Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقوم بإنشاء نموذج الفئران لخلل الغدة الدمعية لتوفير أساس لدراسة جفاف العين المائي.

Abstract

جفاف العين المائي (ADDE) هو نوع من أمراض جفاف العين التي يمكن أن تؤدي إلى تقليل كمية ونوعية إفراز الدموع. يمكن أن يؤدي إنتاج الدموع غير الطبيعي لفترات طويلة إلى اضطراب في بيئة سطح العين ، بما في ذلك تلف القرنية والالتهاب. في الحالات الشديدة ، يمكن أن يسبب ADDE فقدان البصر أو حتى العمى. في الوقت الحالي ، يقتصر علاج جفاف العين على قطرات العين أو العلاج الطبيعي ، والذي يمكن أن يخفف فقط من أعراض عدم الراحة في العين ولا يمكنه علاج متلازمة العين الجافة بشكل أساسي. لاستعادة وظيفة الغدة الدمعية في جفاف العين ، أنشأنا نموذجا حيوانيا لخلل الغدة الدمعية في الفئران التي يسببها سكوبولامين. من خلال التقييم الشامل للغدة الدمعية والقرنيات والملتحمة وعوامل أخرى ، نهدف إلى توفير فهم كامل للتغيرات المرضية ل ADDE. بالمقارنة مع نموذج فأر العين الجافة الحالي ، يتضمن نموذج ADDE الحيواني هذا تقييما وظيفيا للغدة الدمعية ، مما يوفر منصة أفضل لدراسة خلل الغدة الدمعية في ADDE.

Introduction

بحلول عام 2021 ، يتأثر ما يقرب من 12٪ من الأشخاص بشكل كبير بجفاف العين1 ، مما يجعله أحد أكثر أمراض العيون المزمنة شيوعا. يمكن تقسيم جفاف العين إلى نوعين: العين الجافة التي تعاني من نقص مائي (ADDE) والعين الجافة التبخيرية (EDE)2 ، اعتمادا على العوامل المختلفة التي تؤثر على المرض. ينقسم ADDE أيضا إلى متلازمة سجوجرن (SS) وغير SS ، ولكن غالبية مرضى جفاف العين هم مرضى غير SS في السريرية3. تؤثر أعراض جفاف العين المزمنة بشكل خطير على الجودة البصرية للمرضى. حاليا ، يتضمن العلاج التقليدي لدائرة التنمية الاقتصادية تطبيق الدموع الاصطناعية لتليين سطح العين والعلاج الطبيعي للجفون. ومع ذلك، قد لا تقدم متلازمة العين الجافة علاجا كاملا في كثير من الحالات. لذلك ، فإن دراسة التسبب في مرض جفاف العين أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات وأدوية جديدة. توفر النماذج الحيوانية لمتلازمة العين الجافة أساسا لمزيد من البحث.

هناك العديد من الطرق لبناء نماذج حيوانية لمتلازمة العين الجافة4 ، بما في ذلك تغيير مستويات إفراز الدموع عن طريق تغيير مستويات الهرمون. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي إزالة خصيتي الفئران إلى تقليل إفراز الأندروجين ، وزيادة إفراز الدموع ، وتقليل تركيز المكون الإفرازي الحر (SC) و IgA في الدموع 5,6. طريقة أخرى هي الإشارة إلى تفاعلات المناعة الذاتية في الغدة الدمعية عن طريق إزالة أعصاب سطح العين التي تتحكم في الغدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق الحد المباشر من إفراز الدموع عن طريق إزالة الغدة الدمعية7 جراحيا. يمكن أن تؤدي الظروف البيئية المتغيرة أيضا إلى تسريع تبخر الدموع. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي استزراع في ظروف الرطوبة المنخفضة والتهوية الجافة إلى إنشاء نموذج للعين الجافة التبخيريةالمفرطة 8 ، والتي يمكن دمجها مع طرق أخرى لزيادة شدة جفاف العين. الأدوية الرئيسية المستخدمة للحث على النماذج التجريبية لجفاف العين هي الأتروبين والسكوبولامين9. كمثبطات السمبتاوي ، يمكن لكليهما أن يحفز الحصار الدوائي للمستقبلات الكولينية (المسكارينية) في الغدة الدمعية ويمنع إفراز الدموع. بالمقارنة مع جفاف العين الناجم عن حقن عضلات الأتروبين10 ، فإن سكوبولامين له تأثير مثبط أقوى على غدد الإفراز ، ومدة أطول من عمل الدواء ، وتأثيرات أضعف على عضلات القلب والأمعاء الصغيرة والشعب الهوائية الملساء. إنه أحد أكثر الأدوية نضجا لنماذج الجافة العين.

يمكن استخدام طرق مختلفة للحث على جفاف العين باستخدام سكوبولامين ، مثل الحقن تحت الجلد أو مضخة الدواء أو تطبيقالتصحيح 4،11،12. من أجل تقليل وتيرة إعطاء الدواء لحيوانات التجارب ، يطبق العديد من الباحثين بقع عبر الجلد على ذيول الفئران أو يستخدمون مضخات الدواء. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين لهما قيود. على سبيل المثال ، يجب أن يأخذ امتصاص البقع عبر الجلد في الاعتبار الامتصاص الفردي للفئران ، مما قد يؤدي إلى جرعة دواء غير متسقة. على الرغم من أن مضخات الدواء يمكنها التحكم بدقة في جرعة كل إدارة ، إلا أنها لا تتوافق دائما مع الدواء الذي يتم تسليمه أو التركيز المستخدم. كما يجب وضعها جراحيا - وهو أكثر توغلا للحيوان ، ويتطلب حدثا مخدرا ، وهناك احتمال حدوث مضاعفات ما بعد الجراحة مثل التفكك. الحقن تحت الجلد ، على الرغم من أنه أكثر تعقيدا ، يمكن أن يضمن جرعة دقيقة لكل إدارة والحفاظ على الاتساق في إدارة الدواء بين الفئران المختلفة. في الوقت نفسه ، لديها تكلفة أقل ومناسبة لإجراء عدد كبير من التجارب على.

تطبق هذه الدراسة الحقن المتكرر تحت الجلد من سكوبولامين لإنشاء نموذج فأر العين الجافة. نقوم بتحليل مؤشرات جفاف العين مثل عيوب القرنية ومستويات إفراز الدموع والتشكل المرضي للقرنية والملتحمة والغدة الدمعية. من خلال الجمع بين تركيز الدواء والمظاهر المرضية وأعراض جفاف العين ، فإننا نوضح بشكل أكبر نموذج فأر العين الجافة بالتفصيل ، مما يوفر بيانات تجريبية أكثر دقة لدراسة علاج جفاف العين والآليات المرضية. كما وصفنا عملية النمذجة بالتفصيل للباحثين في المستقبل.

Protocol

يتم إجراء جميع التجارب على التي يتم إجراؤها وفقا لهذا البروتوكول بموجب موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC).

1. إعداد

  1. قم بإعداد 12 فئران صحية من نوع SPF Wistar تبلغ من العمر 6 أسابيع تزن 160 جم ± 20 جم.
  2. استخدم مصباح الشق ومنظار العين لفحص حالات العين لجميع الفئران ، والتأكد من عدم وجود أمراض في الجزء الأمامي أو الشبكية.
  3. رفع جميع الفئران لمدة 1 أسبوع مع ما يكفي من الغذاء ومصادر المياه.
  4. قسمت جميع الفئران عشوائيا إلى مجموعات طبيعية ، وتركيز دواء سكوبولامين 2.5 مجم / مل ، وتركيز دواء سكوبولامين 5 مجم / مل ، وتركيز دواء سكوبولامين 7.5 مجم / مل ، مع ثلاثة في كل مجموعة.

2. إعداد الحل

  1. تحضير هيدروبروميد سكوبولامين عن طريق إذابته في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ لعمل محلول بتركيزات 7.5 ملغم / مل و 5 ملغم / مل و 2.5 ملغم / مل.
  2. تحضير محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ بدون هيدروبروميد سكوبولامين لاستخدامه كحقن لمجموعة التحكم من الفئران.

3. إعداد المعدات والمواد

  1. تحضير مجهر صغير.
  2. تحضير المواد للتجربة ، بما في ذلك حقنة 1 مل يمكن التخلص منها بإبرة (26 جم) ؛ شرائط الفلوريسئين الصوديوم للعيون. شريط اختبار المسيل للدموع شيرمر ؛ الإيثانول المطلق 4 ٪ بارافورمالدهيد. زيلين. بلسم محايد الهيماتوكسيلين ، يوزين. ومجموعة تلطيخ حمض شيف الدورية.

4. الحقن تحت الجلد

ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مساعدة من شخص ثان للمساعدة في تأمين الفئران.

  1. امسك جسم الجرذ بثبات وامسكه وامتد ساقيه الخلفيتين اليسرى (أو اليمنى).
    ملاحظة: يمكن أن يساعد المساعد في حمل.
  2. تنظيف موقع الحقن بالكحول.
  3. أدخل حقنة سعة 1 مل يمكن التخلص منها بإبرة (26 جم) في قاعدة طية الجلد بين الإبهام والإصبع.
  4. نضح المحقنة عن طريق سحب مكبس المحقنة. أي دم في المحقنة يشير إلى وضع إبرة غير لائق ؛ قم بإزالة الإبرة وإعادة وضعها.
  5. يتم تطبيق محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ مع أو بدون سكوبولامين هيدروبروميد بحركة سائلة ثابتة.
  6. حقن جميع الفئران وفقا لتركيزات مختلفة ، مع حقن 0.5 مل في كل مرة وأربع مرات يوميا (في الساعة 9:00 و 12:00 و 15:00 و 18:00) لفترة متتالية مدتها 19 يوما ، بالتناوب بين الأطراف اليسرى واليمنى.
    ملاحظة: يتم تسمية المجموعات على النحو التالي:
    مجموعة بدون هيدروبروميد سكوبولامين: 0 مجموعة (تحكم)
    المجموعة مع سكوبولامين هيدروبروميد 2.5 ملغ/مل: 2.5 مجموعة
    المجموعة مع سكوبولامين هيدروبروميد 5 ملغ / مل: 5 مجموعة
    المجموعة مع سكوبولامين هيدروبروميد 7.5 ملغم / مل: 7.5 مجموعة
  7. أعد إلى قفصه وراقب التنفس والسلوك لمدة 5-10 دقائق.

5. اختبار إفراز المسيل للدموع (اختبار شيرمر المسيل للدموع ، STT)

  1. قم بإنشاء شريط ورق ترشيح معدل للفئران11. اقطع نصف شريط ورق الترشيح المستخدم للبشر على طول خط الوسط (1 مم × 15 مم) ، وقم بقص رأس الشريط لجعله ناعما.
    ملاحظة: قبل إجراء اختبار إفراز الدموع ، قم بتقييد جسم الجرذ يدويا لمنع الحركة وضمان تعرض عيون الفئران.
  2. ضع شريط ورق الترشيح على 1/3 الخارجي من كيس الملتحمة السفلي للفئران.
  3. حدد وقت الاختبار لمدة 5 دقائق. السيطرة على إغلاق عيون الفئران طوال العملية.
  4. بعد القياس ، استخدم الملقط لتثبيت شريط ورق الترشيح في أنبوب طرد مركزي دقيق وتسجيل حجم المسيل للدموع عن طريق وضع علامة على جدار الأنبوب.
  5. قم بقياس إفراز الدموع في اليوم 0 واليوم 1 واليوم 3 واليوم 5 واليوم 7 واليوم 11 واليوم 15 واليوم 19.

6. تلطيخ القرنية الفلوريسئين

  1. إسقاط 0.5 ميكرولتر من محلول الصوديوم فلوريسئين 0.5 ٪ في كيس الملتحمة السفلي لكل فئران.
  2. راقب القرنية تحت الضوء الأزرق لمدة 3 دقائق بعد تقطير الفلوريسين.
  3. سجل تلطيخ مضان قرنية كل فأر ولاحظ ما إذا كان هناك عيب في القرنية.
  4. قم بإجراء تلطيخ فلوريسئين القرنية في اليوم 0 واليوم 1 واليوم 3 واليوم 5 واليوم 7 واليوم 11 واليوم 15 واليوم 19.

7. الملاحظة النسيجية لأنسجة الملتحمة

  1. بعد الانتهاء من تطوير النموذج ، قم بتخدير الفئران بعمق بحقن داخل الصفاق يبلغ 0.4 مل / 100 جم من 10٪ هيدرات الكلورال المائية لتخفيف توتر. ثم القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. خذ الملتحمة البصلية من نفس المناطق لكل فأر ، بحجم حوالي 2 مم × 2 مم.
  3. ثبت الأنسجة على الفور في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة وقم بتضمينها في البارافين13.
  4. قطع أقسام سمك 5 ميكرومتر وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين (HE)14 وحمض شيف الدوري (PAS) وصمة عار (اتبع تعليمات الشركة المصنعة).

8. الملاحظة النسيجية لأنسجة القرنية والغدة الدمعية

  1. بعد الانتهاء من تطوير النموذج ، القتل الرحيم للفأر كما هو موضح في الخطوة 7.1.
  2. خذ القرنية على الجانب الأيمن من كل فأر وقم بإصلاحه على الفور في محلول بارافورمالدهايد 4٪.
  3. قطع البشرة الرأسية والأنسجة تحت الجلد على طول الخط الذي يربط الأذن والزاوية الخارجية للعين ، وتوسيع شق لكلا الجانبين وزيادة عزل الغدة المدارية الصفراء الزائدة.
  4. قم بإزالة فراء الفئران تماما وفصل الغدة خارج الحجاج بمحلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪.
  5. ضع الغدد خارج الحجاج المعزولة في محلول بارافورمالدهايد 4٪ لمدة 24 ساعة وقم بتضمينها في البارافين.
  6. قطع المقاطع المستمرة بسمك ~ 5 ميكرومتر وتلطيخها ب HE لعينات أنسجة القرنية والغدة خارج الحجاج.

9. التحليل الإحصائي

  1. استخدام البرامج المناسبة للتحليل الإحصائي للبيانات.
    1. إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لتحليل البيانات واختبار الفرق الأقل أهمية (LSD) للمقارنة بين المجموعات. اضبط مستوى الدلالة الإحصائية على α = 0.05 ، مع P < 0.05 للإشارة إلى الأهمية الإحصائية.
      ملاحظة: تم استخدام برنامج SPSS 20 للتحليل الإحصائي للبيانات التجريبية.

النتائج

اختبار شيرمر الأول ، SIT I
تم قياس حجم دموع الفئران في الأيام 0 و 3 و 5 و 7 و 11 و 15 و 19 بعد بدء التجربة. أظهرت النتائج التجريبية أن إفراز الدموع لمجموعة سكوبولامين (مجموعة 2.5 ، مجموعة 5 ، مجموعة 7.5) ، مقارنة مع المجموعة الضابطة (مجموعة 0) ، انخفض بشكل ملحوظ ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (P < 0.01...

