Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Resumen

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Resumen

Un reto importante para comprender las causas de la infertilidad femenina es dilucidar los mecanismos que gobiernan el desarrollo de las células germinales femeninas, llamadas ovocitos. Su desarrollo está marcado por el crecimiento celular y las posteriores divisiones, dos fases críticas que preparan al ovocito para la fusión con los espermatozoides para iniciar la embriogénesis. Durante el crecimiento, los ovocitos reorganizan su citoplasma para posicionar el núcleo en el centro de la célula, un evento predictivo del desarrollo exitoso de los ovocitos en ratones y humanos y, por lo tanto, de su potencial embriogénico. En los ovocitos de ratón, se demostró que esta reorganización citoplasmática está impulsada por el citoesqueleto, cuya actividad genera fuerzas mecánicas que agitan, reposicionan y penetran en el núcleo. En consecuencia, esta transmisión de fuerza citoplasmática a nucleoplasmática sintoniza la dinámica de los orgánulos de procesamiento de ARN nuclear conocidos como condensados biomoleculares. Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar, con alta resolución temporal, el impacto del citoesqueleto en el núcleo a través de escalas espaciales en ovocitos de ratón. Se detallan los pasos y herramientas de imagen y análisis de imágenes necesarias para evaluar i) la actividad citoesquelética en el citoplasma del ovocito, ii) la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito y iii) sus efectos sobre la dinámica del condensado biomolecular en el nucleoplasma del ovocito. Más allá de la biología de los ovocitos, los métodos elaborados aquí se pueden adaptar para su uso en células somáticas para abordar de manera similar el ajuste de la dinámica nuclear basado en citoesqueletos a través de escalas.

Introducción

El posicionamiento nuclear es esencial para múltiples funciones celulares y de desarrollo 1,2,3,4,5. Las células germinales femeninas de mamíferos llamadas ovocitos remodelan su citoplasma para posicionar el núcleo en el centro de la célula a pesar de sufrir una división asimétrica en tamaño, que depende del descentrado posterior del cromosoma⁶ (Figura 1). Este centrado del núcleo predice el desarrollo exitoso de los ovocitos en ratones y humanos

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea y fueron aprobados por el Ministerio de Agricultura francés (autorización Nº 75-1170) y por la Dirección General de Investigación e Innovación (DGRI; Acuerdo OMG número DUO-5291). Los ratones se alojaron en el animalario en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con una temperatura ambiente de 22-24 °C y una humedad del 40%-50%. Los ratones utilizados aquí incluyen hembras OF1 (Oncins France 1, 8 a 12 semanas de edad) y hembras C57BL/6 (10 a 14 semanas de edad).

1. Recolección y preparación de ovocitos

1. Recolect....

Discusión

Los pasos clave de este protocolo incluyen la microinyección adecuada de ovocitos sin afectar su supervivencia o función normal ^9,10,11, así como la microinyección de cantidades predefinidas de ARNc que permitan la correcta visualización de estructuras relevantes, como las motas nucleares.

Establecer el vínculo entre la dinámica citoplasmática y la dinámica (intra)nuclear es esencial cuando s.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows