Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Resumen

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Resumen

Un reto importante para comprender las causas de la infertilidad femenina es dilucidar los mecanismos que gobiernan el desarrollo de las células germinales femeninas, llamadas ovocitos. Su desarrollo está marcado por el crecimiento celular y las posteriores divisiones, dos fases críticas que preparan al ovocito para la fusión con los espermatozoides para iniciar la embriogénesis. Durante el crecimiento, los ovocitos reorganizan su citoplasma para posicionar el núcleo en el centro de la célula, un evento predictivo del desarrollo exitoso de los ovocitos en ratones y humanos y, por lo tanto, de su potencial embriogénico. En los ovocitos de ratón, se demostró que esta reorganización citoplasmática está impulsada por el citoesqueleto, cuya actividad genera fuerzas mecánicas que agitan, reposicionan y penetran en el núcleo. En consecuencia, esta transmisión de fuerza citoplasmática a nucleoplasmática sintoniza la dinámica de los orgánulos de procesamiento de ARN nuclear conocidos como condensados biomoleculares. Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar, con alta resolución temporal, el impacto del citoesqueleto en el núcleo a través de escalas espaciales en ovocitos de ratón. Se detallan los pasos y herramientas de imagen y análisis de imágenes necesarias para evaluar i) la actividad citoesquelética en el citoplasma del ovocito, ii) la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito y iii) sus efectos sobre la dinámica del condensado biomolecular en el nucleoplasma del ovocito. Más allá de la biología de los ovocitos, los métodos elaborados aquí se pueden adaptar para su uso en células somáticas para abordar de manera similar el ajuste de la dinámica nuclear basado en citoesqueletos a través de escalas.

Introducción

El posicionamiento nuclear es esencial para múltiples funciones celulares y de desarrollo 1,2,3,4,5. Las células germinales femeninas de mamíferos llamadas ovocitos remodelan su citoplasma para posicionar el núcleo en el centro de la célula a pesar de sufrir una división asimétrica en tamaño, que depende del descentrado posterior del cromosoma⁶ (Figura 1). Este centrado del núcleo predice el desarrollo exitoso de los ovocitos en ratones y humanos ^7,8 y, por lo tanto, su potencial embriogénico (Figura 1).

La remodelación citoplasmática en ovocitos de ratón es impulsada principalmente por el citoesqueleto de actomiosina⁹ (Figura 2). Su actividad genera fuerzas mecánicas que agitan, reposicionan y penetran en el núcleo¹⁰ (Figura 2). En consecuencia, esta transmisión de fuerza citoplasmática a nucleoplasmática sintoniza la dinámica de los orgánulos de procesamiento de ARN mensajero nuclear llamados motas nucleares¹¹, uno de los varios orgánulos sin membrana en el núcleo conocidos como condensados biomoleculares 12,13,14,15,16 (Figura 2).

Las imágenes en vivo han sido decisivas para descifrar las implicaciones funcionales de la agitación nuclear. Las películas de migración nuclear a lo largo de horas, así como las películas de alta resolución temporal de la malla de actina y el citoplasma a granel, contribuyeron en gran medida a la elaboración de un modelo teórico para el posicionamiento nuclear, vinculando diferentes escalas de tiempo⁹. Además, las películas de alta resolución temporal del citoplasma, el contorno nuclear y los componentes nucleares como la cromatina y los condensados nucleares, destacaron el papel de la agitación del núcleo basada en el citoesqueleto en el procesamiento del ARN y la expresión génica en ovocitos de ratón, uniendo diferentes escalas espacio-temporales dentro de la célula^10,11. En conjunto, este enfoque de cruce de escalas basado en imágenes en vivo proporcionó la primera justificación que vincula la agitación citoesquelética del núcleo con el éxito del desarrollo de los ovocitos.

El protocolo proporciona la línea de imágenes y análisis de imágenes utilizada para estudiar la transmisión de las fuerzas citoplasmáticas (generadas principalmente por la actina F y en parte por los microtúbulos) al núcleo y sus componentes internos en los ovocitos de ratón. El resultado de estos experimentos es capturar el continuo de fuerzas a través de escalas espaciales, desde el citoesqueleto en el citoplasma hasta el interior nuclear a través de películas de alta resolución temporal, como se muestra en dos estudios recientes ^10,11, que establecieron el vínculo entre los movimientos citoplasmáticos activos, las fluctuaciones del contorno nuclear, así como el movimiento y las fluctuaciones superficiales de un solo tipo de condensados biomoleculares nucleares: motas nucleares. El mismo enfoque puede aplicarse a otros sistemas modelo en los que se espera que cambien las fuerzas citoplasmáticas, como en el contexto de las células cancerosas malignas¹⁷.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea y fueron aprobados por el Ministerio de Agricultura francés (autorización Nº 75-1170) y por la Dirección General de Investigación e Innovación (DGRI; Acuerdo OMG número DUO-5291). Los ratones se alojaron en el animalario en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con una temperatura ambiente de 22-24 °C y una humedad del 40%-50%. Los ratones utilizados aquí incluyen hembras OF1 (Oncins France 1, 8 a 12 semanas de edad) y hembras C57BL/6 (10 a 14 semanas de edad).

1. Recolección y preparación de ovocitos

1. Recolectar ovocitos de ratones de 8 a 14 semanas de edad como se describe en¹⁸ y¹⁹.
   1. Brevemente, primero extraiga los ovarios de ratones como en¹⁸ en medio precalentado (37 °C) M2 + Albúmina sérica bovina (BSA) suplementado con 1 μM de milrinona¹⁹, que evita la reanudación de la meiosis en los ovocitos.
   2. Punción de los folículos ováricos con agujas quirúrgicas para liberar los ovocitos en crecimiento de los folículos antrales (fin del crecimiento de los ovocitos²⁰).
   3. Recolectar ovocitos del tamaño necesario para experimentos (ovocitos en crecimiento y/o completamente desarrollados) con una micropipeta especializada para la recolección de ovocitos, antes de lavarlos y pasar a platos con medio fresco bajo aceite mineral.
2. Disociar mecánicamente los ovocitos de las células foliculares antrales pipeteando hacia arriba y hacia abajo y dejar estabilizar durante 1 h en el incubador a 37 °C antes de continuar con los siguientes pasos experimentales.
   NOTA: Los ovocitos se mantienen a 37 °C durante todas las etapas experimentales. Para este protocolo, se recolectaron los ovocitos más grandes, que son los adultos.

2. Microinyección de ovocitos

NOTA: Para capturar la actividad basada en el citoesqueleto en el citoplasma, se utilizan imágenes en vivo de campo claro. Por lo tanto, no es necesaria la microinyección de marcadores fluorescentes, y el protocolo se puede reanudar en el paso 3. Para obtener imágenes del contorno nuclear, se utilizó Rango, una sonda que mostraba la etiqueta YFP en su extremo N y una etiqueta CFP en su extremo C^21,22. Cuando se obtiene una imagen en ovocitos a 488 nm, marca todo el núcleo, excepto el nucléolo²³, y muestra un contorno nuclear muy nítido. Para visualizar las motas nucleares, se utilizó SRSF2-GFP (NM_011358), un marcador de motas nucleares¹¹. El mismo medio se utiliza para la recolección de ovocitos, la microinyección, la traducción complementaria de ARN y la obtención de imágenes de células vivas.

1. Linealizar plásmido Rango con SfiI o plásmido SRSF2-GFP con enzimas de restricción AgeI.
2. Sintetizar los ARN complementarios tapados (ARNc) con el kit de transcripción in vitro adecuado según el promotor (T3 para Rango y T7 para SRSF2-GFP) y purificarlos utilizando un kit de purificación en columna, como se ha descrito anteriormente²⁴.
   NOTA: ARN de poliadenilato SRSF2-GFP utilizando un kit de poliadenilación para aumentar la estabilidad del ARNc. Se utilizan dos promotores diferentes debido a las diferencias en la columna vertebral del plásmido.
3. Mida las concentraciones de ARNc con un espectrofotómetro de microvolúmenes.
4. Diluir el ARNc de Rango a 1000 ng/μL y el ARNc de SRSF2-GFP a 600 ng/μL en_dH2O.
5. Centrifugar la alícuota de ARNc a 4 °C durante al menos 60 min a 25.000 x g antes de la microinyección.
6. Inyectar los ARNc que codifican para YFP-Rango o SRSF2-GFP como se describe en^11,25 en el citoplasma de los ovocitos en medio M2+ BSA+Milrinona a 37 °C utilizando un microinyector.
7. Incubar los ovocitos durante al menos 2 h en medio de cultivo a 37 °C para la traducción del ARNc.
8. Depositar los ovocitos en gotas pequeñas (5 μL) del medio de cultivo en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm con fondo de vidrio cubierto con aceite mineral. Colocar un ovocito por gota para evitar el fotoblanqueo de los ovocitos vecinos.

3. Obtención de imágenes de células vivas

NOTA: Los ovocitos vivos de ratón se examinaron con un microscopio confocal invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite Plan-APO 40x/1,25 NA, una plataforma de exploración motorizada, una cámara de incubación (37 °C), una cámara CCD acoplada a una rueda de filtros y un disco giratorio. Las imágenes de alta resolución temporal se adquieren utilizando Metamorph (en lo sucesivo, el software de imágenes) en el modo de adquisición de flujos.

1. Abra la ventana Adquirir del software de creación de imágenes.
2. Establezca el tiempo de exposición en 500 ms, el área de la cámara en Full Chip y el binning en 1.
3. En la pestaña Adquirir , defina la iluminación para el canal deseado. Para obtener imágenes de la actividad citoplasmática, ilumine los ovocitos con luz transmitida. Para obtener imágenes del núcleo marcado con YFP-Rango o SRSF2-GFP, ilumine ovocitos con una longitud de onda de excitación de 491 nm.
4. Para la agitación citoplasmática o los experimentos de YFP-Rango, concéntrese en el nucléolo del ovocito que se puede observar fácilmente con luz transmitida (Figura 3A). Se adquirirá un solo avión. En el caso de los experimentos de motas nucleares, concéntrese en las gotas de SRSF2-GFP (Figura 3C).
5. En la pestaña Especial , establezca los parámetros para optimizar la velocidad de adquisición como se muestra a continuación.
   Obturador de la cámara: Abierto para la exposición
   Modo de borrado: CLEAR PRESEQUENCE
6. Abra la ventana Adquisición de flujos del software de generación de imágenes. Establezca los parámetros de transmisión de acuerdo con el experimento. Para ambos estudios ^10,11, utilizar los parámetros que se describen a continuación.
   1. En la pestaña Adquirir , establezca los siguientes parámetros.
      Modo de adquisición: Transmisión a RAM
      Número de fotogramas: 480 (se puede reducir a 240 fotogramas para reducir el tiempo de imagen)
      Parámetros de la cámara: Adquisición de imágenes a velocidad de fotogramas
      Número (Nb) de fotogramas a omitir: 0
   2. En la pestaña Parámetros del controlador de cámara digital , defina los siguientes parámetros.
      Estado de la cámara: HALT
      Modo de obturador: ABRIR NUNCA
      Modo de borrado: CLEAR PRESEQUENCE
      Nº de fotogramas a promedio: 1
      NOTA 1: En el modo Stream, una vez ajustado el tiempo de exposición, la duración del vídeo viene determinada por el número de fotogramas. Por ejemplo, un tiempo de exposición de 500 ms y 480 fotogramas generan una película de 4 min. Se puede mostrar una vista previa durante la adquisición de la imagen.
7. Ajuste una región de interés (ROI) alrededor del objeto. Minimizar el área del ROI reduce el tiempo de adquisición.
8. Haga clic en Adquirir en la ventana Adquisición de transmisión para iniciar la película.
9. Guarde la película como un archivo .tif al final de la adquisición.
   NOTA: Para seguir las estructuras nucleares durante las películas de alta resolución temporal, las sondas nucleares (YFP-Rango y SRSF2-GFP) deben tener una alta relación señal-ruido para facilitar la segmentación de los objetos durante los pasos posteriores del análisis de imágenes. Los perfiles de expresión exógenos de SRSF2-GFP deben ser comparables a los de las inmunotinciones de motas nucleares endógenas (Figura 3C-D). Los cambios en los perfiles de expresión de SRSF2-GFP en relación con la tinción endógena pueden reflejar altas dosis de inyección y traducción de ARNc²⁶ (Figura 3C-D).

4. Análisis de imágenes: Agitación citoplasmática

NOTA: La agitación citoplasmática que refleja la intensidad de la actividad citoesquelética basada en actina en los ovocitos se determina mediante análisis de correlación de imágenes utilizando un software de una publicación anterior del laboratorio⁹ y disponible el²⁷. El software mide la cantidad de intensidades de píxeles que se conservan entre imágenes consecutivas. El resultado es la pérdida de correlación entre las imágenes en el tiempo, comenzando en 1 y disminuyendo exponencialmente con el tiempo, como en⁹.

1. Alinee imágenes de lapso de tiempo sin procesar (Δt = 0,5 s) utilizando el complemento Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Para instalar el complemento StackReg²⁸, habilite el sitio de actualización²⁹ de BIG-EPFL para obtener acceso al complemento.
2. Calcule las correlaciones de imágenes de campo claro en 3 a 4 regiones citoplasmáticas de ~300 μm² siguiendo los pasos a continuación.
   1. Recorte las regiones y guárdelas como archivos de película independientes. Abra la ventana Terminal.
   2. Escriba ovocito, presione la barra espaciadora y, a continuación, presione Entrar. Aparece una ventana llamada Señal y ranura. Elija los archivos de película recortados que se analizarán.
      NOTA: Se pueden seleccionar varias películas al mismo tiempo.
3. La aplicación devuelve archivos en la misma carpeta que las películas. Se generan tres archivos diferentes con extensiones .csv, .eps y .xls. El archivo .xls contiene los datos para dibujar las gráficas de correlación de una región. Valores de correlación promedio de diferentes regiones dentro de una celda.
4. Para fines de claridad visual, transforme los valores finales de correlación restando el valor de cada punto de tiempo de 1 para obtener una curva exponencial invertida como en ¹¹.

5. Análisis de imágenes: Mapas vectoriales citoplasmáticos

NOTA: Los mapas vectoriales de citoplasma de ovocitos de ratón fueron generados por el complemento³⁰ de espectroscopia de correlación de imágenes espaciotemporal (STICS) implementado previamente para detectar flujos citoplasmáticos en ovocitos^{de ratón 31} en Fiji ³² y disponible en ³³. Los mapas muestran la magnitud y dirección de la velocidad del flujo citoplasmático, como en⁹ y¹¹.

1. Convierta imágenes time-lapse de campo claro (Δt=0,5 s) a formato de 32 bits.
2. Vuelva a alinear las imágenes con el complemento Fiji StackReg en Complementos > StackReg y elija Transformación de cuerpo rígido .
3. Con la pila de complementos resta la media móvil jru v2 (en las herramientas Detrend de la suite de complementos STICS), deshazte de las estructuras estacionarias en la película restando la imagen promediada en el tiempo de la película. Marque las casillas Restar promedio estático y Subpila de salida, seleccione Mantener promedio espacial y establezca el período en 5.
4. Dibuja un ROI alrededor del ovocito, excluyendo la corteza para evitar los efectos de borde del complemento.
5. Inicie el complemento STICS map jru V2 (en herramientas ICS), con un tamaño de subregión de 32 píxeles, un tamaño de paso de 16 píxeles, un desplazamiento temporal STICS de 3, desplazamientos X e Y de 0, un multiplicador de velocidad de 8, un umbral de magnitud de 0 y casillas de verificación de Normalizar longitud de vector, Vectores centrales, Velocidades de salida y Usar máscara de película.
   NOTA: El plugin genera un mapa del ovocito en formato .tif, mostrando los flujos citoplasmáticos como vectores con colores que indican las amplitudes de flujo, como en⁹ y¹¹, y un archivo excel con las velocidades de flujo medidas.

6. Análisis de imágenes: Fluctuaciones del contorno nuclear

NOTA: Las fluctuaciones del contorno nuclear que reflejan la agitación de la membrana nuclear pueden determinarse a partir de películas de núcleos marcados con YFP-Rango (Figura 4A, C). El análisis de imágenes para las fluctuaciones del contorno nuclear requiere Fiji y la instalación de los complementos StackReg (habilitar el sitio de actualización BIG-EPFL²⁹ para obtener acceso al complemento StackReg), PureDenoise³⁴ y Ovocyte_nucleus. El complemento StackReg realiza el registro de imágenes para corregir un posible movimiento global. El plugin PureDenoise elimina el ruido de las imágenes multidimensionales corrompidas por el ruido mixto de Poisson-Gaussian y suaviza el contorno nuclear. El complemento Ovocyte_nucleus umbraliza la señal y llena el agujero correspondiente al nucléolo para crear una máscara de núcleo binario, realinearla con StackRreg y calcular la distancia r desde el centroide de la máscara del núcleo hasta la circunferencia de la máscara para todos los ángulos θ (θ° de 0° a 360° en incrementos de 1°), como en la Figura 4. Todos los códigos para estos complementos se pueden encontrar en ³⁵.

1. En Fiji, en el menú Plugins > CIRB > Verlhac , seleccione Forma de núcleo de ovocito.
2. En el cuadro de diálogo, realice la siguiente selección.
   1. Seleccione la carpeta que contiene las películas que desea analizar.
   2. Seleccione el ángulo θ (se puede elegir un valor de 1° a 360° y se utilizó un valor de 1° para una resolución óptima del contorno), los márgenes para el recorte (se recomienda 5 μm para mantener todo el núcleo).
   3. Seleccione la calibración XY y el intervalo de tiempo. Haga clic en Aceptar.
      NOTA: Los resultados se proporcionan como archivos .xls en una carpeta de salida en la carpeta que contiene las películas originales. Este archivo muestra todos los radios medidos para cada tiempo t y cada ángulo θ. En la Tabla complementaria 1 se proporciona un ejemplo de archivo de salida. La carpeta out también contiene una película de la máscara del núcleo.
3. Usando una hoja de cálculo, calcule el radio medio R en todos los puntos de tiempo t para cada ángulo θ definido. Esto permite trazar la forma media a lo largo del tiempo (Figura 4B). Véase el ejemplo de la Tabla Suplementaria 2.
4. Para cada t y θ, reste el radio medio R a lo largo del tiempo del radio r. La varianza (r-R)² es una medida de las fluctuaciones de la envoltura nuclear.
5. Calcule la media de las fluctuaciones para todos los puntos de tiempo t y todos los ángulos θ para cada núcleo y, finalmente, para todos los núcleos de una condición.
   NOTA: Cuando la forma de los núcleos se altera significativamente, como en el caso de un citoesqueleto alterado, los núcleos marcados con YFP-Rango se rotan en Fiji para orientar la parte lisa hacia arriba y la invaginación hacia abajo, antes de proceder con el análisis de las fluctuaciones del contorno nuclear, como en¹⁰.

7. Análisis de imágenes: Movimientos de moteado nuclear (dinámica difusiva)

NOTA: El análisis del movimiento de las motas nucleares permite deducir el tipo de dinámica (impulsada, difusiva o confinada) de esos orgánulos a partir de sus trazas.

1. Seleccione imágenes en modo de flujo de ovocitos que expresan gotitas de SRSF2-GFP que se mueven principalmente en el eje X-Y.
2. Corrección del blanqueamiento de imágenes time-lapse de ovocitos que expresan SRSF2- GFP utilizando el método de coincidencia de histogramas en Fiji (Imagen > Ajuste > Corrección de blanqueo).
3. Vuelva a alinear las imágenes con el complemento Fiji StackReg.
4. Realice un seguimiento de los centros de gotas SRSF2-GFP utilizando el complemento Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Presione Agregar pista para iniciar el seguimiento y presione Finalizar pista cuando haya terminado. No active la corrección de centrado.
5. Copie las pistas en un archivo de hoja de cálculo para continuar con los cálculos de desplazamientos cuadráticos medios (MSD) temporales como en ¹¹, y calcule los MSD temporales a partir de cada trayectoria de gota de 20 s.
6. Ajuste de curvas (msd(t) = beta x t^α) con el método de Nelder-Mead utilizando el software R para estimar el exponente de difusión alfa (α).
7. Medir el coeficiente de difusión efectiva para poder comparar las diferentes condiciones ya que se espera que la difusión sea anómala (α< 1).
8. Calcular el coeficiente de difusión efectivo D_eff a partir de un ajuste lineal (alfa=1) en los 40 primeros puntos (20 s) de la curva temporal MSD y normalizar por tamaño de gota (D_eff en μm²/s x 3/2 πr en μm).

8. Análisis de imágenes: Fluctuaciones de la superficie de las motas nucleares

NOTA: La evolución del contorno del moteado nuclear en el tiempo, una lectura de la transmisión de fuerza activa en estos orgánulos, se midió con un complemento personalizado Radioak³⁶ para su uso en Fiji y disponible en³⁷. El plugin extrae los valores de los radios de una selección dada para todos los ángulos alrededor del centro de selección. La variación de la forma a lo largo del tiempo se midió comparando el valor del radio en relación con su valor promedio para cada ángulo. El plugin permite cuantificar las fluctuaciones de forma y ofrece una opción para visualizar estas dinámicas. Para instalarlo, descargue el archivo Radioak_.jar y colóquelo en la carpeta de complementos de Fiji. Reinicie Fiji. Este complemento es una versión actualizada del complemento utilizado para analizar las fluctuaciones del esquema nuclear anterior e implementar una canalización comparable.

1. En las películas de flujo de gotas SRSF2-GFP, seleccione gotas más grandes de tamaños comparables (radio ~2,5 μm).
   NOTA: Si las gotas son demasiado pequeñas, una resolución insuficiente dará lugar a mediciones aberrantes de fluctuación de la superficie.
2. Recorte imágenes time-lapse de gotas que abarquen 15 s (Δt= 0,5 s) dibujando un rectángulo alrededor de la gota y seleccione Imagen > Recortar (Figura 5).
3. Vuelva a alinear las imágenes con el complemento Fiji StackReg en Complementos > StackReg y elija Transformación de cuerpo rígido .
4. Suavizar imagen para eliminar el ruido alrededor de la gota utilizando la opción Suavizar de Fiji en Procesar.
5. Cree una máscara binaria de gota usando la opción Convertir en máscara en Fiji en Procesar > binario. Utilice el método Predeterminado y Oscuro para el fondo (Figura 5).
6. Analice la máscara de gota binaria generada utilizando la opción Analizar partículas en Fiji en las opciones Analizar, seleccione Borrar resultados y Agregar al administrador y guarde la región de intereses (ROI) en el RoiManager (Más > Guardar) en formato zip para que Radioak la lea. Los ROI deben guardarse en una carpeta llamada contours en la misma carpeta de las películas, en archivos llamados imagename_UnetCortex.zip para que Radioak encuentre cada película.
7. En el menú Fiji Plugins > CIRB > Radioak , seleccione Obtener radios para procesar una sola película o Hacer una carpeta para analizar todas las películas de la misma carpeta.
   NOTA: Aparece una ventana para seleccionar el número de ángulo y la escala. Radioak se lanzó con incrementos de ángulo de 1° de 0° a 360° (entrada de 360) y se extrajeron los valores de los radios.
8. Seleccione la película o la carpeta que contiene las películas que desea analizar. Los resultados se proporcionan como archivos .xls (uno para cada película) en un directorio de radioakres en la carpeta que contiene las películas originales. Cada archivo muestra todos los radios medidos r (en μm si se rellenó el parámetro de escala) para cada tiempo t (en corte) y cada ángulo (en radianes; Figura 5; véase un ejemplo de .xls producto en el Cuadro suplementario 3).
9. En la hoja de cálculo, calcule el radio medio R en todos los puntos de tiempo t para cada ángulo definido (véase el ejemplo en la Tabla complementaria 4). Esto permite trazar la forma media a lo largo del tiempo.
10. Represente la varianza (r-R)² en μm² que corresponde a la medida de las fluctuaciones de la superficie de las gotas.

Resultados

Los paneles de imágenes de la Figura 3 muestran ejemplos de un ovocito adulto típico (Figura 3A), el nucleoplasma de un ovocito completamente desarrollado que expresa YFP-Rango (Figura 3B), el nucleoplasma de un ovocito completamente desarrollado que expresa un (panel izquierdo; Figura 3C) o un excesivo (panel derecho; Figura 3C) dosis de ARNc SRSF2-GFP, y una inmunotinci...

Discusión

Los pasos clave de este protocolo incluyen la microinyección adecuada de ovocitos sin afectar su supervivencia o función normal ^9,10,11, así como la microinyección de cantidades predefinidas de ARNc que permitan la correcta visualización de estructuras relevantes, como las motas nucleares.

Establecer el vínculo entre la dinámica citoplasmática y la dinámica (intra)nuclear es esencial cuando s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows