A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
نقدم طريقة آلية عالية الإنتاجية لتحديد كمية مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية ، إلى جانب نهج الصبغة المزدوجة المعتمد على نفاذية الغشاء.
العدلات هي خلايا سلالة نخاعية تشكل جزءا مهما من جهاز المناعة الفطري. كشف العقد الماضي عن أدوار رئيسية إضافية تلعبها العدلات في التسبب في السرطان وأمراض المناعة الذاتية ومختلف الحالات الالتهابية الحادة والمزمنة من خلال المساهمة في بدء وإدامة عدم التنظيم المناعي من خلال آليات متعددة ، بما في ذلك تشكيل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي هياكل حاسمة في الدفاع عن مضادات الميكروبات. أدت القيود المفروضة على تقنيات تحديد تكوين الشبكة بطريقة غير متحيزة وقابلة للتكرار وفعالة إلى تقييد قدرتنا على فهم دور العدلات في الصحة والأمراض. نحن نصف طريقة آلية في الوقت الفعلي وعالية الإنتاجية لتحديد كمية العدلات التي تخضع لتشكيل NET باستخدام منصة تصوير الخلايا الحية إلى جانب نهج الصبغة المزدوجة المعتمد على نفاذية الغشاء باستخدام صبغتين مختلفتين من الحمض النووي لتصوير الحمض النووي داخل الخلايا وخارجها. هذه المنهجية قادرة على المساعدة في تقييم فسيولوجيا العدلات واختبار الجزيئات التي يمكن أن تستهدف تكوين الشبكة.
مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) هي هياكل كروماتين تشبه الويب يتم بثوقها من العدلات استجابة للمحفزات الالتهابية المختلفة. تتكون الشبكات من الحمض النووي والهستونات والعديد من البروتينات / الببتيدات المضادة للميكروبات ، والتي تحبس وتقتل مسببات الأمراض المعدية وتستدعي الاستجابات الالتهابية1.
في حين أن الشبكات مفيدة للدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض ، فقد جذبت الانتباه كمحرك محتمل لمختلف أمراض المناعة الذاتية2 ، والتخثر3 ، وأمراض التمثيل الغذائي4 ، والنمو النقيلي للسرطانات5. على هذا النحو ، فإن تثبيط تكوين NET هو خيار علاجي محتم....
تم الحصول على العدلات من البشر الأصحاء بعد تقديم الموافقة المستنيرة بموجب البروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). يتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للمعاهد الوطنية للصحة.
1. تلطيخ العدلات وإعداد لوحة الفحص
توفر هذه الطريقة تباين الطور ، وصور الفلورسنت الأحمر (صبغة نفاذة للغشاء) وفلورسنت أخضر (صبغة غير منفذة للغشاء) تم التقاطها في كل نقطة زمنية. جنبا إلى جنب مع عملية تشكيل NET ، لوحظت التغيرات المورفولوجية في تباين الطور والصور الفلورية الحمراء ، وبمجرد اختراق الغشاء ، يمكن ملاحظة مضان أخضر (
الطرق الحالية لقياس الشبكات خارج الجسم الحي لها العديد من العيوب التي تحد من قدرتنا على دراسة العدلات والشبكات والأهداف العلاجية المحتملة بطريقة غير متحيزة وعالية الإنتاجية10,14. على سبيل المثال ، العد المباشر للخلايا المكونة ل NET بعد التلوين المناعي ، .......
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
نشكر قسم التصوير بالضوء في مكتب العلوم والتكنولوجيا في المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة (ZIA AR041199).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved