Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

Resumo

Aqui, estabelecemos um modelo de disfunção da glândula lacrimal em ratos para fornecer uma base para o estudo do olho seco aquoso-deficiente.

Resumo

O olho seco aquoso-deficiente (ADDE) é um tipo de doença do olho seco que pode resultar na redução da quantidade e qualidade da secreção lacrimal. A produção anormal prolongada de lágrimas pode levar a um distúrbio no ambiente da superfície ocular, incluindo danos na córnea e inflamação. Em casos graves, o ADDE pode causar perda de visão ou até cegueira. Atualmente, o tratamento do olho seco é limitado a colírios ou fisioterapia, que só podem aliviar os sintomas de desconforto ocular e não podem fundamentalmente curar a síndrome do olho seco. Para restaurar a função da glândula lacrimal no olho seco, criamos um modelo animal de disfunção da glândula lacrimal em ratos induzida por escopolamina. Através da avaliação abrangente da glândula lacrimal, córneas, conjuntivas e outros fatores, pretendemos fornecer uma compreensão completa das alterações patológicas do ADDE. Comparado com o modelo atual de olho seco em camundongos, este modelo animal de ADDE inclui uma avaliação funcional da glândula lacrimal, fornecendo uma melhor plataforma para estudar a disfunção da glândula lacrimal no ADDE.

Introdução

Em 2021, aproximadamente 12% das pessoas são significativamente afetadas pelo olho seco¹, tornando-se uma das doenças oculares crônicas mais comuns. O olho seco pode ser dividido em dois tipos: olho seco aquoso-deficiente (ADDE) e olho seco evaporativo (EDE)², dependendo dos diferentes fatores que afetam a doença. O ADDE é subdividido em síndrome de Sjögren (SS) e não-SS, mas a maioria dos pacientes com olho seco são pacientes não SS na clínica³. Os sintomas crônicos de olho seco afetam seriamente a qualidade visual dos pacientes. Atualmente, o tratamento convencional da DED envolve a aplicação de lágrimas artificiais para lubrificar a superfície ocular e fisioterapia das pálpebras. No entanto, a síndrome do olho seco pode não oferecer uma cura completa em muitos casos. Portanto, estudar a patogênese da doença do olho seco é crucial para o desenvolvimento de novas terapias e drogas. Modelos animais da síndrome do olho seco fornecem uma base para pesquisas futuras.

Existem muitas maneiras de construir modelos animais da síndrome do olho seco⁴, incluindo a alteração dos níveis de secreção lacrimal alterando os níveis hormonais. Por exemplo, a remoção dos testículos de ratos pode reduzir a secreção androgênica, aumentar a secreção lacrimal e diminuir a concentração de componente secretor livre (CS) e IgA nas lágrimas ^5,6. Outro método é indicar reações autoimunes na glândula lacrimal, removendo os nervos da superfície ocular que controlam a glândula. Além disso, a redução direta da secreção lacrimal pode ser obtida com a remoção cirúrgica da glândula lacrimal⁷. A mudança das condições ambientais também pode acelerar a evaporação da lágrima. Por exemplo, a cultura de animais em condições de baixa umidade e ventilação seca pode estabelecer um modelo de olho seco evaporativo excessivo⁸, que pode ser combinado com outros métodos para aumentar a severidade do olho seco. Os principais fármacos utilizados para induzir modelos experimentais de olho seco são a atropina e a^{escopolamina9}. Como inibidores parassimpáticos, ambos podem induzir bloqueio farmacológico dos receptores colinérgicos (muscarínicos) na glândula lacrimal e inibir a secreção lacrimal. Em comparação com os olhos secos causados pela injeção do músculo atropina¹⁰, a escopolamina tem um efeito inibitório mais forte sobre as glândulas de secreção, uma duração mais longa da ação da droga e efeitos mais fracos sobre os músculos cardíacos, intestino delgado e lisos brônquicos. É uma das drogas mais maduras para modelos animais de olho seco.

Diferentes métodos podem ser utilizados para induzir o olho seco com escopolamina, como injeção subcutânea, bomba de fármaco ou aplicação de adesivos ^4,11,12. A fim de reduzir a frequência de administração de drogas a animais experimentais, muitos pesquisadores aplicam adesivos transdérmicos na cauda de camundongos ou usam bombas de drogas. No entanto, ambos os métodos têm limitações. Por exemplo, a absorção de adesivos transdérmicos precisa levar em conta a absorção individual de camundongos, o que pode levar a uma dosagem inconsistente da droga. Embora as bombas de fármacos possam controlar com precisão a dosagem de cada administração, nem sempre são compatíveis com o fármaco que está sendo administrado ou com a concentração que está sendo utilizada. Eles também precisam ser colocados cirurgicamente – o que é mais invasivo para o animal, exigindo um evento anestésico, e há potencial para complicações pós-cirúrgicas, como deiscências. A injeção subcutânea, embora mais pesada, pode garantir a dosagem precisa para cada administração e manter a consistência na administração do medicamento entre diferentes ratos. Ao mesmo tempo, tem um custo mais baixo e é adequado para a realização de um grande número de experimentos com animais.

Este estudo aplica repetidas injeções subcutâneas de escopolamina para estabelecer um modelo de olho seco em ratos. Analisamos indicadores de olho seco como defeitos corneanos, níveis de secreção lacrimal e morfologia patológica da córnea, conjuntiva e glândula lacrimal. Ao combinar concentração de drogas, manifestações patológicas e sintomas de olho seco, elaboramos o modelo de rato de olho seco em detalhes, fornecendo dados experimentais mais precisos para o estudo do tratamento do olho seco e mecanismos patológicos. Também descrevemos o processo de modelagem em detalhes para futuros pesquisadores.

Protocolo

Todos os experimentos com animais realizados seguindo este protocolo são realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Preparo dos animais

1. Preparar 12 ratas Wistar saudáveis com FPS de 6 semanas de idade, pesando 160 g ± 20 g.
2. Use uma lâmpada de fenda e oftalmoscópio para examinar as condições oculares de todos os ratos, garantindo que não haja doenças do segmento anterior ou da retina.
3. Crie todos os ratos por 1 semana com fontes suficientes de comida e água.
4. Todos os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos normais, concentração da droga escopolamina 2,5 mg/mL, concentração da droga escopolamina 5 mg/mL e concentração da droga escopolamina 7,5 mg/mL, com três animais em cada grupo.

2. Preparação da solução

1. Preparar o brometo de escopolamina dissolvendo em solução de cloreto de sódio a 0,9% para fazer uma solução com concentrações de 7,5 mg/mL, 5 mg/mL e 2,5 mg/mL.
2. Preparar uma solução de cloreto de sódio a 0,9% sem brometo de escopolamina para ser utilizada como injeção para o grupo de controlo de ratos.

3. Preparação de equipamentos e materiais

1. Prepare um microscópio de pequenos animais.
2. Preparar materiais para o experimento, incluindo seringa descartável de 1 mL com agulha (26 G); fitas oftálmicas de fluoresceína sódica; Tira teste lacrimal de Schirmer; etanol absoluto; paraformaldeído a 4%; xileno; bálsamo neutro; hematoxilina, eosina; e kit de coloração com ácido periódico de Schiff.

4. Injeção subcutânea

NOTA: Este procedimento requer assistência de uma segunda pessoa para ajudar a proteger os ratos.

1. Segure o corpo do rato firme e pegue e estique suas patas traseiras esquerdas (ou direitas).
   OBS: Um auxiliar pode ajudar na segurar o animal.
2. Limpe o local de injeção com álcool.
3. Inserir 1 mL de seringa descartável com agulha (26 G) na base da dobra cutânea entre o polegar e o dedo.
4. Aspirar a seringa puxando para trás o êmbolo da seringa. Qualquer sangue na seringa indica colocação inadequada da agulha; Retire e reposicione a agulha.
5. Administrar solução de cloreto de sódio a 0,9% com ou sem brometo de escopolamina num movimento constante e fluido.
6. Injetar todos os ratos de acordo com diferentes concentrações, com 0,5 mL injetado cada vez e quatro vezes ao dia (às 9:00, 12:00, 15:00 e 18:00) por um período consecutivo de 19 dias, alternando entre os membros esquerdo e direito.
   Observação : os grupos são nomeados da seguinte maneira:
   Grupo sem brometo de escopolamina: 0 grupo (controle)
   Grupo com brometo de escopolamina 2,5 mg/mL: grupo 2,5
   Grupo com brometo de escopolamina 5 mg/mL: grupo 5
   Grupo com brometo de escopolamina 7,5 mg/mL: grupo 7,5
7. Retornar o animal à sua gaiola e monitorar a respiração e o comportamento por 5-10 min.

