の出版物9 のソフトウェアを使用した画像相関分析によって決定され、27に利用可能になりました。ソフトウェアは、連続する画像間で保存されるピクセル強度の量を測定します。出力は、画像間の相関関係の時間的損失であり、1 から始まり、9 のように時間とともに指数関数的に減少します。

  1. 生のタイムラプス画像(Δt=0.5秒)をFiji StackRegプラグイン(Plugins>StackReg)で整列します。プラグイン StackReg28 をインストールするには、BIG-EPFL 更新サイト29 を有効にしてプラグインにアクセスします。
  2. 以下の手順に従って、~300 μm2 の 3 つから 4 つの細胞質領域における明視野画像の相関を計算します。
    1. 領域を切り抜き、個別のムービーファイルとして保存します。ターミナルウィンドウを開きます。
    2. oocyteと入力し、 スペースバー を押してから Enterキーを押します。[Signal and Slot](信号とスロット)というウィンドウが表示されます。分析するトリミングされたムービーファイルを選択します。
      注:複数の動画を同時に選択できます。
  3. アプリケーションは、ムービーと同じフォルダー内のファイルを返します。拡張子が .csv、.eps、.xls の 3 つの異なるファイルが生成されます。.xlsファイルには、1つの領域の相関プロットを描画するためのデータが含まれています。セル内の異なる領域からの平均相関値。
  4. 視覚的にわかりやすくするために、各時点の値を 1 から減算して最終的な相関値を変換し、 11 のように逆指数のような曲線を取得します。

5.画像解析:細胞質ベクターマップ

注:マウス卵母細胞細胞質ベクターマップは、マウス卵母細胞31における細胞質フローを検出するために以前にフィジー32で実装され、33で利用可能であった時空間画像相関分光法(STICS)プラグイン30によって生成された。マップは、9と11のように、細胞質の流速、大きさ、および方向を示しています。

  1. 明視野タイムラプス画像(Δt=0.5秒)を32ビット形式に変換します。
  2. Plugins > StackReg で Fiji StackReg プラグインを使用して画像を再調整し、[Rigid Body transformation] を選択します。
  3. プラグインスタックの移動平均jru v2(STICプラグインスイートのトレンド除去ツール内)を使用すると、ムービーの時間平均画像を差し引くことで、ムービー内の静止構造を取り除きます。[ 静的平均を減算 ] ボックスと [ 出力サブ スタック] をオンにし、[ 空間平均を維持 ] を選択して [期間] を 5 に設定します。
  4. プラグインの境界効果を避けるために、皮質を除いた卵母細胞の周囲にROIを描きます。
  5. サブ領域サイズを32ピクセル、ステップサイズを16ピクセル、STICS時間シフトを3、XとYのオフセットを0、速度乗数を8、振幅しきい値を0に設定し、 Normalize Vector Length、Center Vectors、Output Velocities 、Use Movie Maskのチェックボックスをオンにして、STICS map jru V2プラグイン(ICSツール内)を起動します。
    注:プラグインは、卵母細胞のマップを.tif形式で生成し、9 や11のように、細胞質の流れを、流れの振幅を示す色のベクトルとして表示し、測定された流速のExcelファイルを表示します。

6. 画像解析:核の輪郭揺らぎ

注:核膜の攪拌を反映する核外形変動は、YFP-Rangoで標識した核の動画から決定できます(図4A、C)。核の輪郭変動の画像解析には、フィジーとプラグインStackReg(BIG-EPFL更新サイト29 がStackRegプラグインにアクセスできるようにする)、PureDenoise34 、およびOvocyte_nucleusのインストールが必要です。StackReg プラグインは、画像の登録を実行して、起こりうるグローバル モーションを補正します。PureDenoiseプラグインは、混合ポアソン・ガウスノイズによって破損した多次元画像のノイズを除去し、核の輪郭を滑らかにします。Ovocyte_nucleusプラグインは、バイナリ核マスクを作成し、StackRregで再調整し、すべてのθ角度(0°から360°までのθ°を1°刻み)で核マスクの重心からマスクの円周までの距離rを計算するために、信号をしきい値化し、核小体に対応する穴を埋めます。 図 4 のように。これらのプラグインのすべてのコードは 35にあります。

  1. Fiji では、[ Plugins] > CIRB > Verlhac メニューで [ Ovocyte Nucleus Shape] を選択します。
  2. ダイアログボックスで、次の選択を行います。
    1. 解析する動画が保存されているフォルダーを選択します。
    2. θ角度(1°から360°までの値を選択でき、最適な輪郭解像度のために1°の値を使用しました)、トリミングのマージン(核全体を保持するために5μmを推奨)を選択します。
    3. XY キャリブレーションと時間間隔を選択します。[ OK]をクリックします。
      注:結果は、元のムービーを含むフォルダー内の出力フォルダー内の.xlsファイルとして提供されます。このファイルには、各時間 t と各角度 θ について測定されたすべての半径 r が表示されます。出力ファイルの例を 補足表1に示します。out フォルダーには、nucleus マスクのムービーも含まれています。
  3. スプレッドシートを使用して、定義された各θ角度のすべての時点tの平均半径Rを計算します。これにより、経時的な平均形状をプロットすることができます(図4B)。 付表2の例を参照のこと。
  4. 各 t と θ について、半径 r から経時的な平均半径 R を減算します。分散 (r-R)2 は、核エンベロープの揺らぎの尺度です。
  5. すべての時点 t とすべての角度 θ の揺らぎの平均を各原子核について計算し、最終的には 1 つの条件からすべての原子核について計算します。
    注:細胞骨格が破壊された場合など、核の形状が著しく変化した場合、フィジーではYFP-Rangoで標識された核を回転させて平滑部を上向きに、陥入を下向きにしてから、10のように核外形変動の解析を進めます。

7. 画像解析:核スペックル運動(拡散ダイナミクス)

注:核スペックル運動解析により、これらの細胞小器官のダイナミクスの種類(駆動、拡散、または閉じ込め)をそれらの軌跡から推測できます。

  1. 主にX-Y軸で移動するSRSF2-GFP液滴を発現する卵母細胞のストリームモード画像を選択します。
  2. フィジーのヒストグラムマッチング法によるSRSF2-GFP発現卵母細胞のタイムラプス画像の漂白を補正(画像> Adjust > Blech Correction)。
  3. Fiji StackReg プラグインで画像を再調整します。
  4. Fiji Manual Trackingプラグイン(Plugins > Tracking > Manual Tracking)を使用して、SRSF2-GFP液滴中心を追跡します。[ Add Track ]を押してトラッキングを開始し、終了したら [End Track ]を押します。センタリング補正を有効にしないでください。
  5. トラックをスプレッドシート ファイルにコピーして、 11 と同様に時間平均二乗変位 (MSD) の計算を続行し、20 秒ごとの液滴軌跡から時間 MSD を計算します。
  6. R ソフトウェアを使用して Nelder-Mead 法で曲線 (msd(t) = beta x tα) を当てはめ、拡散指数アルファ (α) を推定します。
  7. 拡散が異常であると予想されるため、異なる条件を比較できるように有効拡散係数を測定します(α<1)。
  8. 時間MSD曲線の最初の40点(20秒)の線形近似(α=1)から有効拡散係数Deff を算出し、液滴サイズ(Deff in μm2/s x 3/2 πr in μm)で正規化します。

8. 画像解析:核スペックル表面の揺らぎ

注:核スペックル輪郭の経時的な進化、これらのオルガネラへの能動力伝達の読み出しは、フィジーで使用するために特注のプラグインRadioak36 で測定され、37で入手可能です。プラグインは、選択中心の周りのすべての角度について、特定の選択範囲の半径の値を抽出します。経時的な形状の変化は、各角度の平均値に対する半径の値を比較することによって測定されました。このプラグインは、形状の変動を定量化することができ、これらのダイナミクスを視覚化するオプションを提供します。インストールするには、Radioak_.jarファイルをダウンロードし、フィジーのpluginsフォルダーに配置します。フィジーを再起動します。このプラグインは、上記の核の輪郭変動を分析し、同等のパイプラインを実装するために使用されるプラグインの更新バージョンです。

  1. SRSF2-GFP液滴のストリーム動画では、同等のサイズ(半径~2.5μm)のより大きな液滴を選択します。
    注意: 液滴が小さすぎると、分解能が不十分なため、表面変動測定が異常になります。
  2. 15秒(Δt=0.5秒)の液滴のタイムラプス画像を、液滴の周囲に長方形を描き、 画像>切り抜き を選択します(図5)。
  3. Plugins > StackReg の Fiji StackReg プラグインを使用して画像を再調整し、[Rigid Body transformation] を選択します。
  4. 画像をスムージングして、水滴の周りのノイズを除去するには、[プロセス] の [フィジー スムージング] オプションを使用します。
  5. フィジーの [Process > Binary] の [Convert to Mask] オプションを使用して、液滴のバイナリ マスクを作成します。背景にはデフォルトの方法を使用し、暗い色を使用します(図5)。
  6. Fiji の [Analyze] の [Analyze] で [Analyze] オプションを使用して、生成されたバイナリ ドロップレット マスクを解析し、[Clear Results] オプションと [Add to Manager] オプションを選択し、RoiManager (More > Save) に関心領域 (ROI) を zip 形式で保存して、Radioak で読み取ることができるようにします。ROI は、Radioak が検出する各ムービーのムービーの同じフォルダー内の contours というフォルダーの imagename というファイルに保存する必要があります_UnetCortex.zip。
  7. Fiji Plugins > CIRB > Radioak メニューで、「 Radii を取得 」を選択して 1 つのムービーのみを処理するか、「1 つのフォルダーを実行 」を選択して同じフォルダーのすべてのムービーを解析します。
    注意: 角度番号とスケールを選択するためのウィンドウがポップアップします。Radioakは、0°から360°までの1°の角度刻み(360の入力)で起動され、半径値が抽出されました。
  8. 解析する動画または動画が入っているフォルダーを選択します。結果は、元のムービーを含むフォルダー内の radioakres ディレクトリに .xls ファイル (ムービーごとに 1 つ) として提供されます。各ファイルには、各時間t(スライス単位)および各角度(ラジアン単位)について、すべての測定半径r(スケールパラメータが入力されている場合はμm単位)が表示されます。 図5; 付表3の.xls出力例を参照)。
  9. スプレッドシートで、定義された角度ごとに、すべての時点 t の平均半径 R を計算します ( 補足表 4 の例を参照)。これにより、時間の経過に伴う平均形状をプロットできます。
  10. 液滴表面の揺らぎの尺度に対応する分散 (r-R)2 を μm2 でプロットします。

結果

図3の画像パネルは、典型的な完全に増殖した卵母細胞(図3A)、YFP-Rangoを発現する完全に増殖した卵母細胞の核質(図3B)、正しく増殖した卵母細胞の核質(左パネル;図3C)または過剰(右パネル;図3C)SRSF2-GFP cRNAの投与、およびSC35抗体を用いた完全に増殖した卵母細胞の核スペックルの免疫...

ディスカッション

このプロトコルの主ステップは生存か正常な機能9,10,11に影響を与えることなく卵母細胞の適切なmicroinjection、また核斑点のような関連した構造の正しい視覚化を、可能にするcRNAのpredefined量のmicroinjectingを含んでいる。

細胞質動態と(核内)動態の関連性を確立することは、細胞骨格が核またはその内部?...

開示事項

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

A.A.J.とM.A.が共同執筆し、共著者全員が原稿にコメントしました。M. A.はCNRSと"Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J.は、Fondation des Treilles、Fonds Saint-Michel、Fondation du Collège de Franceの支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma A3311
CSU-X1-M1 spinning diskYokogawa
DMI6000B microscope Leica
Femtojet microinjectorEppendorf
Fiji
Filter wheelSutter Instruments Roper Scientific
FluorodishWorld Precision InstrumentsFD35-100
Metamorph software Universal Imaging, version 7.7.9.0
Mineral oilSigma AldrichM8410-1L
NanoDrop 2000 Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit Thermo FisherAM1350
Retiga 3 CCD camera QImaging
RNAeasy kit Qiagen74104
SC35 antibodyAbcamab11826Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid  OriGene TechnologiesMG202528NM_011358
Stripper Micropipette XLAB Solutionsspecialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachineThermo FisherAM1384 
T7 mMessage mMachine Thermo FisherAM13344
Thermostatic chamberLife Imaging Service
Windows ExcelWindows

参考文献

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