マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

要約

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。

要約

女性不妊症の原因を理解する上での大きな課題は、卵母細胞と呼ばれる女性の生殖細胞の発生を支配するメカニズムを解明することです。それらの発達は、細胞の成長とその後の分裂、胚発生を開始するために精子との融合のために卵母細胞を準備する2つの重要な段階によって特徴付けられます。増殖中、卵母細胞は細胞質を再編成して核を細胞中心に配置し、マウスとヒトの卵母細胞の発生の成功を予測し、その結果、胚発生能を予測します。マウス卵母細胞では、この細胞質再編成は細胞骨格によって駆動され、その活動は核を攪拌、再配置、および貫通する機械的力を生成することが示されました。その結果、この細胞質から核質への力の伝達は、生体分子凝縮物として知られる核RNAプロセシングオルガネラのダイナミクスを調整します。このプロトコルは、マウス卵母細胞の空間スケールを渡って核に対する細胞骨格の影響を、高い時間分解能で文書化するための実験フレームワークを提供します。i)卵母細胞細胞質における細胞骨格活性、ii)卵母細胞核の細胞骨格ベースの攪拌、およびiii)卵母細胞核質内の生体分子凝縮物動態に対するその影響を評価するために必要なイメージングおよび画像解析のステップとツールについて詳しく説明します。卵母細胞生物学にとどまらず、ここで詳述した方法は、体細胞での使用にも適用でき、同様に、細胞骨格に基づくスケール全体の核動態の調整に対処できます。

概要

核の位置決めは、複数の細胞および発生機能に不可欠です^1,2,3,4,5。卵母細胞と名付けられた哺乳類の雌の生殖細胞は、サイズが非対称に分裂しているにもかかわらず、細胞質をリモデリングして核を細胞の中心に配置し^ます6(図1)。この核の中心化は、マウスとヒトの卵母細胞の発生の成功を予測し^7,8、したがって、それらの胚形成能を予測します(図1)。

マウス卵母細胞の細胞質リモデリングは、主にアクトミオシン細胞骨格によって駆動される⁹⁽図2)。その活動は、原子核¹⁰を攪拌し、再配置し、貫通する機械的な力を発生させる(

プロトコル

すべての動物実験は、欧州共同体のガイドラインに従って実施され、フランス農業省(認可番号75-1170)およびDirection Générale de la Recherche et de l'Innovation(DGRI;GMO契約番号DUO-5291)。マウスは、周囲温度22〜24°C、湿度40%〜50%で、12時間の明暗サイクルで動物施設に収容されました。ここで使用したマウスは、雌のOF1(Oncins France 1、8〜12週齢)と雌のC57BL/6(10〜14週齢)です。

1. 卵母細胞の採取と調製

1. 8週齢から14週齢のマウスの卵母細胞を¹⁸ 週齢および¹⁹週齢で採取する。
   1. 簡単に説明すると、^まず、18 と同様にマウスから卵巣を、卵母細胞の減数分裂の再開を防ぐ1μMのミリノン¹⁹を添加した予熱(37°C)M2+ウシ血清アルブミン(BSA)培地に抽出します。
   2. 手術針で卵胞に穿刺し、成長中の卵母細胞を胞状卵胞から放出する(卵母細胞成長の終わり²⁰)。
   3. 卵母細胞採取専用のマイクロピペットで実験に必要な大きさの卵母細胞(成....

結果

図3の画像パネルは、典型的な完全に増殖した卵母細胞(図3A)、YFP-Rangoを発現する完全に増殖した卵母細胞の核質(図3B)、正しく増殖した卵母細胞の核質(左パネル;図3C)または過剰(右パネル;図3C)SRSF2-GFP cRNAの投与、およびSC35抗体を用いた完全に増殖した卵母細胞の核スペックルの免疫.......

ディスカッション

このプロトコルの主ステップは生存か^{正常な機能9,10,11}に影響を与えることなく卵母細胞の適切なmicroinjection、また核斑点のような関連した構造の正しい視覚化を、可能にするcRNAのpredefined量のmicroinjectingを含んでいる。

細胞質動態と(核内)動態の関連性を確立することは、細胞骨格が核またはその内部?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows