Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) с использованием системы анализа живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны.

Аннотация

Нейтрофилы – это клетки миелоидной линии, которые составляют важнейшую часть врожденной иммунной системы. Последнее десятилетие выявило дополнительные ключевые роли, которые нейтрофилы играют в патогенезе рака, аутоиммунных заболеваний и различных острых и хронических воспалительных состояний, способствуя инициированию и сохранению иммунной дисрегуляции с помощью многочисленных механизмов, включая образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ), которые являются структурами, имеющими решающее значение для противомикробной защиты. Ограниченность методов количественной оценки образования НВЛ объективным, воспроизводимым и эффективным способом ограничила нашу способность к дальнейшему пониманию роли нейтрофилов в здоровье и болезнях. Мы описываем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения нейтрофилов, претерпевающих образование НВЛ, в режиме реального времени, с использованием платформы визуализации живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны, с использованием двух разных красителей ДНК для визуализации внутриклеточной и внеклеточной ДНК. Эта методика может помочь оценить физиологию нейтрофилов и протестировать молекулы, которые могут быть нацелены на образование НВЛ.

Введение

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) представляют собой паутиноподобные структуры хроматина, выдавливаемые из нейтрофилов в ответ на различные воспалительные стимулы. НВЛ состоят из ДНК, гистонов и различных антимикробных белков/пептидов, которые улавливают и убивают инфекционные патогены и вызывают воспалительные реакции1.

В то время как НВЛ полезны для защиты организма от патогенов, они привлекли внимание как потенциальный фактор различных аутоиммунных заболеваний2, тромбоза3, метаболических заболеваний4 и метастатического роста рака5.

протокол

Нейтрофилы от здоровых людей были получены после того, как было предоставлено информированное согласие в соответствии с протоколом, утвержденным Национальным институтом здравоохранения (NIH) Институциональным наблюдательным советом (IRB). Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований на людях NIH.

1. Окрашивание нейтрофилов и подготовка пробирного планшета

  1. Возьмите периферическую кровь с соответствующего письменного информированного согласия в соответствии с рекомендациями каждого института и изолируйте нейтрофилы любым желаемым методом. Например, метод Фиколла-декстрана10,1....

Результаты

Этот метод позволяет получать фазово-контрастные, красные флуоресцентные (мембранопроницаемый краситель) и зеленые флуоресцентные (мембранонепроницаемый краситель) изображения, полученные в каждый момент времени. Наряду с процессом формирования НВЛ, морфологические изменения наблю.......

Обсуждение

Современные методы количественного определения НВЛ ex vivo имеют ряд недостатков, которые ограничивают нашу способность изучать нейтрофилы, НВЛ и потенциальные терапевтические мишени непредвзятым и высокопроизводительнымспособом. Например, прямой .......

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Секцию световой визуализации Управления науки и технологий Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Национальных институтов здравоохранения. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Национальных институтов здоровья (ZIA AR041199).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AKT inhibitorCalbiochem124028
Clear 96-well plateCorning3596
Live cell analysis systemSartoriusN/AIncucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye Thermo Fisher ScientificS7020
Nuclear red dyeEnzoENZ-52406Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMIThermo Fisher Scientific11835030Phenol red containig RPMI can be used.

Ссылки

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены