Un modello di occhio secco di ratto con disfunzione della ghiandola lacrimale indotta dalla scopolamina

Riepilogo

Qui, stabiliamo un modello di ratto di disfunzione della ghiandola lacrimale per fornire una base per lo studio dell'occhio secco con deficit acquoso.

Abstract

L'occhio secco da carenza acquosa (ADDE) è un tipo di malattia dell'occhio secco che può comportare la riduzione della quantità e della qualità della secrezione lacrimale. La produzione anomala prolungata di lacrime può portare a un disturbo nell'ambiente della superficie oculare, inclusi danni corneali e infiammazioni. Nei casi più gravi, l'ADDE può causare la perdita della vista o addirittura la cecità. Attualmente, il trattamento dell'occhio secco è limitato a colliri o terapia fisica, che possono solo alleviare i sintomi del disagio oculare e non possono curare fondamentalmente la sindrome dell'occhio secco. Per ripristinare la funzione della ghiandola lacrimale nell'occhio secco, abbiamo creato un modello animale di disfunzione della ghiandola lacrimale nei ratti indotta dalla scopolamina. Attraverso la valutazione completa della ghiandola lacrimale, delle cornee, delle congiuntive e di altri fattori, miriamo a fornire una piena comprensione dei cambiamenti patologici dell'ADDE. Rispetto all'attuale modello murino a occhio secco, questo modello animale ADDE include una valutazione funzionale della ghiandola lacrimale, fornendo una piattaforma migliore per studiare la disfunzione della ghiandola lacrimale nell'ADDE.

Introduzione

Entro il 2021, circa il 12% delle persone è significativamente colpito dalla secchezza oculare¹, rendendola una delle malattie croniche degli occhi più comuni. L'occhio secco può essere suddiviso in due tipi: l'occhio secco da carenza acquosa (ADDE) e l'occhio secco evaporativo (EDE)², a seconda dei diversi fattori che influenzano la malattia. L'ADDE è ulteriormente suddivisa in sindrome di Sjögren (SS) e non-SS, ma la maggior parte dei pazienti con occhio secco sono pazienti non SS nella clinica³. I sintomi cronici dell'occhio secco compromettono seriamente la qualità visiva dei pazienti. Attualmente, il trattamento convenzionale della DED prevede l'applicazione di lacrime artificiali per lubrificare la superficie oculare e la terapia fisica delle palpebre. Tuttavia, la sindrome dell'occhio secco potrebbe non offrire una cura completa in molti casi. Pertanto, lo studio della patogenesi della malattia dell'occhio secco è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie e farmaci. I modelli animali della sindrome dell'occhio secco forniscono una base per ulteriori ricerche.

Esistono molti modi per costruire modelli animali della sindrome dell'occhio secco⁴, tra cui la modifica dei livelli di secrezione lacrimale alterando i livelli ormonali. Ad esempio, la rimozione dei testicoli dei ratti può ridurre la secrezione di androgeni, aumentare la secrezione lacrimale e diminuire la concentrazione di componente secretorio libero (SC) e IgA nelle lacrime ^5,6. Un altro metodo consiste nell'indicare le reazioni autoimmuni nella ghiandola lacrimale rimuovendo i nervi della superficie oculare che controllano la ghiandola. Inoltre, è possibile ridurre direttamente la secrezione lacrimale rimuovendo chirurgicamente la ghiandola lacrimale⁷. Anche le mutevoli condizioni ambientali possono accelerare l'evaporazione delle lacrime. Ad esempio, la coltura di animali in condizioni di bassa umidità e ventilazione asciutta può stabilire un modello di eccessiva secchezza oculare evaporativa⁸, che può essere combinato con altri metodi per aumentare la gravità dell'occhio secco. I principali farmaci utilizzati per indurre modelli sperimentali di occhio secco sono l'atropina e la scopolamina⁹. Come inibitori parasimpatici, entrambi possono indurre il blocco farmacologico dei recettori colinergici (muscarinici) nella ghiandola lacrimale e inibire la secrezione lacrimale. Rispetto alla secchezza oculare causata dall'iniezione muscolare di atropina¹⁰, la scopolamina ha un effetto inibitorio più forte sulle ghiandole della secrezione, una durata più lunga dell'azione del farmaco ed effetti più deboli sulla muscolatura liscia cardiaca, dell'intestino tenue e bronchiale. È uno dei farmaci più maturi per i modelli animali di occhio secco.

