Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Resumo

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Resumo

Os neutrófilos são células de linhagem mieloide que formam uma parte crucial do sistema imune inato. A última década revelou papéis chave adicionais que os neutrófilos desempenham na patogênese do câncer, doenças autoimunes e várias condições inflamatórias agudas e crônicas, contribuindo para o início e perpetuação da desregulação imunológica por meio de múltiplos mecanismos, incluindo a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são estruturas cruciais na defesa antimicrobiana. Limitações nas técnicas para quantificar a formação de NET de forma imparcial, reprodutível e eficiente têm restringido nossa capacidade de entender melhor o papel dos neutrófilos na saúde e nas doenças. Descrevemos um método automatizado, em tempo real e de alto rendimento para quantificar neutrófilos submetidos à formação de NET usando uma plataforma de imagem de células vivas acoplada a uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana usando dois corantes de DNA diferentes para obter imagens de DNA intracelular e extracelular. Essa metodologia é capaz de ajudar a avaliar a fisiologia dos neutrófilos e testar moléculas que podem ter como alvo a formação de NET.

Introdução

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas de cromatina semelhantes a teias extrudadas de neutrófilos em resposta a vários estímulos inflamatórios. As NETs são compostas por DNA, histonas e várias proteínas/peptídeos antimicrobianos, que aprisionam e matam patógenos infecciosos e invocam respostas inflamatórias¹.

Embora os TNEs sejam benéficos para a defesa do hospedeiro contra patógenos, eles têm chamado a atenção como um potencial impulsionador de várias doenças autoimunes², trombose³, doenças metabólicas⁴ e crescimento meta....

Protocolo

Os neutrófilos de indivíduos humanos saudáveis foram obtidos após o consentimento informado fornecido de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do National Institutes of Health (NIH). O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do NIH.

1. Coloração dos neutrófilos e preparação da placa de ensaio

1. Tomar sangue periférico com consentimento informado por escrito apropriado, seguindo as diretrizes de cada instituto e isolar neutrófilos usando qualquer método desejado. Por exemplo, o método Ficoll-dextran ^10,11

Discussão

Os métodos atuais para quantificar NETs ex vivo têm várias desvantagens que limitam nossa capacidade de estudar neutrófilos, NETs e potenciais alvos terapêuticos de forma imparcial e de alto rendimento^10,14. Por exemplo, a contagem direta de células formadoras de NETs após a coloração por imunofluorescência, considerada o padrão-ouro para quantificação de NETs, é de baixo rendimento e dependente da visão subjetiva do operador. Um ensaio em.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.