Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

Resumen

Aquí, establecemos un modelo de rata de disfunción de la glándula lagrimal para proporcionar una base para el estudio del ojo seco con deficiencia acuosa.

Resumen

El ojo seco por deficiencia acuosa (ADDE) es un tipo de enfermedad del ojo seco que puede resultar en la reducción de la cantidad y calidad de la secreción lagrimal. La producción anormal prolongada de lágrimas puede provocar una alteración en el entorno de la superficie ocular, incluido el daño e inflamación de la córnea. En casos graves, la ADDE puede causar pérdida de la visión o incluso ceguera. Actualmente, el tratamiento del ojo seco se limita a gotas para los ojos o fisioterapia, que solo pueden aliviar los síntomas de las molestias oculares y no pueden curar fundamentalmente el síndrome del ojo seco. Para restaurar la función de la glándula lagrimal en el ojo seco, hemos creado un modelo animal de disfunción de la glándula lagrimal en ratas inducida por escopolamina. A través de la evaluación integral de la glándula lagrimal, córneas, conjuntivas y otros factores, nuestro objetivo es proporcionar una comprensión completa de los cambios patológicos de la ADDE. En comparación con el modelo actual de ratón con ojo seco, este modelo animal de ADDE incluye una evaluación funcional de la glándula lagrimal, lo que proporciona una mejor plataforma para estudiar la disfunción de la glándula lagrimal en ADDE.

Introducción

Para el año 2021, aproximadamente el 12% de las personas se ven afectadas significativamente por la sequedad ocular¹, lo que la convierte en una de las enfermedades oculares crónicas más comunes. El ojo seco se puede dividir en dos tipos: ojo seco acuoso-deficiente (ADDE) y ojo seco evaporativo (EDE)², dependiendo de los diferentes factores que inciden en la enfermedad. El ADDE se divide a su vez en síndrome de Sjögren (SS) y no SS, pero la mayoría de los pacientes con ojo seco son pacientes sin SS en la clínica³. Los síntomas crónicos del ojo seco afectan gravemente a la calidad visual de los pacientes. Actualmente, el tratamiento convencional de la DED consiste en la aplicación de lágrimas artificiales para lubricar la superficie ocular y la fisioterapia de los párpados. Sin embargo, el síndrome del ojo seco puede no ofrecer una cura completa en muchos casos. Por lo tanto, el estudio de la patogénesis de la enfermedad del ojo seco es crucial para el desarrollo de nuevas terapias y fármacos. Los modelos animales del síndrome del ojo seco proporcionan una base para futuras investigaciones.

Hay muchas maneras de construir modelos animales del síndrome del ojo seco⁴, incluyendo el cambio de los niveles de secreción lagrimal mediante la alteración de los niveles hormonales. Por ejemplo, la extirpación de los testículos de ratas puede reducir la secreción de andrógenos, aumentar la secreción lagrimal y disminuir la concentración del componente secretor libre (SC) e IgA en las lágrimas ^5,6. Otro método consiste en indicar reacciones autoinmunes en la glándula lagrimal mediante la extirpación de los nervios de la superficie ocular que controlan la glándula. Además, se puede lograr una reducción directa de la secreción lagrimal mediante la extirpación quirúrgica de la glándula lagrimal⁷. Las condiciones ambientales cambiantes también pueden acelerar la evaporación de las lágrimas. Por ejemplo, el cultivo de animales en condiciones de baja humedad y ventilación seca puede establecer un modelo de ojo seco por evaporación excesiva⁸, que puede combinarse con otros métodos para aumentar la gravedad del ojo seco. Los principales fármacos utilizados para inducir el ojo seco en modelos experimentales son la atropina y la escopolamina⁹. Como inhibidores parasimpáticos, ambos pueden inducir el bloqueo farmacológico de los receptores colinérgicos (muscarínicos) en la glándula lagrimal e inhibir la secreción lagrimal. En comparación con la sequedad ocular causada por la inyección de atropina^{muscular 10}, la escopolamina tiene un efecto inhibidor más fuerte sobre las glándulas de secreción, una mayor duración de la acción del fármaco y efectos más débiles sobre los músculos lisos cardíacos, intestinales delgados y bronquiales. Es uno de los fármacos más maduros para modelos animales de ojo seco.

Se pueden utilizar diferentes métodos para inducir el ojo seco con escopolamina, como la inyección subcutánea, la bomba de fármaco o la aplicación de parches ^4,11,12. Con el fin de reducir la frecuencia de la administración de fármacos a animales de experimentación, muchos investigadores aplican parches transdérmicos a las colas de los ratones o utilizan bombas de fármacos. Sin embargo, ambos métodos tienen limitaciones. Por ejemplo, la absorción de parches transdérmicos debe tener en cuenta la absorción individual de ratones, lo que puede conducir a una dosis inconsistente del medicamento. Aunque las bombas de fármacos pueden controlar con precisión la dosis de cada administración, no siempre son compatibles con el fármaco que se administra o la concentración que se utiliza. También deben colocarse quirúrgicamente, lo que es más invasivo para el animal, requiere un evento anestésico y existe la posibilidad de complicaciones posquirúrgicas como la dehiscencia. La inyección subcutánea, aunque más engorrosa, puede garantizar una dosis precisa para cada administración y mantener la consistencia en la administración del fármaco entre diferentes ratas. Al mismo tiempo, tiene un costo menor y es adecuado para realizar una gran cantidad de experimentos con animales.

Este estudio aplica inyecciones subcutáneas repetidas de escopolamina para establecer un modelo de rata con ojo seco. Analizamos indicadores de ojo seco como defectos corneales, niveles de secreción lagrimal y morfología patológica de la córnea, la conjuntiva y la glándula lagrimal. Al combinar la concentración del fármaco, las manifestaciones patológicas y los síntomas del ojo seco, profundizamos en el modelo de rata de ojo seco en detalle, proporcionando datos experimentales más precisos para el estudio del tratamiento del ojo seco y los mecanismos patológicos. También describimos el proceso de modelado en detalle para futuros investigadores.

Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados siguiendo este protocolo se realizan bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

1. Preparación animal

1. Prepare 12 ratas hembras Wistar SPF sanas de 6 semanas de edad con un peso de 160 g ± 20 g.
2. Use una lámpara de hendidura y un oftalmoscopio para examinar las condiciones oculares de todas las ratas, asegurándose de que no haya enfermedades del segmento anterior o de la retina.
3. Cría a todas las ratas durante 1 semana con suficientes fuentes de comida y agua.
4. Dividieron aleatoriamente todas las ratas en grupos normales, concentración del fármaco escopolamina 2,5 mg/mL, concentración del fármaco escopolamina 5 mg/mL y concentración del fármaco escopolamina 7,5 mg/mL, con tres animales en cada grupo.

2. Preparación de la solución

1. Prepare el bromuro de escopolamina disolviéndolo en una solución de cloruro de sodio al 0,9% para hacer una solución con concentraciones de 7,5 mg/ml, 5 mg/ml y 2,5 mg/ml.
2. Preparar una solución de cloruro de sodio al 0,9% sin bromuro de escopolamina para ser utilizada como inyección para el grupo de control de ratas.

3. Preparación de equipos y materiales

1. Prepara un microscopio para animales pequeños.
2. Preparar los materiales para el experimento, incluyendo una jeringa desechable de 1 ml con aguja (26 G); tiras oftálmicas de fluoresceína sódica; Tira reactiva de desgarro Schirmer; etanol absoluto; 4% de paraformaldehído; xileno; bálsamo neutro; hematoxilina, eosina; y kit de tinción de ácido peryódico-Schiff.

4. Inyección subcutánea

NOTA: Este procedimiento requiere la ayuda de una segunda persona para ayudar a asegurar las ratas.

1. Sostén el cuerpo de la rata con firmeza y atrapa y estira sus patas traseras izquierdas (o derechas).
   NOTA: Un asistente puede ayudar a sostener al animal.
2. Limpie el lugar de la inyección con alcohol.
3. Inserte una jeringa desechable de 1 ml con aguja (26 G) en la base del pliegue cutáneo entre el pulgar y el dedo.
4. Aspire la jeringa tirando hacia atrás del émbolo de la jeringa. Cualquier sangre en la jeringa indica una colocación incorrecta de la aguja; Retire y vuelva a colocar la aguja.
5. Administre una solución de cloruro de sodio al 0,9% con o sin bromuro de escopolamina con un movimiento constante y fluido.
6. Inyectar a todas las ratas de acuerdo con diferentes concentraciones, inyectando 0,5 ml cada vez y cuatro veces al día (a las 9:00, 12:00, 15:00 y 18:00) durante un período consecutivo de 19 días, alternando entre las extremidades izquierda y derecha.
   NOTA: Los grupos se nombran de la siguiente manera:
   Grupo sin bromuro de escopolamina: grupo 0 (control)
   Grupo con bromuro de escopolamina 2,5 mg/mL: Grupo 2,5
   Grupo con bromuro de escopolamina 5 mg/mL: grupo 5
   Grupo con bromuro de escopolamina 7,5 mg/mL: Grupo 7,5
7. Regrese al animal a su jaula y controle la respiración y el comportamiento durante 5-10 minutos.

5. Prueba de secreción lagrimal (prueba de lágrima de Schirmer, STT)

1. Crea una tira de papel de filtro modificada para las ratas¹¹. Corta la mitad de la tira de papel de filtro utilizada para las personas a lo largo de la línea central (1 mm × 15 mm) y recorta la cabeza de la tira para que quede lisa.
   NOTA: Antes de realizar la prueba de secreción lagrimal, sujete manualmente el cuerpo de la rata para evitar el movimiento y asegurar la exposición de los ojos de la rata.
2. Coloque la tira de papel de filtro en el 1/3 exterior del saco conjuntival del párpado inferior de la rata.
3. Cronometra la prueba durante 5 min. Controle el cierre de los ojos de la rata durante todo el procedimiento.
4. Después de medir, use pinzas para sujetar la tira de papel de filtro en un tubo de microcentrífuga y registre el volumen de lágrima haciendo una marca en la pared del tubo.
5. Mida la secreción de lágrimas el día 0, el día 1, el día 3, el día 5, el día 7, el día 11, el día 15 y el día 19.

6. Tinción con fluoresceína corneal

1. Dejar caer 0,5 μL de solución de fluoresceína sódica al 0,5% en el saco conjuntival inferior de cada rata.
2. Observe la córnea bajo luz azul durante 3 minutos después de la instilación con fluoresceína.
3. Registre la tinción de fluorescencia de la córnea de cada rata y observe si hay un defecto corneal.
4. Realice la tinción con fluoresceína corneal el día 0, el día 1, el día 3, el día 5, el día 7, el día 11, el día 15 y el día 19.

7. Observación histológica del tejido conjuntival

1. Una vez finalizado el desarrollo del modelo, anestesiar profundamente a las ratas con una inyección intraperitoneal de 0,4 mL/100 g de hidrato acuoso de cloral al 10% para aliviar la tensión de los animales. Luego, sacrificar a las ratas por dislocación cervical.
2. Tome la conjuntiva bulbar de las mismas regiones de cada rata, con un tamaño aproximado de 2 mm x 2 mm.
3. Fijar los tejidos inmediatamente en paraformaldehído al 4% durante 24 h e incrustar en parafina¹³.
4. Corte secciones de 5 μm de espesor y tiña con hematoxilina y eosina (HE)¹⁴ y tinción de ácido peryódico-Schiff (PAS) (siga las instrucciones del fabricante).

8. Observación histológica del tejido de la glándula corneal y lagrimal

1. Después de completar el desarrollo del modelo, eutanasiar a la rata como se describe en el paso 7.1.
2. Tome la córnea del lado derecho de cada rata y fíjela inmediatamente en una solución de paraformaldehído al 4%.
3. Corte la epidermis cefálica y el tejido subcutáneo a lo largo de la línea que conecta la oreja y la esquina exterior del ojo, expanda la incisión a ambos lados y aísle aún más la glándula extraorbitaria amarillenta.
4. Retire completamente el pelaje de la rata y separe la glándula extraorbitaria con una solución de cloruro de sodio al 0,9%.
5. Colocar las glándulas extraorbitarias aisladas en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h e incrustarlas en parafina.
6. Corte secciones continuas de ~5 μm de espesor y tiña con HE para muestras de tejido de glándulas corneales y extraorbitarias.

9. Análisis estadístico

1. Utilizar un software adecuado para el análisis estadístico de los datos.
   1. Realice un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para analizar los datos y la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) para la comparación entre grupos. Establezca el nivel de significación estadística en α = 0,05, donde P < 0,05 indica significación estadística.
      NOTA: Para el análisis estadístico de los datos experimentales se utilizó el programa SPSS 20.

Resultados

Prueba Schirmer I, SIT I
El volumen lagrimal de las ratas se midió en los días 0, 3, 5, 7, 11, 15 y 19 después del inicio del experimento. Los resultados experimentales mostraron que la secreción lagrimal del grupo escopolamina (grupo 2,5, grupo 5, grupo 7,5), en comparación con el grupo control (grupo 0), disminuyó significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0,01). No hubo significación estadística entre el grupo 2,5, el grupo 5 y el grupo 7,5 (P > 0,05). No s...

Discusión

El ojo seco con deficiencia acuosa (ADDE) es un tipo importante de ojo seco, que representa aproximadamente 1/3 de la población total de ojo seco¹⁷, y la principal causa de ADDE es el daño patológico y la inflamación de la glándula lagrimal¹³. Para este tipo de ojo seco, los métodos de tratamiento clínico más comunes son las lágrimas artificiales para aliviar los síntomas o la aplicación tópica de esteroides o ciclosporina¹⁸, mientras que...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418