Diversi metodi possono essere utilizzati per indurre l'occhio secco con scopolamina, come l'iniezione sottocutanea, la pompa del farmaco o l'applicazione di cerotti ^4,11,12. Al fine di ridurre la frequenza di somministrazione di farmaci agli animali da esperimento, molti ricercatori applicano cerotti transdermici alla coda dei topi o utilizzano pompe per farmaci. Tuttavia, entrambi questi metodi hanno delle limitazioni. Ad esempio, l'assorbimento dei cerotti transdermici deve tenere conto dell'assorbimento individuale dei topi, che può portare a un dosaggio incoerente del farmaco. Sebbene le pompe per farmaci siano in grado di controllare con precisione il dosaggio di ogni somministrazione, non sono sempre compatibili con il farmaco erogato o con la concentrazione utilizzata. Devono anche essere posizionati chirurgicamente, il che è più invasivo per l'animale, richiedendo un evento anestetico e c'è il potenziale per complicanze post-chirurgiche come la deiscenza. L'iniezione sottocutanea, sebbene più ingombrante, può garantire un dosaggio accurato per ogni somministrazione e mantenere la coerenza nella somministrazione del farmaco tra i diversi ratti. Allo stesso tempo, ha un costo inferiore ed è adatto per condurre un gran numero di esperimenti sugli animali.

Questo studio applica ripetute iniezioni sottocutanee di scopolamina per stabilire un modello di ratto a occhio secco. Analizziamo gli indicatori dell'occhio secco come i difetti corneali, i livelli di secrezione lacrimale e la morfologia patologica della cornea, della congiuntiva e della ghiandola lacrimale. Combinando la concentrazione del farmaco, le manifestazioni patologiche e i sintomi dell'occhio secco, elaboriamo ulteriormente il modello di ratto dell'occhio secco in dettaglio, fornendo dati sperimentali più accurati per lo studio del trattamento dell'occhio secco e dei meccanismi patologici. Descriviamo anche il processo di modellazione in dettaglio per i futuri ricercatori.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti seguendo questo protocollo sono eseguiti sotto l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC).

1. Preparazione dell'animale

1. Prepara 12 ratti femmine Wistar sani di 6 settimane con SPF del peso di 160 g ± 20 g.
2. Utilizzare una lampada a fessura e un oftalmoscopio per esaminare le condizioni degli occhi di tutti i ratti, assicurandosi che non vi siano malattie del segmento anteriore o della retina.
3. Alleva tutti i ratti per 1 settimana con sufficienti fonti di cibo e acqua.
4. Tutti i ratti sono stati divisi in modo casuale in gruppi normali, con concentrazione del farmaco scopolamina 2,5 mg/mL, concentrazione del farmaco scopolamina 5 mg/mL e concentrazione del farmaco scopolamina 7,5 mg/mL, con tre animali in ciascun gruppo.

2. Preparazione della soluzione

1. Preparare il bromuro di scopolamina sciogliendolo in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% per ottenere una soluzione con concentrazioni di 7,5 mg/mL, 5 mg/mL e 2,5 mg/mL.
2. Preparare una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% senza bromuro di scopolamina da utilizzare come iniezione per il gruppo di controllo dei ratti.

3. Preparazione dell'attrezzatura e del materiale

1. Prepara un microscopio per piccoli animali.
2. Preparare i materiali per l'esperimento, tra cui una siringa monouso da 1 mL con ago (26 G); strisce oftalmiche di fluoresceina sodica; Striscia reattiva per lacrime di Schirmer; etanolo assoluto; 4% paraformaldeide; xilene; balsamo neutro; ematossilina, eosina; e kit periodico di colorazione acido-Schiff.

4. Iniezione sottocutanea

NOTA: Questa procedura richiede l'assistenza di una seconda persona per aiutare a proteggere i ratti.

1. Tieni fermo il corpo del ratto e afferra e allunga le zampe posteriori sinistre (o destre).
   NOTA: Un assistente può aiutare a tenere l'animale.
2. Pulire il sito di iniezione con alcool.
3. Inserire una siringa monouso da 1 mL con ago (26 G) alla base della piega cutanea tra il pollice e l'indice.
4. Aspirare la siringa tirando indietro lo stantuffo della siringa. L'eventuale presenza di sangue nella siringa indica un posizionamento errato dell'ago; Rimuovere e riposizionare l'ago.
5. Somministrare una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% con o senza bromuro di scopolamina con un movimento costante e fluido.
6. Iniettare tutti i ratti in base a diverse concentrazioni, iniettando 0,5 ml ogni volta e quattro volte al giorno (alle 9:00, 12:00, 15:00 e 18:00) per un periodo consecutivo di 19 giorni, alternando gli arti sinistro e destro.
   NOTA: i gruppi sono denominati come segue:
   Gruppo senza bromuro di scopolamina: 0 gruppo (controllo)
   Gruppo con scopolamina bromuro 2,5 mg/mL: gruppo 2,5
   Gruppo con bromuro di scopolamina 5 mg/mL: gruppo 5
   Gruppo con bromidrato di scopolamina 7,5 mg/mL: gruppo 7,5
7. Rimetti l'animale nella sua gabbia e monitora la respirazione e il comportamento per 5-10 minuti.

5. Test della secrezione lacrimale (test lacrimale di Schirmer, STT)

1. Creare una striscia di carta da filtro modificata per i ratti¹¹. Tagliare metà della striscia di carta da filtro utilizzata per gli esseri umani lungo la linea centrale (1 mm × 15 mm) e tagliare la testa della striscia per renderla liscia.
   NOTA: Prima di eseguire il test della secrezione lacrimale, trattenere manualmente il corpo del ratto per impedirne il movimento e garantire l'esposizione degli occhi del ratto.
2. Posizionare la striscia di carta da filtro sul 1/3 esterno del sacco congiuntivale della palpebra inferiore del ratto.
3. Cronometrare il test per 5 min. Controllare la chiusura degli occhi del ratto durante la procedura.
4. Dopo la misurazione, utilizzare una pinzetta per bloccare la striscia di carta da filtro in una provetta per microcentrifuga e registrare il volume lacrimale tracciando un segno sulla parete della provetta.
5. Misura la secrezione lacrimale il giorno 0, il giorno 1, il giorno 3, il giorno 5, il giorno 7, il giorno 11, il giorno 15 e il giorno 19.

6. Colorazione con fluoresceina corneale

1. Far cadere 0,5 μL di soluzione di fluoresceina sodica allo 0,5% nel sacco congiuntivale inferiore di ciascun ratto.
2. Osservare la cornea sotto la luce blu per 3 minuti dopo l'instillazione di fluoresceina.
3. Registrare la colorazione fluorescente della cornea di ciascun ratto e osservare se c'è un difetto corneale.
4. Eseguire la colorazione con fluoresceina corneale il giorno 0, il giorno 1, il giorno 3, il giorno 5, il giorno 7, il giorno 11, il giorno 15 e il giorno 19.

7. Osservazione istologica del tessuto congiuntivale

1. Dopo aver completato lo sviluppo del modello, anestetizzare i ratti in profondità con un'iniezione intraperitoneale di 0,4 ml/100 g di idrato acquoso di cloralio al 10% per alleviare la tensione degli animali. Quindi, sopprimere i ratti mediante lussazione cervicale.
2. Prelevare la congiuntiva bulbare dalle stesse regioni di ciascun ratto, con una dimensione di circa 2 mm x 2 mm.
3. Fissare immediatamente i tessuti in paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporare in paraffina¹³.
4. Tagliare sezioni di spessore 5 μm e colorare con ematossilina ed eosina (HE)¹⁴ e colorante periodico acido-Schiff (PAS) (seguire le istruzioni del produttore).

8. Osservazione istologica del tessuto corneale e lacrimale

1. Dopo aver completato lo sviluppo del modello, sopprimere il ratto come descritto al punto 7.1.
2. Prendi la cornea sul lato destro di ogni ratto e fissala immediatamente in una soluzione di paraformaldeide al 4%.
3. Tagliare l'epidermide cefalica e il tessuto sottocutaneo lungo la linea che collega l'orecchio e l'angolo esterno dell'occhio, espandere l'incisione su entrambi i lati e isolare ulteriormente la ghiandola extraorbitaria giallastra.
4. Rimuovere accuratamente il pelo del ratto e separare la ghiandola extraorbitaria con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.
5. Porre le ghiandole extraorbitali isolate in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore e incorporare in paraffina.
6. Tagliare sezioni continue di ~5 μm di spessore e colorarle con HE per campioni di tessuto corneale ed extraorbitale.

9. Analisi statistica

1. Utilizzare software appropriati per l'analisi statistica dei dati.
   1. Eseguire l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per analizzare i dati e il test delle differenze meno significative (LSD) per il confronto tra i gruppi. Impostare il livello di significatività statistica su α = 0,05, con P < 0,05 che indica la significatività statistica.
      NOTA: Per l'analisi statistica dei dati sperimentali è stato utilizzato il software SPSS 20.

Risultati

Schirmer I prova, SIT I
Il volume lacrimale dei ratti è stato misurato nei giorni 0, 3, 5, 7, 11, 15 e 19 dopo l'inizio dell'esperimento. I risultati sperimentali hanno mostrato che la secrezione lacrimale del gruppo scopolamina (gruppo 2,5, gruppo 5, gruppo 7,5), rispetto al gruppo di controllo (gruppo 0), era significativamente diminuita e la differenza era statisticamente significativa (P < 0,01). Non c'è stata alcuna significatività statistica tra il gruppo 2,5, il gruppo 5 e il gruppo 7,5 (P >...

Discussione

L'occhio secco da carenza acquosa (ADDE) è un importante tipo di occhio secco, che rappresenta circa 1/3 della popolazione totale di occhio secco¹⁷ e la causa principale dell'ADDE è il danno patologico e l'infiammazione della ghiandola lacrimale¹³. Per questo tipo di occhio secco, i metodi di trattamento clinico più comuni sono le lacrime artificiali per alleviare i sintomi o l'applicazione topica di steroidi o ciclosporina¹⁸, mentre ci sono poche...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418