5. Teste de secreção lacrimal (teste lacrimal de Schirmer, STT)

1. Crie uma tira de papel de filtro modificada para ratos¹¹. Corte metade da tira de papel de filtro usada para humanos ao longo da linha central (1 mm × 15 mm) e corte a cabeça da tira para torná-la lisa.
   NOTA: Antes de realizar o teste de secreção lacrimal, restrinja manualmente o corpo do rato para evitar o movimento e garantir a exposição dos olhos do rato.
2. Coloque a tira de papel filtro no 1/3 externo do saco conjuntival da pálpebra inferior do rato.
3. Cronometre o teste por 5 min. Controle o fechamento dos olhos do rato durante todo o procedimento.
4. Após a medição, use uma pinça para prender a tira de papel de filtro em um tubo de microcentrífuga e registre o volume de rasgo fazendo uma marca na parede do tubo.
5. Medir a secreção lacrimal no dia 0, dia 1, dia 3, dia 5, dia 7, dia 11, dia 15 e dia 19.

6. Coloração de fluoresceína da córnea

1. Lançar 0,5 μL de solução de fluoresceína sódica a 0,5% no saco conjuntival inferior de cada rato.
2. Observe a córnea sob luz azul por 3 min após a instilação de fluoresceína.
3. Registre a coloração de fluorescência da córnea de cada rato e observe se há um defeito corneano.
4. Realizar coloração de fluoresceína corneana no dia 0, dia 1, dia 3, dia 5, dia 7, dia 11, dia 15 e dia 19.

7. Observação histológica do tecido conjuntival

1. Após completar o desenvolvimento do modelo, anestesiar profundamente os ratos com uma injeção intraperitoneal de 0,4 mL/100 g de hidrato aquoso de cloral a 10% para aliviar a tensão dos animais. Em seguida, eutanasiar os ratos por deslocamento cervical.
2. Tomar a conjuntiva bulbar das mesmas regiões de cada rato, com um tamanho de aproximadamente 2 mm x 2 mm.
3. Fixar os tecidos imediatamente em paraformaldeído a 4% por 24 h e embutir em parafina¹³.
4. Cortar cortes de 5 μm de espessura e corar com hematoxilina e eosina (HE)¹⁴ e ácido periódico de Schiff (PAS) (seguir as instruções do fabricante).

8. Observação histológica do tecido da córnea e glândula lacrimal

1. Após completar o desenvolvimento do modelo, eutanasiar o rato conforme descrito na etapa 7.1.
2. Pegue a córnea do lado direito de cada rato e fixe-a imediatamente em solução de paraformaldeído a 4%.
3. Cortar a epiderme cefálica e o tecido subcutâneo ao longo da linha que liga a orelha e o canto externo do olho, expandir a incisão para ambos os lados e isolar ainda mais a glândula orbital extra amarelada.
4. Remova completamente o pelo do rato e separe a glândula extraorbital com solução de cloreto de sódio a 0,9%.
5. Colocar as glândulas extraorbitais isoladas em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h e embutir em parafina.
6. Cortar cortes contínuos de ~5 μm de espessura e corá-los com HE para espécimes de tecido da córnea e da glândula extraorbital.

9. Análise estatística

1. Utilizar software apropriado para análise estatística dos dados.
   1. Realizar análise de variância (ANOVA) one-way para análise dos dados e o teste de diferença mínima significativa (LSD) para comparação entre os grupos. Estabeleceu-se o nível de significância estatística em α = 0,05, com P < 0,05 indicando significância estatística.
      OBS: O software SPSS 20 foi utilizado para análise estatística dos dados experimentais.

Resultados

Teste Schirmer I, SIT I
O volume lacrimal dos ratos foi medido nos dias 0, 3, 5, 7, 11, 15 e 19 após o início do experimento. Os resultados experimentais mostraram que a secreção lacrimal do grupo escopolamina (grupo 2,5, grupo 5, grupo 7,5), em comparação com o grupo controle (grupo 0), estava significativamente diminuída, e a diferença foi estatisticamente significativa (P < 0,01). Não houve significância estatística entre os grupos 2,5, 5 e 7,5 (P > 0,05). Não houve diferença significa...

Discussão

O olho seco aquoso-deficiente (EDDA) é um importante tipo de olho seco, correspondendo a cerca de 1/3 da população total de olho^seco17, e a principal causa de EDDA é o dano patológico e a inflamação da glândula lacrimal¹³. Para esse tipo de olho seco, os métodos de tratamento clínico mais comuns são as lágrimas artificiais para aliviar os sintomas ou a aplicação tópica de esteroides ou ciclosporina¹⁸, enquanto há poucas opções de tr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418