스코폴라민에 의해 유도된 눈물샘 기능 장애가 있는 쥐 안구건조증 모델

요약

여기에서는 눈물샘 기능 장애의 쥐 모델을 확립하여 수성 결핍성 안구건조증 연구의 기초를 제공합니다.

초록

수성 결핍성 안구건조증(ADDE)은 눈물 분비량과 질이 감소할 수 있는 안구건조증의 일종입니다. 비정상적인 눈물 생성이 장기화되면 각막 손상 및 염증을 포함한 안구 표면 환경의 교란을 유발할 수 있습니다. 심한 경우 ADDE는 시력 상실 또는 실명을 유발할 수 있습니다. 현재 안구건조증 치료는 안약이나 물리치료에 국한되어 있어 안구건조증을 근본적으로 치료할 수는 없을 뿐 안안약의 증상을 완화할 수는 없습니다. 안구건조증에서 눈물샘의 기능을 회복시키기 위해, 우리는 스코폴라민에 의해 유도된 쥐의 눈물샘 기능 장애에 대한 동물 모델을 만들었습니다. 눈물샘, 각막, 결막 및 기타 요인에 대한 포괄적인 평가를 통해 ADDE의 병리학적 변화에 대한 완전한 이해를 제공하는 것을 목표로 합니다. 현재의 안구건조증 마우스 모델과 비교했을 때, 이 ADDE 동물 모델에는 눈물샘의 기능적 평가가 포함되어 있어 ADDE의 눈물샘 기능 장애를 연구하기 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.

서문

2021년까지 약 12%의^{사람들이 안구}건조증을 심각하게 앓고 있으며1 이는 가장 흔한 만성 안과 질환 중 하나입니다. 안구건조증은 수성 결핍성 안구건조증(ADDE)과 증발성 안구건조증(EDE)²의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. ADDE는 쇼그렌 증후군(Sjögren's syndrome, SS)과 비SS(non-SS)로 나뉘는데, 대부분의 안구건조증 환자는 임상³에서 비SS 환자이다. 만성 안구건조증 증상은 환자의 시력에 심각한 영향을 미칩니다. 현재 기존의 안구 건조증 치료법은 인공 눈물을 사용하여 안구 표면을 윤활하고 눈꺼풀의 물리 치료를 포함합니다. 그러나 안구건조증은 많은 경우 완전한 치료법이 되지 않을 수 있습니다. 따라서 안구건조증의 발병기전을 연구하는 것은 새로운 치료법과 약물 개발에 매우 중요합니다. 안구건조증의 동물 모델은 추가 연구의 기초를 제공합니다.

안구건조증⁴의 동물 모델을 만드는 방법에는 호르몬 수치를 변화시켜 눈물 분비 수치를 변화시키는 여러 가지 방법이 있다. 예를 들어, 쥐의 고환을 제거하면 안드로겐 분비를 감소시키고 눈물 분비를 증가시키며 눈물 ^5,6에서 유리 분비 성분 (SC) 및 IgA의 농도를 감소시킬 수 있습니다. 또 다른 방법은 눈물샘을 조절하는 눈 표면 신경을 제거하여 눈물샘의 자가면역 반응을 나타내는 것입니다. 또한, 눈물샘을 외과적으로 제거함으로써 눈물 분비를 직접 감소시킬 수 있다⁷. 환경 조건의 변화도 눈물 증발을 가속화할 수 있습니다. 예를 들어, 습도가 낮고 환기가 잘 되지 않는 환경에서 동물을 배양하면 과도한 증발성 안구건조증 모델⁸을 만들 수 있으며, 이는 안구건조증의 중증도를 증가시키기 위해 다른 방법과 결합될 수 있다. 안구건조증 유발에 사용되는 주요 약물은 아트로핀(atropine)과 스코폴라민(scopolamine)이다⁹. 부교감신경 억제제로서 둘 다 눈물샘에서 콜린성(무스카린) 수용체의 약리학적 봉쇄를 유도하고 눈물 분비를 억제할 수 있습니다. 아트로핀 근육 주사로 인한 안구 건조증에 비해¹⁰ 스코폴라민은 분비선에 대한 억제 효과가 강하고 약물 작용 지속 시간이 길며 심장, 소장 및 기관지 평활근에 대한 효과가 약합니다. 안구건조증 동물 모델을 위한 가장 성숙한 약물 중 하나입니다.

스코폴라민으로 안구건조증을 유도하기 위해 피하주사, 약물 펌프 또는 패치 도포와 같은 다양한 방법을 사용할 수 있다 ^4,11,12. 실험 동물에 대한 약물 투여 빈도를 줄이기 위해 많은 연구자들은 쥐의 꼬리에 경피 패치를 적용하거나 약물 펌프를 사용합니다. 그러나 이 두 가지 방법 모두 한계가 있습니다. 예를 들어, 경피 패치의 흡수는 마우스의 개별 흡수를 고려해야 하며, 이는 일관되지 않은 약물 투여로 이어질 수 있습니다. 약물 펌프는 각 투여의 투여량을 정확하게 제어할 수 있지만 전달되는 약물 또는 사용되는 농도와 항상 호환되는 것은 아닙니다. 또한 외과적으로 배치해야 하는데, 이는 동물에게 더 침습적이고 마취 사건이 필요하며 탈구와 같은 수술 후 합병증이 발생할 가능성이 있습니다. 피하 주사는 더 번거롭지만 각 투여에 대한 정확한 투여량을 보장하고 다른 쥐 간의 약물 투여의 일관성을 유지할 수 있습니다. 동시에 비용이 저렴하고 많은 수의 동물 실험을 수행하는 데 적합합니다.

이 연구는 안구건조증 쥐 모델을 확립하기 위해 스코폴라민을 반복적으로 피하주사합니다. 각막 결손, 눈물 분비량, 각막, 결막, 눈물샘의 병리학적 형태 등 안구건조증 지표를 분석합니다. 약물 농도, 병리학적 증상 및 안구건조증 증상을 결합하여 안구건조증 쥐 모델을 더욱 자세히 설명하여 안구건조증 치료 및 병리학적 기전 연구를 위한 보다 정확한 실험 데이터를 제공합니다. 또한 미래의 연구자를 위해 모델링 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 따라 수행되는 모든 동물 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행됩니다.

1. 동물 준비

1. 160g ± 20g의 건강한 6주 된 SPF Wistar 암컷 쥐 12마리를 준비합니다.
2. 세극등과 검안경을 사용하여 모든 쥐의 눈 상태를 검사하여 전방 분절이나 망막 질환이 없는지 확인합니다.
3. 충분한 먹이와 물 공급원으로 1 주일 동안 모든 쥐를 키웁니다.
4. 모든 쥐를 정상 스코폴라민 약물 농도 2.5mg/mL, 스코폴라민 약물 농도 5mg/mL, 스코폴라민 약물 농도 7.5mg/mL 그룹으로 무작위로 나누고 각 그룹에 3마리의 동물을 배치했습니다.

2. 용액 준비

1. 스코폴라민 브로마이드를 0.9% 염화나트륨 용액에 녹여 7.5mg/mL, 5mg/mL 및 2.5mg/mL 농도의 용액을 만듭니다.
2. 쥐의 대조군을 위한 주사로 사용할 스코폴라민 하이드로브로마이드가 없는 0.9% 염화나트륨 용액을 준비합니다.

3. 장비 및 재료 준비

1. 작은 동물 현미경을 준비합니다.
2. 바늘이 있는 1mL 일회용 주사기(26G)를 포함하여 실험을 위한 재료를 준비합니다. 플루오레세인 나트륨 안과 스트립; 쉬르머 인열 시험지; 절대 에탄올; 4% 파라포름알데히드; 크실렌; 중립 발삼; 헤마톡실린, 에오신; 및 주기적인 acid-Schiff 염색 키트.

4. 피하주사

알림: 이 절차는 쥐를 고정하는 데 도움이 되는 두 번째 사람의 도움이 필요합니다.

1. 쥐의 몸을 안정적으로 잡고 왼쪽(또는 오른쪽) 뒷다리를 잡고 쭉 뻗습니다.
   알림: 보조자가 동물을 잡는 데 도움을 줄 수 있습니다.
2. 알코올로 주사 부위를 청소하십시오.
3. 바늘이 있는 일회용 주사기 1mL(26g)를 엄지와 손가락 사이의 피부 접힌 부분에 삽입합니다.
4. 주사기 플런저를 뒤로 당겨 주사기를 흡인합니다. 주사기에 혈액이 있으면 바늘 위치가 잘못되었음을 나타냅니다. 바늘을 제거하고 위치를 변경합니다.
5. 스코폴라민 하이드로브로마이드를 포함하거나 포함하지 않고 0.9% 염화나트륨 용액을 안정적이고 유동적인 동작으로 투여합니다.
6. 모든 쥐에게 매번 0.5mL를 주사하고 매일 4회(9:00, 12:00, 15:00, 18:00) 연속 19일 동안 좌우 팔다리를 번갈아 가며 주사합니다.
   참고: 그룹의 이름은 다음과 같습니다.
   스코폴라민 하이드로브로마이드가 없는 그룹: 0군(대조군)
   스코폴라민하이드로브로마이드 2.5mg/mL 함유군: 2.5군
   스코폴라민 하이드로브로마이드 5mg/mL 함유군: 5군
   스코폴라민 하이드로브로마이드 7.5mg/mL 함유군: 7.5군
7. 동물을 케이지로 돌려보내고 5-10분 동안 호흡과 행동을 모니터링합니다.

5. 눈물분비검사(Schirmer tear test, STT)

1. 쥐를 위한 수정된 여과지 스트립 만들기¹¹. 사람용 여과지 스트립의 절반을 중심선(1mm × 15mm)을 따라 자르고 스트립의 머리를 다듬어 매끄럽게 만듭니다.
   알림: 눈물 분비 검사를 수행하기 전에 쥐의 몸을 수동으로 제지하여 움직임을 방지하고 쥐의 눈이 노출되도록 하십시오.
2. 여과지 스트립을 쥐의 아래 눈꺼풀 결막낭의 바깥쪽 1/3에 놓습니다.
3. 테스트 시간을 5분 동안 측정합니다. 시술 내내 쥐의 눈을 감는 것을 제어하십시오.
4. 측정 후 핀셋을 사용하여 여과지 스트립을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 튜브 벽에 표시를 하여 눈물량을 기록합니다.
5. 0일, 1일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일, 19일에 눈물 분비를 측정합니다.

6. 각막 플루오레세인 염색

1. 0.5% 플루오레세인 나트륨 용액 0.5μL를 각 쥐의 하부 결막낭에 떨어뜨립니다.
2. 플루오레세인 점안 후 3분 동안 청색광 아래에서 각막을 관찰합니다.
3. 각 쥐의 각막에 대한 형광 염색을 기록하고 각막 결함이 있는지 관찰합니다.
4. 0일, 1일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일, 19일에 각막 플루오레세인 염색을 수행합니다.

7. 결막 조직의 조직학적 관찰

1. 모델 개발을 완료한 후 동물의 긴장을 완화하기 위해 10% 수성 클로랄 수화물 0.4mL/100g의 복강 내 주사로 쥐를 깊이 마취합니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다.
2. 각 쥐의 동일한 영역에서 약 2mm x 2mm 크기의 구근 결막을 채취합니다.
3. 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 즉시 조직을 고정하고 파라핀¹³에 삽입합니다.
4. 5μm 두께의 절편을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(HE)¹⁴ 및 주기적 산-쉬프(PAS) 염색으로 염색합니다(제조업체의 지침을 따름).

8. 각막 및 눈물샘 조직의 조직학적 관찰

1. 모델 개발을 완료한 후 7.1단계에서 설명한 대로 쥐를 안락사시킵니다.
2. 각 쥐의 오른쪽에 있는 각막을 채취하여 4% 파라포름알데히드 용액에 즉시 고정합니다.
3. 귀와 눈초리를 연결하는 선을 따라 두부 표피와 피하 조직을 자르고 절개 부위를 양쪽으로 확장하여 황색을 띤 여분의 안와선을 더 분리합니다.
4. 쥐의 털을 완전히 제거하고 0.9% 염화나트륨 용액으로 안와외 분비샘을 분리합니다.
5. 분리된 안와외 땀샘을 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 동안 넣고 파라핀에 넣습니다.
6. ~5μm 두께의 연속 절편을 절단하고 각막 및 안와외 동맥 조직 표본을 위해 HE로 염색합니다.

9. 통계 분석

1. 데이터의 통계 분석을 위해 적절한 소프트웨어를 사용하십시오.
   1. 데이터를 분석하기 위해 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행하고 그룹 간 비교를 위해 최하위 차이 검정(LSD)을 수행합니다. 통계적 유의성 수준을 α = 0.05로 설정하고 P < 0.05는 통계적 유의성을 나타냅니다.
      참고: SPSS 20 소프트웨어는 실험 데이터의 통계 분석을 위해 사용되었습니다.

결과

Schirmer I 테스트, SIT I
쥐의 눈물량은 실험 시작 후 0일, 3일, 5일, 7일, 11일, 15일, 19일에 측정되었습니다. 실험 결과, 스코폴라민 투여군(2.5군, 5군, 7.5군)의 눈물분비는 대조군(0군)에 비해 유의하게 감소하였으며, 그 차이는 통계적으로 유의하였다(P < 0.01). 2.5군, 5군, 7.5군에서는 통계적 유의성이 없었다(P > 0.05). 일수(P > 0.05)에 있어서는 서로 다른 그룹 간에 유의한 차이가 관찰되지 않?...

토론

수성 결핍성 안구건조증(ADDE)은 전체 안구건조증 인구의 약 1/3을 차지하는 중요한 유형의 안구건조증이며¹⁷ ADDE의 주요 원인은 눈물샘 병리학적 손상과 염증이다¹³. 이러한 유형의 안구건조증의 경우 가장 일반적인 임상 치료 방법은 증상을 완화하기 위한 인공눈물이나 스테로이드 또는 사이클로스포린의 국소 도포입니다¹⁸ 반면, 눈물샘 손상?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418