Un modèle de rat de sécheresse oculaire avec un dysfonctionnement de la glande lacrymale induit par la scopolamine

Résumé

Ici, nous établissons un modèle de dysfonctionnement des glandes lacrymales chez le rat pour fournir une base pour l’étude de la sécheresse oculaire carencée en eau.

Résumé

La sécheresse oculaire carencée en eau (ADDE) est un type de sécheresse oculaire qui peut entraîner une réduction de la quantité et de la qualité de la sécrétion lacrymale. Une production anormale prolongée de larmes peut entraîner une perturbation de l’environnement de la surface oculaire, y compris des lésions cornéennes et une inflammation. Dans les cas graves, l’ADDE peut entraîner une perte de vision ou même la cécité. Actuellement, le traitement de la sécheresse oculaire se limite aux gouttes ophtalmiques ou à la physiothérapie, qui ne peuvent que soulager les symptômes de l’inconfort oculaire et ne peuvent pas guérir fondamentalement le syndrome de l’œil sec. Pour restaurer la fonction de la glande lacrymale dans la sécheresse oculaire, nous avons créé un modèle animal de dysfonctionnement des glandes lacrymales chez le rat induit par la scopolamine. Grâce à l’évaluation complète de la glande lacrymale, des cornées, des conjonctives et d’autres facteurs, nous visons à fournir une compréhension complète des changements pathologiques de l’ADDE. Comparé au modèle actuel de souris œil sec, ce modèle animal ADDE comprend une évaluation fonctionnelle de la glande lacrymale, offrant une meilleure plate-forme pour étudier le dysfonctionnement des glandes lacrymales dans ADDE.

Introduction

En 2021, environ 12 % des personnes sont touchées de manière significative par la sécheresse oculaire¹, ce qui en fait l’une des maladies oculaires chroniques les plus courantes. La sécheresse oculaire peut être divisée en deux types : la sécheresse oculaire carencée en eau (ADDE) et la sécheresse oculaire par évaporation (EDE)², en fonction des différents facteurs qui affectent la maladie. L’ADDE est divisé en syndrome de Sjögren (SS) et non-SS, mais la majorité des patients atteints de sécheresse oculaire sont des patients non SS en clinique³. Les symptômes de sécheresse oculaire chronique affectent gravement la qualité visuelle des patients. Actuellement, le traitement conventionnel de la DED implique l’application de larmes artificielles pour lubrifier la surface oculaire et la physiothérapie des paupières. Cependant, le syndrome de l’œil sec peut ne pas offrir une guérison complète dans de nombreux cas. Par conséquent, l’étude de la pathogenèse de la sécheresse oculaire est cruciale pour le développement de nouveaux traitements et médicaments. Les modèles animaux du syndrome de l’œil sec constituent une base pour d’autres recherches.

Il existe de nombreuses façons de construire des modèles animaux du syndrome de l’œil sec⁴, notamment en modifiant les niveaux de sécrétion lacrymale en modifiant les niveaux d’hormones. Par exemple, l’ablation des testicules de rats peut réduire la sécrétion d’androgènes, augmenter la sécrétion lacrymale et diminuer la concentration de composants sécrétoires libres (SC) et d’IgA dans les larmes ^5,6. Une autre méthode consiste à indiquer les réactions auto-immunes dans la glande lacrymale en enlevant les nerfs de la surface de l’œil qui contrôlent la glande. De plus, une réduction directe de la sécrétion lacrymale peut être obtenue en enlevant chirurgicalement la glande lacrymale⁷. Les conditions environnementales changeantes peuvent également accélérer l’évaporation des larmes. Par exemple, l’élevage d’animaux dans des conditions de faible humidité et de ventilation sèche peut établir un modèle de sécheresse oculaire par évaporation excessive⁸, qui peut être combiné à d’autres méthodes pour augmenter la gravité de la sécheresse oculaire. Les principaux médicaments utilisés pour induire des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire sont l’atropine et la scopolamine⁹. En tant qu’inhibiteurs parasympathiques, les deux peuvent induire un blocage pharmacologique des récepteurs cholinergiques (muscariniques) dans la glande lacrymale et inhiber la sécrétion de larmes. Comparée à la sécheresse oculaire causée par l’injection d’atropine¹⁰, la scopolamine a un effet inhibiteur plus fort sur les glandes sécrétionnelles, une durée d’action plus longue et des effets plus faibles sur les muscles lisses cardiaques, intestinaux grêles et bronchiques. C’est l’un des médicaments les plus matures pour les modèles animaux de sécheresse oculaire.

Différentes méthodes peuvent être utilisées pour induire la sécheresse oculaire avec la scopolamine, telles que l’injection sous-cutanée, la pompe à médicament ou l’application de patchs ^4,11,12. Afin de réduire la fréquence d’administration de médicaments aux animaux de laboratoire, de nombreux chercheurs appliquent des patchs transdermiques sur la queue des souris ou utilisent des pompes à médicaments. Cependant, ces deux méthodes ont des limites. Par exemple, l’absorption des patchs transdermiques doit tenir compte de l’absorption individuelle des souris, ce qui peut entraîner un dosage incohérent des médicaments. Bien que les pompes à médicaments puissent contrôler avec précision la posologie de chaque administration, elles ne sont pas toujours compatibles avec le médicament administré ou la concentration utilisée. Ils doivent également être placés chirurgicalement, ce qui est plus invasif pour l’animal, nécessite un événement anesthésique et peut entraîner des complications post-chirurgicales telles que la déhiscence. L’injection sous-cutanée, bien que plus lourde, peut assurer un dosage précis pour chaque administration et maintenir la cohérence de l’administration du médicament entre les différents rats. En même temps, il a un coût inférieur et convient à la réalisation d’un grand nombre d’expériences sur les animaux.

Cette étude applique des injections sous-cutanées répétées de scopolamine pour établir un modèle de rat à œil sec. Nous analysons les indicateurs de la sécheresse oculaire tels que les défauts cornéens, les niveaux de sécrétion lacrymale et la morphologie pathologique de la cornée, de la conjonctive et de la glande lacrymale. En combinant la concentration de médicaments, les manifestations pathologiques et les symptômes de la sécheresse oculaire, nous développons en détail le modèle de rat à œil sec, fournissant des données expérimentales plus précises pour l’étude du traitement de la sécheresse oculaire et des mécanismes pathologiques. Nous décrivons également le processus de modélisation en détail pour les futurs chercheurs.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées selon ce protocole sont effectuées sous l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC).

1. Préparation des animaux

1. Préparez 12 rats femelles Wistar SPF en bonne santé âgés de 6 semaines pesant 160 g ± 20 g.
2. Utilisez une lampe à fente et un ophtalmoscope pour examiner l’état oculaire de tous les rats, en vous assurant qu’il n’y a pas de maladie du segment antérieur ou de la rétine.
3. Élevez tous les rats pendant 1 semaine avec suffisamment de nourriture et d’eau.
4. Tous les rats ont été divisés au hasard en groupes normaux, concentration de médicament scopolamine 2,5 mg/mL, concentration de médicament scopolamine 5 mg/mL et concentration de médicament scopolamine 7,5 mg/mL, avec trois animaux dans chaque groupe.

2. Préparation de la solution

1. Préparer le bromhydrate de scopolamine en le dissolvant dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % pour obtenir une solution à des concentrations de 7,5 mg/mL, 5 mg/mL et 2,5 mg/mL.
2. Préparer une solution de chlorure de sodium à 0,9 % sans bromhydrate de scopolamine à utiliser comme injection pour le groupe témoin de rats.

3. Équipement et préparation du matériel

1. Préparez un microscope pour petits animaux.
2. Préparer le matériel pour l’expérience, y compris une seringue jetable de 1 mL avec aiguille (26 G) ; bandelettes ophtalmiques à la fluorescéine sodique ; bandelette de test de déchirure de Schirmer ; éthanol absolu ; 4 % de paraformaldéhyde ; xylène; baume neutre ; hématoxyline, éosine ; et kit de coloration périodique à l’acide Schiff.

4. Injection sous-cutanée

REMARQUE : Cette procédure nécessite l’aide d’une deuxième personne pour aider à sécuriser les rats.

1. Maintenez le corps du rat stable et attrapez et étirez ses pattes arrière gauche (ou droite).
   REMARQUE : Un assistant peut aider à tenir l’animal.
2. Nettoyer le site d’injection avec de l’alcool.
3. Insérer une seringue jetable de 1 ml avec une aiguille (26 G) à la base du pli cutané entre le pouce et l’index.
4. Aspirez la seringue en tirant sur le piston de la seringue. Tout sang dans la seringue indique un mauvais placement de l’aiguille ; Retirez et repositionnez l’aiguille.
5. Administrer une solution de chlorure de sodium à 0,9 % avec ou sans bromhydrate de scopolamine dans un mouvement régulier et fluide.
6. Injecter tous les rats selon différentes concentrations, à raison de 0,5 mL injecté à chaque fois et quatre fois par jour (à 9h00, 12h00, 15h00 et 18h00) pendant une période consécutive de 19 jours, en alternance entre les membres gauche et droit.
   NOTE : Les groupes sont nommés comme suit :
   Groupe sans bromhydrate de scopolamine : 0 groupe (témoin)
   Groupe avec bromhydrate de scopolamine 2,5 mg/mL : groupe 2,5
   Groupe avec bromhydrate de scopolamine 5 mg/mL : 5 groupes
   Groupe avec bromhydrate de scopolamine 7,5 mg/mL : groupe 7,5
7. Remettez l’animal dans sa cage et surveillez sa respiration et son comportement pendant 5 à 10 minutes.

