Высокопроизводительный метод количественной оценки образования внеклеточных ловушек нейтрофилов в нейтрофилах человека в режиме реального времени

Резюме

Мы представляем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) с использованием системы анализа живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны.

Аннотация

Нейтрофилы – это клетки миелоидной линии, которые составляют важнейшую часть врожденной иммунной системы. Последнее десятилетие выявило дополнительные ключевые роли, которые нейтрофилы играют в патогенезе рака, аутоиммунных заболеваний и различных острых и хронических воспалительных состояний, способствуя инициированию и сохранению иммунной дисрегуляции с помощью многочисленных механизмов, включая образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ), которые являются структурами, имеющими решающее значение для противомикробной защиты. Ограниченность методов количественной оценки образования НВЛ объективным, воспроизводимым и эффективным способом ограничила нашу способность к дальнейшему пониманию роли нейтрофилов в здоровье и болезнях. Мы описываем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения нейтрофилов, претерпевающих образование НВЛ, в режиме реального времени, с использованием платформы визуализации живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны, с использованием двух разных красителей ДНК для визуализации внутриклеточной и внеклеточной ДНК. Эта методика может помочь оценить физиологию нейтрофилов и протестировать молекулы, которые могут быть нацелены на образование НВЛ.

Введение

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) представляют собой паутиноподобные структуры хроматина, выдавливаемые из нейтрофилов в ответ на различные воспалительные стимулы. НВЛ состоят из ДНК, гистонов и различных антимикробных белков/пептидов, которые улавливают и убивают инфекционные патогены и вызывают воспалительные реакции¹.

В то время как НВЛ полезны для защиты организма от патогенов, они привлекли внимание как потенциальный фактор различных аутоиммунных заболеваний2, тромбоза³, метаболических заболеваний⁴ и метастатического роста рака⁵.

протокол

Нейтрофилы от здоровых людей были получены после того, как было предоставлено информированное согласие в соответствии с протоколом, утвержденным Национальным институтом здравоохранения (NIH) Институциональным наблюдательным советом (IRB). Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований на людях NIH.

1. Окрашивание нейтрофилов и подготовка пробирного планшета

1. Возьмите периферическую кровь с соответствующего письменного информированного согласия в соответствии с рекомендациями каждого института и изолируйте нейтрофилы любым желаемым методом. Например, метод Фиколла-декстрана^10,1....

Результаты

Этот метод позволяет получать фазово-контрастные, красные флуоресцентные (мембранопроницаемый краситель) и зеленые флуоресцентные (мембранонепроницаемый краситель) изображения, полученные в каждый момент времени. Наряду с процессом формирования НВЛ, морфологические изменения наблю.......

Обсуждение

Современные методы количественного определения НВЛ ex vivo имеют ряд недостатков, которые ограничивают нашу способность изучать нейтрофилы, НВЛ и потенциальные терапевтические мишени непредвзятым и высокопроизводительным^{способом.} Например, прямой .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.