Skopolamin Kaynaklı Gözyaşı Bezi Disfonksiyonu Olan Bir Sıçan Kuru Göz Modeli

Özet

Burada, sulu eksikliği olan kuru göz çalışmasına bir temel sağlamak için bir sıçan lakrimal bez disfonksiyonu modeli oluşturuyoruz.

Özet

Sulu eksik kuru göz (ADDE), gözyaşı salgısı miktarının ve kalitesinin azalmasına neden olabilen bir tür kuru göz hastalığıdır. Uzun süreli anormal gözyaşı üretimi, kornea hasarı ve iltihaplanma dahil olmak üzere oküler yüzey ortamında bir rahatsızlığa yol açabilir. Ağır vakalarda, ADDE görme kaybına ve hatta körlüğe neden olabilir. Şu anda, kuru göz tedavisi, yalnızca göz rahatsızlığı semptomlarını hafifletebilen ve kuru göz sendromunu temel olarak tedavi edemeyen göz damlası veya fizik tedavi ile sınırlıdır. Kuru gözde gözyaşı bezinin işlevini eski haline getirmek için, skopolamin tarafından indüklenen sıçanlarda gözyaşı bezi disfonksiyonunun bir hayvan modelini oluşturduk. Gözyaşı bezi, kornealar, konjonktivalar ve diğer faktörlerin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi yoluyla, ADDE'nin patolojik değişikliklerinin tam olarak anlaşılmasını sağlamayı amaçlıyoruz. Mevcut kuru göz faresi modeliyle karşılaştırıldığında, bu ADDE hayvan modeli, gözyaşı bezinin işlevsel bir değerlendirmesini içerir ve ADDE'de gözyaşı bezi disfonksiyonunu incelemek için daha iyi bir platform sağlar.

Giriş

2021 yılına kadar, insanların yaklaşık %12'si kuru gözlerden önemli ölçüde etkileniyor¹ ve bu da onu en yaygın kronik göz hastalıklarından biri haline getiriyor. Göz kuruluğu, hastalığı etkileyen farklı faktörlere bağlı olarak iki türe ayrılabilir: sulu eksik kuru göz (ADDE) ve evaporatif kuru göz (EDE)². ADDE ayrıca Sjögren sendromu (SS) ve SS dışı olarak ikiye ayrılır, ancak klinik^3'te kuru göz hastalarının çoğunluğu SS olmayan hastalardır. Kronik kuru göz belirtileri hastaların görme kalitesini ciddi şekilde etkiler. Şu anda, DED'in geleneksel tedavisi, oküler yüzeyi yağlamak için suni gözyaşı uygulamasını ve göz kapaklarının fizik tedavisini içermektedir. Bununla birlikte, kuru göz sendromu birçok durumda tam bir tedavi sunmayabilir. Bu nedenle, kuru göz hastalığının patogenezini araştırmak, yeni tedavilerin ve ilaçların geliştirilmesi için çok önemlidir. Kuru göz sendromunun hayvan modelleri, daha fazla araştırma için bir temel sağlar.

Hormon seviyelerini değiştirerek gözyaşı salgı seviyelerini değiştirmek de dahil olmak üzere, kuru göz sendromu^4'ün hayvan modellerini oluşturmanın birçok yolu vardır. Örneğin, sıçanların testislerinin çıkarılması androjen sekresyonunu azaltabilir, gözyaşı sekresyonunu artırabilir ve gözyaşlarında serbest salgı bileşeni (SC) ve IgA konsantrasyonunu azaltabilir ^5,6. Diğer bir yöntem ise bezi kontrol eden göz yüzeyi sinirlerinin çıkarılarak gözyaşı bezindeki otoimmün reaksiyonların gösterilmesidir. Ek olarak, gözyaşı bezinin cerrahi olarak çıkarılmasıyla gözyaşı salgısının doğrudan azaltılması sağlanabilir⁷. Değişen çevresel koşullar da gözyaşı buharlaşmasını hızlandırabilir. Örneğin, hayvanların düşük nem ve kuru havalandırma koşullarında kültürlenmesi, kuru gözün şiddetini artırmak için diğer yöntemlerle birleştirilebilen bir aşırı buharlaşmalı kuru göz⁸ modeli oluşturabilir. Kuru göz deneysel modellerini indüklemek için kullanılan ana ilaçlar atropin ve skopolamin^9'dur. Parasempatik inhibitörler olarak, her ikisi de gözyaşı bezindeki kolinerjik (muskarinik) reseptörlerin farmakolojik blokajını indükleyebilir ve gözyaşı sekresyonunu inhibe edebilir. Atropin kas enjeksiyonunun¹⁰ neden olduğu kuru gözlerle karşılaştırıldığında, skopolamin salgı bezleri üzerinde daha güçlü bir inhibitör etkiye, daha uzun bir ilaç etkisi süresine ve kardiyak, ince bağırsak ve bronşiyal düz kaslar üzerinde daha zayıf etkilere sahiptir. Kuru göz hayvan modelleri için en olgun ilaçlardan biridir.

Skopolamin ile kuru gözü indüklemek için deri altı enjeksiyon, ilaç pompası veya yama uygulaması gibi farklı yöntemler kullanılabilir ^4,11,12. Deney hayvanlarına ilaç uygulama sıklığını azaltmak için, birçok araştırmacı farelerin kuyruklarına transdermal yamalar uygular veya ilaç pompaları kullanır. Ancak, bu yöntemlerin her ikisinin de sınırlamaları vardır. Örneğin, transdermal yamaların emiliminin, tutarsız ilaç dozajına yol açabilecek farelerin bireysel emilimini hesaba katması gerekir. İlaç pompaları her uygulamanın dozajını doğru bir şekilde kontrol edebilse de, verilen ilaçla veya kullanılan konsantrasyonla her zaman uyumlu değildir. Ayrıca cerrahi olarak yerleştirilmeleri gerekir - bu hayvan için daha invazivdir, anestezik bir olay gerektirir ve ayrışma gibi cerrahi sonrası komplikasyonlar için potansiyel vardır. Deri altı enjeksiyon, daha hantal olmasına rağmen, her uygulama için doğru dozajı sağlayabilir ve farklı sıçanlar arasında ilaç uygulamasında tutarlılığı koruyabilir. Aynı zamanda, daha düşük bir maliyete sahiptir ve çok sayıda hayvan deneyi yapmak için uygundur.

Bu çalışma, kuru göz sıçan modeli oluşturmak için tekrarlanan subkutan skopolamin enjeksiyonunu uygulamaktadır. Kornea defektleri, gözyaşı salgı seviyeleri ve kornea, konjonktiva ve gözyaşı bezinin patolojik morfolojisi gibi kuru göz göstergelerini analiz ediyoruz. İlaç konsantrasyonunu, patolojik belirtileri ve kuru göz semptomlarını birleştirerek, kuru göz sıçan modelini ayrıntılı olarak detaylandırıyoruz ve kuru göz tedavisi ve patolojik mekanizmaların incelenmesi için daha doğru deneysel veriler sağlıyoruz. Ayrıca gelecekteki araştırmacılar için modelleme sürecini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Protokol

Bu protokole uygun olarak yapılan tüm hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı altında gerçekleştirilmektedir.

1. Hayvan hazırlama

1. 160 g ± 20 g ağırlığında 12 sağlıklı 6 haftalık SPF Wistar dişi sıçan hazırlayın.
2. Tüm sıçanların göz koşullarını incelemek için bir yarık lamba ve oftalmoskop kullanın, ön segment veya retina hastalığı olmadığından emin olun.
3. Tüm fareleri 1 hafta boyunca yeterli yiyecek ve su kaynakları ile büyütün.
4. Tüm sıçanlar rastgele normal, skopolamin ilaç konsantrasyonu 2.5 mg / mL, skopolamin ilaç konsantrasyonu 5 mg / mL ve skopolamin ilaç konsantrasyonu 7.5 mg / mL gruplarına ayrıldı ve her grupta üç hayvan vardı.

2. Çözelti hazırlama

1. 7.5 mg/mL, 5 mg/mL ve 2.5 mg/mL konsantrasyonlarında bir çözelti yapmak için skopolamin hidrobromürü %0.9 sodyum klorür çözeltisi içinde çözerek hazırlayın.
2. Sıçanların kontrol grubu için enjeksiyon olarak kullanılmak üzere skopolamin hidrobromür içermeyen% 0.9'luk bir sodyum klorür çözeltisi hazırlayın.

3. Ekipman ve malzeme hazırlama

1. Küçük bir hayvan mikroskobu hazırlayın.
2. İğneli 1 mL tek kullanımlık şırınga (26 G) dahil olmak üzere deney için malzemeler hazırlayın; floresein sodyum oftalmik şeritler; Schirmer yırtılma test şeridi; mutlak etanol; % 4 paraformaldehit; Ksilen; nötr balsam; hematoksilen, eozin; ve periyodik asit-Schiff boyama kiti.

4. Deri altı enjeksiyon

NOT: Bu prosedür, farelerin güvenliğini sağlamaya yardımcı olmak için ikinci bir kişiden yardım gerektirir.

1. Sıçanın vücudunu sabit tutun ve sol (veya sağ) arka ayaklarını yakalayın ve gerin.
   NOT: Bir asistan hayvanı tutmaya yardımcı olabilir.
2. Enjeksiyon bölgesini alkolle temizleyin.
3. İğneli 1 mL tek kullanımlık şırıngayı (26 G) başparmak ve parmak arasındaki cilt kıvrımının tabanına yerleştirin.
4. Şırınga pistonunu geri çekerek şırıngayı aspire edin. Şırıngadaki herhangi bir kan, iğnenin yanlış yerleştirildiğini gösterir; İğneyi çıkarın ve yeniden konumlandırın.
5. Sabit, akıcı bir hareketle skopolamin hidrobromürlü veya skopolamin hidrobromür olmadan% 0.9 sodyum klorür çözeltisi uygulayın.
6. Tüm sıçanlara farklı konsantrasyonlara göre, her seferinde 0.5 mL ve günde dört kez (9:00, 12:00, 15:00 ve 18:00'de) art arda 19 günlük bir süre boyunca, sol ve sağ ekstremiteler arasında dönüşümlü olarak enjekte edin.
   NOT: Gruplar aşağıdaki gibi adlandırılır:
   Skopolamin hidrobromür içermeyen grup: 0 grup (kontrol)
   Skopolamin hidrobromürlü grup 2.5 mg/mL: 2.5 grup
   Skopolamin hidrobromürlü grup 5 mg/mL: 5 grup
   Skopolamin hidrobromürlü grup 7.5 mg/mL: 7.5 grup
7. Hayvanı kafesine geri koyun ve 5-10 dakika boyunca solunum ve davranışlarını izleyin.

5. Gözyaşı sekresyon testi (Schirmer gözyaşı testi, STT)

1. Sıçanlar için değiştirilmiş bir filtre kağıdı şeridi oluşturun¹¹. İnsanlar için kullanılan filtre kağıdı şeridinin yarısını merkez çizgisi boyunca (1 mm × 15 mm) kesin ve pürüzsüz hale getirmek için şeridin başını kesin.
   NOT: Gözyaşı salgı testini yapmadan önce, hareketi önlemek ve sıçanın gözlerinin açıkta kalmasını sağlamak için sıçanın vücudunu manuel olarak kısıtlayın.
2. Filtre kağıdı şeridini sıçanın alt göz kapağı konjonktival kesesinin dış 1 / 3'üne yerleştirin.
3. Testi 5 dakika boyunca zamanlayın. İşlem boyunca sıçanın gözlerinin kapanmasını kontrol edin.
4. Ölçümden sonra, filtre kağıdı şeridini bir mikrosantrifüj tüpüne sıkıştırmak için cımbız kullanın ve tüpün duvarında bir işaret yaparak yırtılma hacmini kaydedin.
5. Gözyaşı salgısını 0. gün, 1. gün, 3. gün, 5. gün, 7. gün, 11. gün, 15. gün ve 19. günde ölçün.

6. Kornea floresein boyama

1. Her sıçanın alt konjonktival kesesine 0.5 μL% 0.5 floresein sodyum çözeltisi bırakın.
2. Floresein damlatıldıktan sonra korneayı 3 dakika boyunca mavi ışık altında gözlemleyin.
3. Her sıçanın korneasının floresan boyamasını kaydedin ve kornea kusuru olup olmadığını gözlemleyin.
4. 0. gün, 1. gün, 3. gün, 5. gün, 7. gün, 11. gün, 15. gün ve 19. günde korneal floresein boyama işlemi gerçekleştirin.

7. Konjonktival dokunun histolojik gözlemi

1. Model geliştirmeyi tamamladıktan sonra, hayvanların gerginliğini hafifletmek için sıçanları 0.4 mL / 100 g% 10 sulu kloral hidrat intraperitoneal enjeksiyonu ile derinlemesine uyuşturun. Daha sonra, sıçanları servikal çıkık ile ötenazi yapın.
2. Bulbar konjonktivayı her sıçanın aynı bölgelerinden, yaklaşık 2 mm x 2 mm boyutlarında alın.
3. Dokuları hemen% 4 paraformaldehit içinde 24 saat sabitleyin ve parafin¹³ içine gömün.
4. 5 μm kalınlığında kesitler kesin ve hematoksilen ve eozin (HE)¹⁴ ve periyodik asit-Schiff (PAS) boyası ile boyayın (üreticinin talimatlarına uyun).

8. Kornea ve gözyaşı bezi dokusunun histolojik gözlemi

1. Model geliştirmeyi tamamladıktan sonra, adım 7.1'de açıklandığı gibi sıçanı ötenazi yapın.
2. Korneayı her sıçanın sağ tarafına alın ve hemen% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.
3. Sefalik epidermisi ve deri altı dokusunu kulağı ve gözün dış köşesini birbirine bağlayan çizgi boyunca kesin, kesiyi her iki tarafa genişletin ve sarımsı ekstra orbital bezi daha da izole edin.
4. Sıçanın kürkünü iyice çıkarın ve ekstraorbital bezi% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile ayırın.
5. İzole edilmiş ekstraorbital bezleri 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine yerleştirin ve parafine gömün.
6. ~5 μm kalınlığında sürekli kesitler kesin ve kornea ve ekstraorbital bez dokusu örnekleri için bunları HE ile boyayın.

9. İstatistiksel analiz

1. Verilerin istatistiksel analizi için uygun yazılımı kullanın.
   1. Verileri analiz etmek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve gruplar arasında karşılaştırma için en az anlamlı fark (LSD) testi yapın. İstatistiksel anlamlılık düzeyini α = 0.05 olarak ayarlayın, P < 0.05 istatistiksel anlamlılığı gösterir.
      NOT: Deneysel verilerin istatistiksel analizi için SPSS 20 paket programı kullanılmıştır.

Sonuçlar

Schirmer I testi, SIT I
Sıçanların gözyaşı hacmi, deneyin başlamasından sonraki 0, 3, 5, 7, 11, 15 ve 19. günlerde ölçüldü. Deneysel sonuçlar, skopolamin grubunun (2.5 grup, 5 grup, 7.5 grup) gözyaşı sekresyonunun kontrol grubuna (0 grup) göre anlamlı olarak azaldığını ve farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterdi (P < 0.01). 2.5 grubu, 5 grubu ve 7.5 grubu arasında istatistiksel anlamlılık yoktu (P > 0.05). Gün sayısı açısından farklı gruplar arasında ...

Tartışmalar

Sulu eksikliği olan kuru göz (ADDE), toplam kuru göz popülasyonunun yaklaşık 1/3'ünü oluşturan önemli bir kuru göz türüdür¹⁷ ve ADDE'nin ana nedeni gözyaşı bezi patolojik hasarı ve inflamasyonudur¹³. Bu tip kuru göz için en yaygın klinik tedavi yöntemleri, semptomları hafifletmek için suni gözyaşları veya steroid veya siklosporin^18'in topikal uygulamasıdır, ancak gözyaşı bezine verilen hasar için çok az tedavi seçen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	SJZ No.4 Pharmaceutical	H13023201
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd	G1113
Absolute ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218
Fluorescein sodium ophthalmic strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-YG-I
Hematoxylin and eosin	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	D006
Neutral balsam	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	G8590
Paraffin	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	YA0012
Periodic Acid-Schiff Staining Kit	Beyotime Biotechnology	C0142S
Schirmer tear test strips	Tianjin Yinuoxinkang Medical Device Tech Co., Ltd	YN-LZ-I
Scopolamine hydrobromide	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	S860151
Small animal microscope	Head Biotechnology Co,. Ltd	ZM191
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418