5. Test de sécrétion lacrymale (test lacrymal de Schirmer, STT)

1. Créer une bande de papier filtre modifiée pour les rats¹¹. Coupez la moitié de la bande de papier filtre utilisée pour les humains le long de la ligne médiane (1 mm × 15 mm) et coupez la tête de la bande pour la rendre lisse.
   REMARQUE : Avant d’effectuer le test de sécrétion lacrymale, immobilisez manuellement le corps du rat pour l’empêcher de bouger et assurer l’exposition des yeux du rat.
2. Placez la bande de papier filtre sur le 1/3 externe du sac conjonctival de la paupière inférieure du rat.
3. Chronométrez le test pendant 5 min. Contrôlez la fermeture des yeux du rat tout au long de la procédure.
4. Après la mesure, utilisez une pince à épiler pour serrer la bande de papier filtre dans un tube de microcentrifugation et notez le volume de déchirure en faisant une marque sur la paroi du tube.
5. Mesurez la sécrétion lacrymale le jour 0, le jour 1, le jour 3, le jour 5, le jour 7, le jour 11, le jour 15 et le jour 19.

6. Coloration cornéenne à la fluorescéine

1. Déposer 0,5 μL de solution de fluorescéine sodique à 0,5 % dans le sac conjonctival inférieur de chaque rat.
2. Observez la cornée sous lumière bleue pendant 3 min après l’instillation de fluorescéine.
3. Enregistrer la coloration par fluorescence de la cornée de chaque rat et observer s’il y a un défaut cornéen.
4. Effectuez une coloration cornéenne à la fluorescéine le jour 0, le jour 1, le jour 3, le jour 5, le jour 7, le jour 11, le jour 15 et le jour 19.

7. Observation histologique du tissu conjonctival

1. Après avoir terminé le développement du modèle, anesthésier profondément les rats avec une injection intrapéritonéale de 0,4 mL/100 g d’hydrate de chloral aqueux à 10 % pour soulager la tension des animaux. Ensuite, euthanasier les rats par luxation cervicale.
2. Prélevez la conjonctive bulbaire dans les mêmes régions de chaque rat, d’une taille d’environ 2 mm x 2 mm.
3. Fixer immédiatement les tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h et les incorporer dans de la parodine¹³.
4. Couper des sections de 5 μm d’épaisseur et colorer avec de l’hématoxyline et de l’éosine (HE)¹⁴ et une coloration périodique à l’acide de Schiff (PAS) (suivre les instructions du fabricant).

8. Observation histologique du tissu cornéen et lacrymal

1. Après avoir terminé l’élaboration du modèle, euthanasier le rat comme décrit à l’étape 7.1.
2. Prenez la cornée du côté droit de chaque rat et fixez-la immédiatement dans une solution de paraformaldéhyde à 4%.
3. Coupez l’épiderme céphalique et le tissu sous-cutané le long de la ligne reliant l’oreille et le coin externe de l’œil, élargissez l’incision des deux côtés et isolez davantage la glande extra-orbitaire jaunâtre.
4. Retirez soigneusement la fourrure du rat et séparez la glande extraorbitaire avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 %.
5. Placer les glandes extraorbitaires isolées dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h et les incorporer dans de la paraffine.
6. Couper des sections continues de ~5 μm d’épaisseur et les colorer avec de l’HE pour les échantillons de tissu cornéen et glandulaire extraorbitaire.

9. Analyse statistique

1. Utiliser un logiciel approprié pour l’analyse statistique des données.
   1. Effectuer une analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour analyser les données et le test de la différence la moins significative (LSD) pour la comparaison entre les groupes. Fixer le niveau de signification statistique à α = 0,05, P < 0,05 indiquant la signification statistique.
      NOTE : Le logiciel SPSS 20 a été utilisé pour l’analyse statistique des données expérimentales.

Résultats

Schirmer I teste, SIT I
Le volume lacrymal des rats a été mesuré les jours 0, 3, 5, 7, 11, 15 et 19 après le début de l’expérience. Les résultats expérimentaux ont montré que la sécrétion lacrymale du groupe scopolamine (groupe 2,5, groupe 5, groupe 7,5), par rapport au groupe témoin (groupe 0), était significativement diminuée, et la différence était statistiquement significative (P < 0,01). Il n’y avait pas de signification statistique entre le groupe 2,5, le groupe 5 et le group...

Discussion

La sécheresse oculaire carencée en eau (ADDE) est un type important de sécheresse oculaire, représentant environ 1/3 de la population totale des yeux secs¹⁷, et la principale cause de l’ADDE est une lésion pathologique et une inflammation des glandes lacrymales¹³. Pour ce type de sécheresse oculaire, les méthodes de traitement clinique les plus courantes sont les larmes artificielles pour soulager les symptômes ou l’application topique de stéroïdes ou de cyclo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418