Discussion

العين الجافة التي تعاني من نقص مائي (ADDE) هي نوع مهم من جفاف العين ، حيث تمثل حوالي 1/3 من إجمالي عدد سكان العين الجافة17 ، والسبب الرئيسي ل ADDE هو الضرر المرضي للغدة الدمعيةوالالتهاب 13. بالنسبة لهذا النوع من جفاف العين ، فإن طرق العلاج السريري الأكثر شيوعا هي الدموع ال?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب محتمل في المصالح يتعلق بالأدوية والمواد المستخدمة في هذا الإجراء.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل التخصصات السريرية الرئيسية رفيعة المستوى لمقاطعة قوانغدونغ (SZGSP014) ومؤسسة شنتشن للعلوم الطبيعية (JCYJ20210324125805012).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% sodium chloride solutionSJZ No.4 PharmaceuticalH13023201
4% paraformaldehydeWuhan Servicebio Technology Co., LtdG1113
Absolute ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
Fluorescein sodium ophthalmic stripsTianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-YG-I
Hematoxylin and eosinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD006
Neutral balsamBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. G8590
ParaffinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining KitBeyotime BiotechnologyC0142S
Schirmer tear test stripsTianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., LtdYN-LZ-I
Scopolamine hydrobromideShanghai Macklin Biochemical Co., LtdS860151
Small animal microscopeHead Biotechnology Co,. LtdZM191
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10023418

References

  1. Papas, E. B. The global prevalence of dry eye disease: A Bayesian view. Ophthalmic Physiol Opt. 41 (6), 1254-1266 (2021).
  2. Sy, A., et al. Expert opinion in the management of aqueous deficient dry eye disease (DED). BMC Ophthalmol. 15 (1), 133 (2015).
  3. Seo, Y., et al. Activation of HIF-1alpha (hypoxia inducible factor-1alpha) prevents dry eye-induced acinar cell death in the lacrimal gland. Cell Death Dis. 5 (6), 1309 (2014).
  4. Rahman, M. M., Kim, D. H., Park, C. -. K., Kim, Y. H. Experimental models, induction protocols, and measured parameters in dry eye disease: Focusing on practical implications for experimental research. Int J Mol Sci. 22 (22), 12102 (2021).
  5. Sullivan, D. A., Bloch, K. J., Allansmith, M. R. Hormonal influence on the secretory immune system of the eye: androgen regulation of secretory component levels in rat tears. J Immunol. 132 (3), 1130-1135 (1984).
  6. Sullivan, D. A., Allansmith, M. R. Hormonal modulation of tear volume in the rat. Exp Eye Res. 42 (2), 131-139 (1986).
  7. Maitchouk, D. Y., Beuerman, R. W., Ohta, T., Stern, M., Varnell, R. J. Tear production after unilateral removal of the main lacrimal gland in squirrel monkeys. Arch Ophthalmol. 118 (2), 246-252 (2000).
  8. Barabino, S., et al. The controlled-environment chamber: a new mouse model of dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (8), 2766-2771 (2005).
  9. Viau, S., et al. Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (6), 857-867 (2008).
  10. Altinors, D. D., Bozbeyoglu, S., Karabay, G., Akova, Y. A. Evaluation of ocular surface changes in a rabbit dry eye model using a modified impression cytology technique. Curr Eye Res. 32 (4), 301-307 (2007).
  11. Daull, P., et al. Efficacy of a new topical cationic emulsion of cyclosporine A on dry eye clinical signs in an experimental mouse model of dry eye. Exp Eye Res. 153, 159-164 (2016).
  12. Dursun, D., et al. A mouse model of keratoconjunctivitis sicca. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (3), 632-638 (2002).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. 2008, (2008).
  14. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
  15. Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Sci Rep. 8 (1), 1483 (2018).
  16. Ramos, M. F., et al. Nonproliferative and Proliferative Lesions of the Rat and Mouse Special Sense Organs(Ocular [eye and glands], Olfactory and Otic). J Toxicol Pathol. 31, (2018).
  17. Stapleton, F., et al. TFOS DEWS II Epidemiology report. Ocul Surf. 15 (3), 334-365 (2017).
  18. Foulks, G. N., et al. Clinical guidelines for management of dry eye associated with Sjogren disease. Ocul Surf. 13 (2), 118-132 (2015).
  19. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Exp Ther Med. 22 (6), 1394 (2021).
  20. Brayer, J. B., Humphreys-Beher, M. G., Peck, A. B. Sjogren's syndrome: immunological response underlying the disease. Arch Immunol Ther Exp (Warsz. 49 (5), 353-360 (2001).
  21. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride). Mol Vis. 17, 257-264 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved