スコポラミンによる涙腺機能障害を有するラットドライアイモデル

要約

ここでは、涙腺機能障害のラットモデルを確立し、水欠損ドライアイの研究の基礎を提供します。

要約

水欠乏性ドライアイ(ADDE)は、涙液分泌の量と質が低下するドライアイ疾患の一種です。異常な涙液の分泌が長引くと、角膜の損傷や炎症など、眼の表面環境が乱れる可能性があります。重症の場合、ADDEは視力低下や失明を引き起こす可能性があります。現在、ドライアイの治療は点眼薬や理学療法に限られており、目の不快感の症状を緩和するだけで、ドライアイ症候群を根本的に治すことはできません。ドライアイにおける涙腺の機能を回復させるため、スコポラミンを誘発したラットの涙腺機能障害の動物モデルを作成しました。涙腺、角膜、結膜などの総合的な評価を通じて、ADDEの病態変化の全体像の解明を目指します。現在のドライアイマウスモデルと比較して、このADDE動物モデルには涙腺の機能評価が含まれており、ADDEの涙腺機能障害を研究するためのより良いプラットフォームを提供します。

概要

2021年までに、約12%の人がドライアイ¹に罹患し、最も一般的な慢性眼疾患の1つとなっています。ドライアイは、病気に影響を与えるさまざまな要因に応じて、水欠乏ドライアイ(ADDE)と蒸発性ドライアイ(EDE)²の2つのタイプに分けることができます。ADDEはさらにシェーグレン症候群(SS)と非SSに分けられますが、臨床³ではドライアイ患者の大半が非SS患者です。慢性ドライアイの症状は、患者の視覚の質に深刻な影響を及ぼします。現在、DEDの従来の治療には、眼表面を滑らかにするための人工涙液の適用とまぶたの理学療法が含まれます。しかし、ドライアイ症候群は、多くの場合、完治しない可能性があります。したがって、ドライアイ疾患の病因を研究することは、新しい治療法や薬の開発にとって非常に重要です。ドライアイ症候群の動物モデルは、さらなる研究の基礎となる。

ドライアイ症候群⁴の動物モデルを構築するには、ホルモンレベルを変化させることで涙液分泌量を変化させるなど、さまざまな方法があります。例えば、ラットの精巣を摘出すると、アンドロゲン分泌が減少し、涙液分泌が増加し、涙液中の遊離分泌成分(SC)とIgAの濃度が低下する可能性があります^5,6。別の方法は、涙腺を制御する眼表面神経を除去することにより、涙腺の自己免疫反応を示すことです。さらに、涙腺⁷を外科的に除去することにより、涙液分泌を直接減少させることを達成することができる。環境条件の変化も、涙液の蒸発を加速させる可能性があります。例えば、低湿度および乾燥した換気条件下で動物を培養すると、過度の蒸発ドライアイ^のモデルを確立することができ8、これはドライアイの重症度を増大させるために他の方法と組み合わせることができる。ドライアイ実験モデルを誘導するために使用される主な薬剤は、アトロピンとスコポラミン⁹です。副交感神経阻害剤として、どちらも涙腺のコリン作動性(ムスカリン)受容体の薬理学的遮断を誘発し、涙液分泌を阻害することができます。.スコポラミンは、アトロピン筋注射¹⁰によるドライアイと比較して、分泌腺に対する抑制効果が強く、薬物作用の持続時間が長く、心臓、小腸、気管支の平滑筋に対する効果が弱い。ドライアイ動物モデル用の最も成熟した薬剤の1つです。

スコポラミンでドライアイを誘発するには、皮下注射、薬物ポンプ、^{パッチ塗布など}、さまざまな方法を使用できます^4,11,12。実験動物への薬物投与頻度を減らすために、多くの研究者はマウスの尾部に経皮パッチを貼ったり、ドラッグポンプを使用したりしています。ただし、どちらの方法にも制限があります。例えば、経皮吸収型パッチの吸収は、マウスの個々の吸収を考慮する必要があり、これは薬物投与量の不均一化につながる可能性があります。薬物ポンプは各投与の投与量を正確に制御できますが、送達される薬物や使用される濃度と常に互換性があるとは限りません。また、外科的に留置する必要がありますが、これは動物にとってより侵襲的であり、麻酔イベントを必要とし、裂開などの術後合併症の可能性があります。皮下注射は、より面倒ですが、各投与の正確な投与量を確保し、異なるラット間での薬物投与の一貫性を維持することができます。同時に、低コストで、多数の動物実験を行うのに適しています。

この研究では、スコポラミンの皮下注射を繰り返し適用して、ドライアイラットモデルを確立します。角膜欠損、涙液分泌量、角膜、結膜、涙腺の病態形態などのドライアイ指標を解析します。薬物濃度、病理症状、ドライアイ症状を組み合わせることで、ドライアイラットモデルをさらに詳細に説明し、ドライアイ治療と病理学的メカニズムの研究のためのより正確な実験データを提供します。また、将来の研究者のために、モデリングプロセスについても詳しく説明します。

プロトコル

このプロトコルに従って実施されるすべての動物実験は、動物実験委員会(IACUC)の承認の下で実施されます。

1.動物の調製

1. 体重160g±20gの健康な6週齢のSPF Wistar雌ラット12匹を調製します。
2. 細隙灯と検眼鏡を使用して、すべてのラットの眼の状態を調べ、前眼部や網膜の病気がないことを確認します。
3. 十分な餌と水源ですべてのラットを1週間飼育します。
4. すべてのラットを正常なスコポラミン薬物濃度2.5mg/mL、スコポラミン薬物濃度5mg/mL、スコポラミン薬物濃度7.5mg/mLに無作為に割り分け、各群に3匹ずつ配置した。

2. 溶液調製

1. スコポラミン臭化水素酸塩を0.9%塩化ナトリウム溶液に溶解して調製し、7.5 mg/mL、5 mg/mL、および2.5 mg/mLの濃度の溶液を作成します。
2. スコポラミン臭化水素酸塩を含まない0.9%塩化ナトリウム溶液を調製し、ラットの対照群の注射として使用します。

3.機器と材料の準備

1. 小動物顕微鏡を用意します。
2. 針付き使い捨てシリンジ1mL(26 G)を含む実験用の材料を準備します。フルオレセインナトリウム眼科用ストリップ;シルマーの破損試験紙;無水エタノール;4%パラホルムアルデヒド;キシレン;ニュートラルバルサム;ヘマトキシリン、エオシン;および過ヨウ素酸シッフ染色キット。

4.皮下注射

注意: この手順では、ラットを固定するために2人目の支援が必要です。

1. ネズミの体をしっかりと保持し、左(または右)の後ろ足を捕まえて伸ばします。
   注意: 介助者が動物を抱きかかえるのを手伝ってくれます。
2. アルコールで注射部位をきれいにします。
3. 針付き使い捨てシリンジ1mLを、親指と指の間の皮膚のひだの付け根に挿入します。
4. シリンジプランジャーを引き戻してシリンジを吸引します。シリンジ内の血液は、針の配置が不適切であることを示しています。針を取り外して位置を変えます。
5. 0.9%塩化ナトリウム溶液をスコポラミン臭化水素酸塩の有無にかかわらず、安定した流動的な動きで投与します。.
6. すべてのラットを異なる濃度に従って注射し、0.5 mLを毎回、1日4回(9:00、12:00、15:00、18:00)19日間連続して、左右の肢を交互に注射します。
   注: グループには、次のような名前が付けられています。
   スコポラミン臭化水素酸塩を含まない群:0群(対照)
   スコポラミン臭化水素酸塩2.5 mg/mLを含むグループ:2.5グループ
   スコポラミン臭化水素酸塩5 mg/mLを含むグループ:5グループ
   スコポラミン臭化水素酸塩7.5 mg/mLを含むグループ:7.5グループ
7. 動物をケージに戻し、呼吸と行動を5〜10分間監視します。

5.涙液分泌試験(シルマー涙液試験、STT)

1. ラット¹¹用の修正された濾紙ストリップを作成します。人間用の濾紙帯を中心線(1mm×15mm)に沿って半分にカットし、ストリップの頭を滑らかにトリミングします。
   注意: 涙分泌試験を行う前に、手動でラットの体を拘束して動きを防ぎ、ラットの目を露出させてください。
2. ラットの下まぶた結膜嚢の外側1/3にろ紙ストリップを置きます。
3. テストの時間を5分間計ります。処置中、ラットの目の閉鎖を制御します。
4. 測定後、ピンセットを使用してろ紙ストリップを微量遠心チューブにクランプし、チューブの壁に印をつけて涙の量を記録します。
5. 0日目、1日目、3日目、5日目、7日目、11日目、15日目、および19日目に涙液分泌を測定します。

6. 角膜フルオレセイン染色

1. 0.5 μLの0.5%フルオレセインナトリウム溶液を各ラットの下結膜嚢に滴下します。
2. フルオレセイン点眼後、3分間青色光の下で角膜を観察します。
3. 各ラットの角膜の蛍光染色を記録し、角膜欠損があるかどうかを観察します。
4. 0日目、1日目、3日目、5日目、7日目、11日目、15日目、19日目に角膜フルオレセイン染色を行います。

7. 結膜組織の組織学的観察

1. モデル開発完了後、0.4mL/100gの10%抱水クロラール水溶液の腹腔内注射でラットを深く麻酔し、動物の緊張を緩和します。その後、頸部脱臼によりラットを安楽死させる。
2. 各ラットの同じ領域から、約2 mm x 2 mmのサイズの球結膜を採取します。
3. 直ちに組織を4%パラホルムアルデヒドに24時間固定し、パラフィン¹³に包埋します。
4. 厚さ5 μmの切片を切断し、ヘマトキシリンとエオシン(HE)¹⁴ および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色で染色します(メーカーの指示に従ってください)。

8. 角膜および涙腺組織の組織学的観察

1. モデル開発が完了したら、ステップ7.1の説明に従ってラットを安楽死させます。
2. 各ラットの右側にある角膜を取り、すぐに4%パラホルムアルデヒド溶液で固定します。
3. 耳と目尻を結ぶ線に沿って頭側表皮と皮下組織を切断し、切開部を両側に広げ、さらに黄色がかった眼窩外腺を分離します。
4. ラットの毛皮を完全に取り除き、0.9%塩化ナトリウム溶液で眼窩外腺を分離します。
5. 単離された眼窩外腺を4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間置き、パラフィンに埋め込みます。
6. ~5μmの厚さの連続切片を切断し、角膜および眼窩外腺組織標本をHEで染色します。

9. 統計解析

1. データの統計分析には、適切なソフトウェアを使用してください。
   1. 一元配置分散分析 (ANOVA) を実行してデータを分析し、最小有意差 (LSD) 検定を実行してグループ間の比較を行います。統計的有意水準を α = 0.05 に設定し、P < 0.05 を統計的有意性を示します。
      注:SPSS 20ソフトウェアは、実験データの統計分析に使用されました。

結果

シルマーIテスト、SIT I
ラットの涙液量は、実験開始後0、3、5、7、11、15、19日目に測定した。実験結果から、対照群(0群)と比較してスコポラミン群(2.5群、5群、7.5群)の涙液分泌が有意に減少し、その差は統計学的に有意であった(P < 0.01)。2.5群、5群、7.5群の間に統計的有意性は認められなかった(P > 0.05)。日数(P > 0.05)に関して、異なるグループ間で有意差は観察されませんでし?...

ディスカッション

水欠乏ドライアイ(ADDE)はドライアイの重要な種類であり、ドライアイ全体の人口の約1/3を占め¹⁷、ADDEの主な原因は涙腺の病理学的損傷と炎症です¹³。このタイプのドライアイの場合、最も一般的な臨床治療法は、症状を緩和するための人工涙液またはステロイドまたはシクロスポリン¹⁸の局所塗布ですが、涙腺の損傷に対する治療オプショ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418