A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم طريقة آلية عالية الإنتاجية لتحديد كمية مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية ، إلى جانب نهج الصبغة المزدوجة المعتمد على نفاذية الغشاء.

Abstract

العدلات هي خلايا سلالة نخاعية تشكل جزءا مهما من جهاز المناعة الفطري. كشف العقد الماضي عن أدوار رئيسية إضافية تلعبها العدلات في التسبب في السرطان وأمراض المناعة الذاتية ومختلف الحالات الالتهابية الحادة والمزمنة من خلال المساهمة في بدء وإدامة عدم التنظيم المناعي من خلال آليات متعددة ، بما في ذلك تشكيل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي هياكل حاسمة في الدفاع عن مضادات الميكروبات. أدت القيود المفروضة على تقنيات تحديد تكوين الشبكة بطريقة غير متحيزة وقابلة للتكرار وفعالة إلى تقييد قدرتنا على فهم دور العدلات في الصحة والأمراض. نحن نصف طريقة آلية في الوقت الفعلي وعالية الإنتاجية لتحديد كمية العدلات التي تخضع لتشكيل NET باستخدام منصة تصوير الخلايا الحية إلى جانب نهج الصبغة المزدوجة المعتمد على نفاذية الغشاء باستخدام صبغتين مختلفتين من الحمض النووي لتصوير الحمض النووي داخل الخلايا وخارجها. هذه المنهجية قادرة على المساعدة في تقييم فسيولوجيا العدلات واختبار الجزيئات التي يمكن أن تستهدف تكوين الشبكة.

Introduction

مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) هي هياكل كروماتين تشبه الويب يتم بثوقها من العدلات استجابة للمحفزات الالتهابية المختلفة. تتكون الشبكات من الحمض النووي والهستونات والعديد من البروتينات / الببتيدات المضادة للميكروبات ، والتي تحبس وتقتل مسببات الأمراض المعدية وتستدعي الاستجابات الالتهابية1.

في حين أن الشبكات مفيدة للدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض ، فقد جذبت الانتباه كمحرك محتمل لمختلف أمراض المناعة الذاتية2 ، والتخثر3 ، وأمراض التمثيل الغذائي4 ، والنمو النقيلي للسرطانات5. على هذا النحو ، فإن تثبيط تكوين NET هو خيار علاجي محتم....

Protocol

تم الحصول على العدلات من البشر الأصحاء بعد تقديم الموافقة المستنيرة بموجب البروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). يتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للمعاهد الوطنية للصحة.

1. تلطيخ العدلات وإعداد لوحة الفحص

  1. أخذ الدم المحيطي بموافقة خطية مستنيرة مناسبة باتباع إرشادات كل معهد وعزل العدلات باستخدام أي طريقة مرغوبة. على سبيل المثال ، طريقة Ficoll-dextran 10,11 هي طريقة شائعة الاستخدام لعزل العدلات من الدم المحيطي البشري.
    ملاحظة: على الرغم من أن الطريقة التي تمت مناقشتها هنا تستخدم العد....

النتائج

توفر هذه الطريقة تباين الطور ، وصور الفلورسنت الأحمر (صبغة نفاذة للغشاء) وفلورسنت أخضر (صبغة غير منفذة للغشاء) تم التقاطها في كل نقطة زمنية. جنبا إلى جنب مع عملية تشكيل NET ، لوحظت التغيرات المورفولوجية في تباين الطور والصور الفلورية الحمراء ، وبمجرد اختراق الغشاء ، يمكن ملاحظة مضان أخضر (

Discussion

الطرق الحالية لقياس الشبكات خارج الجسم الحي لها العديد من العيوب التي تحد من قدرتنا على دراسة العدلات والشبكات والأهداف العلاجية المحتملة بطريقة غير متحيزة وعالية الإنتاجية10,14. على سبيل المثال ، العد المباشر للخلايا المكونة ل NET بعد التلوين المناعي ، .......

Disclosures

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر قسم التصوير بالضوء في مكتب العلوم والتكنولوجيا في المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة (ZIA AR041199).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AKT inhibitorCalbiochem124028
Clear 96-well plateCorning3596
Live cell analysis systemSartoriusN/AIncucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye Thermo Fisher ScientificS7020
Nuclear red dyeEnzoENZ-52406Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMIThermo Fisher Scientific11835030Phenol red containig RPMI can be used.

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved