Ein Rattenmodell für trockenes Auge mit durch Scopolamin induzierter Funktionsstörung der Tränendrüse

Zusammenfassung

Hier etablieren wir ein Rattenmodell der Tränendrüsendysfunktion, um eine Grundlage für die Untersuchung des wässrig-defizienten trockenen Auges zu schaffen.

Zusammenfassung

Das wässrig-defiziente trockene Auge (ADDE) ist eine Art von Erkrankung des trockenen Auges, die zu einer Verringerung der Quantität und Qualität der Tränensekretion führen kann. Eine längere abnormale Tränenproduktion kann zu einer Störung der Augenoberfläche führen, einschließlich Hornhautschäden und Entzündungen. In schweren Fällen kann ADDE zu Sehverlust oder sogar Erblindung führen. Derzeit beschränkt sich die Behandlung des trockenen Auges auf Augentropfen oder Physiotherapie, die nur die Symptome von Augenbeschwerden lindern und das Syndrom des trockenen Auges nicht grundlegend heilen können. Um die Funktion der Tränendrüse bei trockenem Auge wiederherzustellen, haben wir ein Tiermodell der durch Scopolamin induzierten Tränendrüsenfunktionsstörung bei Ratten erstellt. Durch die umfassende Bewertung der Tränendrüse, der Hornhaut, der Bindehaut und anderer Faktoren wollen wir ein vollständiges Verständnis der pathologischen Veränderungen der ADDE vermitteln. Im Vergleich zum aktuellen Mausmodell für trockene Augen enthält dieses ADDE-Tiermodell eine funktionelle Bewertung der Tränendrüse und bietet eine bessere Plattform für die Untersuchung der Tränendrüsenfunktionsstörung bei ADDE.

Einleitung

Bis 2021 sind etwa 12 % der Menschen erheblich von trockenen Augen^{betroffen 1}, was sie zu einer der häufigsten chronischen Augenkrankheiten macht. Trockenes Auge kann in zwei Arten unterteilt werden: Kammerwassermangel trockenes Auge (ADDE) und verdunstungsarmes trockenes Auge (EDE)², abhängig von den verschiedenen Faktoren, die die Krankheit beeinflussen. ADDE wird weiter in Sjögren-Syndrom (SS) und Nicht-SS unterteilt, aber die Mehrheit der Patienten mit trockenem Auge sind Nicht-SS-Patienten in Klinik³. Chronische Symptome des trockenen Auges beeinträchtigen die Sehqualität der Patienten erheblich. Derzeit umfasst die konventionelle Behandlung von DED die Anwendung künstlicher Tränen zur Befeuchtung der Augenoberfläche und die physikalische Therapie der Augenlider. Das Syndrom des trockenen Auges bietet jedoch in vielen Fällen möglicherweise keine vollständige Heilung. Daher ist die Untersuchung der Pathogenese des trockenen Auges für die Entwicklung neuer Therapien und Medikamente von entscheidender Bedeutung. Tiermodelle des Syndroms des trockenen Auges bilden eine Grundlage für weitere Forschungen.

Es gibt viele Möglichkeiten, Tiermodelle für das Syndrom des trockenen Auges⁴ zu konstruieren, einschließlich der Änderung der Tränensekretion durch Veränderung des Hormonspiegels. Beispielsweise kann das Entfernen der Hoden von Ratten die Androgensekretion reduzieren, die Tränensekretion erhöhen und die Konzentration der freien sekretorischen Komponente (SC) und IgA in Tränen verringern ^5,6. Eine andere Methode besteht darin, Autoimmunreaktionen in der Tränendrüse anzuzeigen, indem die Nerven der Augenoberfläche entfernt werden, die die Drüse steuern. Zusätzlich kann eine direkte Reduzierung der Tränensekretion durch chirurgische Entfernung der Tränendrüse^{erreicht werden 7}. Wechselnde Umgebungsbedingungen können auch die Tränenverdunstung beschleunigen. Beispielsweise kann die Kultivierung von Tieren bei niedriger Luftfeuchtigkeit und trockener Belüftung ein Modell für übermäßige Verdunstung des trockenen Auges⁸ erstellen, das mit anderen Methoden kombiniert werden kann, um den Schweregrad des trockenen Auges zu erhöhen. Die wichtigsten Medikamente, die zur Induktion von experimentellen Modellen für trockene Augen verwendet werden, sind Atropin und Scopolamin⁹. Als parasympathische Inhibitoren können beide eine pharmakologische Blockade cholinerger (muskarinischer) Rezeptoren in der Tränendrüse induzieren und die Tränensekretion hemmen. Im Vergleich zu trockenen Augen, die durch Atropin-Muskelinjektion verursacht werden¹⁰, hat Scopolamin eine stärkere hemmende Wirkung auf die Sekretdrüsen, eine längere Wirkungsdauer des Arzneimittels und eine schwächere Wirkung auf die glatte Herz-, Darm- und Bronchialmuskulatur. Es ist eines der ausgereiftesten Medikamente für Tiermodelle mit trockenen Augen.

Es können verschiedene Methoden verwendet werden, um trockene Augen mit Scopolamin zu induzieren, wie z. B. subkutane Injektion, Medikamentenpumpe oder Pflasteranwendung ^4,11,12. Um die Häufigkeit der Medikamentenverabreichung an Versuchstiere zu reduzieren, bringen viele Forscher transdermale Pflaster an den Schwänzen von Mäusen an oder verwenden Medikamentenpumpen. Beide Methoden haben jedoch Einschränkungen. Beispielsweise muss die Resorption von transdermalen Pflastern die individuelle Resorption von Mäusen berücksichtigen, was zu einer inkonsistenten Medikamentendosierung führen kann. Obwohl Medikamentenpumpen die Dosierung jeder Verabreichung genau steuern können, sind sie nicht immer mit dem verabreichten Medikament oder der verwendeten Konzentration kompatibel. Sie müssen auch chirurgisch platziert werden – was für das Tier invasiver ist, eine Anästhesie erfordert und es besteht die Möglichkeit von postoperativen Komplikationen wie Dehiszenz. Die subkutane Injektion ist zwar umständlicher, kann aber eine genaue Dosierung für jede Verabreichung sicherstellen und die Konsistenz der Arzneimittelverabreichung bei verschiedenen Ratten aufrechterhalten. Gleichzeitig hat es geringere Kosten und eignet sich für die Durchführung einer Vielzahl von Tierversuchen.

In dieser Studie wird wiederholte subkutane Injektion von Scopolamin angewendet, um ein Rattenmodell mit trockenem Auge zu etablieren. Wir analysieren Indikatoren für trockene Augen wie Hornhautdefekte, Tränensekretion und pathologische Morphologie der Hornhaut, der Bindehaut und der Tränendrüse. Durch die Kombination von Arzneimittelkonzentration, pathologischen Manifestationen und Symptomen des trockenen Auges führen wir das Modell der Ratte mit trockenen Augen weiter im Detail aus und liefern genauere experimentelle Daten für die Untersuchung der Behandlung des trockenen Auges und pathologischer Mechanismen. Wir beschreiben auch den Modellierungsprozess für zukünftige Forscher im Detail.

Protokoll

Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, werden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Tierische Vorbereitung

1. Bereiten Sie 12 gesunde, 6 Wochen alte Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 160 g ± 20 g vor.
2. Verwenden Sie eine Spaltlampe und ein Ophthalmoskop, um den Augenzustand aller Ratten zu untersuchen und sicherzustellen, dass keine Erkrankungen des vorderen Augenabschnitts oder der Netzhaut vorliegen.
3. Ziehen Sie alle Ratten 1 Woche lang mit ausreichenden Nahrungs- und Wasserquellen auf.
4. Alle Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in normale Gruppen mit einer Scopolamin-Wirkstoffkonzentration von 2,5 mg / ml, einer Scopolamin-Wirkstoffkonzentration von 5 mg / ml und einer Scopolamin-Wirkstoffkonzentration von 7,5 mg / ml mit drei Tieren in jeder Gruppe eingeteilt.

2. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie Scopolamin Hydrobromid vor, indem Sie es in 0,9% iger Natriumchloridlösung auflösen, um eine Lösung mit Konzentrationen von 7,5 mg/ml, 5 mg/ml und 2,5 mg/ml herzustellen.
2. Bereiten Sie eine 0,9% ige Natriumchloridlösung ohne Scopolaminhydrobromid vor, die als Injektion für die Kontrollgruppe von Ratten verwendet wird.

3. Ausrüstungs- und Materialvorbereitung

1. Bereiten Sie ein Kleintiermikroskop vor.
2. Bereiten Sie Materialien für das Experiment vor, einschließlich 1 ml Einwegspritze mit Nadel (26 g); Fluorescein-Natrium-Augenstreifen; Schirmer-Tränenteststreifen; absolutes Ethanol; 4% Paraformaldehyd; Xylol; neutraler Balsam; Hämatoxylin, Eosin; und periodisches Säure-Schiff-Färbekit.

4. Subkutane Injektion

HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert die Unterstützung einer zweiten Person, um die Ratten zu sichern.

1. Halten Sie den Körper der Ratte ruhig und fangen und strecken Sie ihre linken (oder rechten) Hinterbeine.
   HINWEIS: Ein Assistent kann beim Halten des Tieres helfen.
2. Injektionsstelle mit Alkohol reinigen.
3. Führen Sie 1 ml Einmalspritze mit Nadel (26 g) an der Basis der Hautfalte zwischen Daumen und Finger ein.
4. Saugen Sie die Spritze an, indem Sie den Spritzenkolben zurückziehen. Jegliches Blut in der Spritze weist auf eine unsachgemäße Platzierung der Nadel hin; Entfernen Sie die Nadel und positionieren Sie sie neu.
5. Verabreichen Sie 0,9% ige Natriumchloridlösung mit oder ohne Scopolaminhydrobromid in einer gleichmäßigen, flüssigen Bewegung.
6. Injizieren Sie alle Ratten in unterschiedlichen Konzentrationen, wobei jedes Mal und viermal täglich (um 9:00, 12:00, 15:00 und 18:00 Uhr) über einen aufeinanderfolgenden Zeitraum von 19 Tagen abwechselnd 0,5 ml injiziert werden.
   HINWEIS: Die Gruppen werden wie folgt benannt:
   Gruppe ohne Scopolamin Hydrobromid: 0 Gruppe (Kontrolle)
   Gruppe mit Scopolamin Hydrobromid 2,5 mg/ml: 2,5 Gruppe
   Gruppe mit Scopolamin Hydrobromid 5 mg/ml: 5 Gruppe
   Gruppe mit Scopolamin Hydrobromid 7,5 mg/ml: 7,5 Gruppe
7. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und überwachen Sie Atmung und Verhalten für 5-10 Minuten.

5. Tränensekretionstest (Schirmer-Tränentest, STT)

1. Erstellen Sie einen modifizierten Filterpapierstreifen für Ratten¹¹. Schneiden Sie die Hälfte des für den Menschen verwendeten Filterpapierstreifens entlang der Mittellinie (1 mm × 15 mm) ab und schneiden Sie den Kopf des Streifens ab, um ihn glatt zu machen.
   HINWEIS: Halten Sie vor der Durchführung des Tränensekretionstests den Körper der Ratte manuell fest, um Bewegungen zu verhindern und sicherzustellen, dass die Augen der Ratte freigelegt werden.
2. Legen Sie den Filterpapierstreifen auf das äußere 1/3 des Bindehautsacks des unteren Augenlids der Ratte.
3. Planen Sie den Test für 5 Minuten. Kontrollieren Sie das Schließen der Augen der Ratte während des gesamten Eingriffs.
4. Klemmen Sie den Filterpapierstreifen nach der Messung mit einer Pinzette in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zeichnen Sie das Tränenvolumen auf, indem Sie eine Markierung an der Wand des Röhrchens anbringen.
5. Messen Sie die Tränensekretion an Tag 0, Tag 1, Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 11, Tag 15 und Tag 19.

6. Hornhaut-Fluorescein-Färbung

1. Tropfen Sie 0,5 μl 0,5%ige Fluorescein-Natriumlösung in den unteren Bindehautsack jeder Ratte.
2. Beobachten Sie die Hornhaut nach der Fluorescein-Instillation 3 Minuten lang unter blauem Licht.
3. Zeichnen Sie die Fluoreszenzfärbung der Hornhaut jeder Ratte auf und beobachten Sie, ob ein Hornhautdefekt vorliegt.
4. Führen Sie die Hornhautfluoreszeinfärbung an Tag 0, Tag 1, Tag 3, Tag 5, Tag 7, Tag 11, Tag 15 und Tag 19 durch.

7. Histologische Betrachtung des Bindehautgewebes

1. Nach Abschluss der Modellentwicklung werden die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von 0,4 ml/100 g 10% wässrigem Chloralhydrat tief betäubt, um die Verspannungen der Tiere zu lindern. Dann die Ratten durch Zervixluxation einschläfern.
2. Nehmen Sie die bulbäre Bindehaut aus den gleichen Regionen jeder Ratte mit einer Größe von ca. 2 mm x 2 mm.
3. Fixieren Sie das Gewebe sofort 24 h lang in 4% Paraformaldehyd und betten Sie es in Paraffin¹³ ein.
4. Schneiden Sie 5 μm dicke Abschnitte und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin (HE)¹⁴ und periodischer Säure-Schiff (PAS)-Färbung (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers).

8. Histologische Betrachtung von Hornhaut- und Tränendrüsengewebe

1. Nach Abschluss der Modellentwicklung wird die Ratte wie in Schritt 7.1 beschrieben eingeschläfert.
2. Nehmen Sie die Hornhaut auf der rechten Seite jeder Ratte und fixieren Sie sie sofort in 4% iger Paraformaldehydlösung.
3. Schneiden Sie die cephale Epidermis und das Unterhautgewebe entlang der Linie, die das Ohr und den äußeren Augenwinkel verbindet, erweitern Sie den Schnitt zu beiden Seiten und isolieren Sie die gelbliche Extraorbitaldrüse weiter.
4. Entfernen Sie das Fell der Ratte gründlich und trennen Sie die extraorbitale Drüse mit 0,9% iger Natriumchloridlösung.
5. Legen Sie die isolierten extraorbitalen Drüsen für 24 h in 4%ige Paraformaldehydlösung und betten Sie sie in Paraffin ein.
6. Schneiden Sie durchgehende Abschnitte von ~5 μm Dicke und färben Sie sie mit HE für Hornhaut- und extraorbitale Drüsengewebeproben.

9. Statistische Auswertung

1. Verwenden Sie geeignete Software für die statistische Analyse der Daten.
   1. Führen Sie eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) durch, um die Daten zu analysieren, und den LSD-Test (Least Significant Difference) für den Vergleich zwischen Gruppen. Legen Sie das statistische Signifikanzniveau auf α = 0,05 fest, wobei P < 0,05 die statistische Signifikanz angibt.
      HINWEIS: Für die statistische Analyse der experimentellen Daten wurde die SPSS 20-Software verwendet.

Ergebnisse

Schirmer I test, SIT I
Das Tränenvolumen der Ratten wurde an den Tagen 0, 3, 5, 7, 11, 15 und 19 nach Beginn des Experiments gemessen. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Tränensekretion der Scopolamin-Gruppe (2,5-Gruppe, 5-Gruppe, 7,5-Gruppe) im Vergleich zur Kontrollgruppe (0-Gruppe) signifikant verringert war und der Unterschied statistisch signifikant war (P < 0,01). Es gab keine statistische Signifikanz zwischen der 2,5-Gruppe, der 5-Gruppe und der 7,5-Gruppe (P > 0,05). Es gab kei...

Diskussion

Das wässrig-defiziente trockene Auge (ADDE) ist eine wichtige Art des trockenen Auges, die etwa 1/3 der gesamten Population des trockenen Auges ausmacht¹⁷, und die Hauptursache für ADDE ist eine pathologische Schädigung und Entzündung der Tränendrüse¹³. Für diese Art von trockenem Auge sind die häufigsten klinischen Behandlungsmethoden künstliche Tränen zur Linderung der Symptome oder die topische Anwendung von Steroiden oder Cyclosporin¹⁸,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418