ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

要約

本稿では、膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせた生細胞解析システムを利用して、好中球細胞外トラップ(NET)を定量する自動化されたハイスループット法を紹介します。

要約

好中球は、自然免疫系の重要な部分を形成する骨髄系細胞です。過去10年間で、好中球ががん、自己免疫疾患、およびさまざまな急性および慢性炎症状態の病因において果たす重要な役割は、抗菌防御に不可欠な構造である好中球細胞外トラップ(NET)の形成を含む複数のメカニズムを通じて免疫調節不全の開始と永続化に寄与することが明らかになりました。偏りがなく、再現性があり、効率的な方法でNET形成を定量化する技術の限界により、健康と疾患における好中球の役割をさらに理解する能力が制限されていました。本稿では、細胞内および細胞外のDNAをイメージングするために2つの異なるDNA色素を用いた膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせたライブセルイメージングプラットフォームを用いて、NET形成を受ける好中球を定量する自動化されたリアルタイムのハイスループット法について説明する。この方法論は、好中球の生理機能を評価し、NET形成を標的とすることができる分子をテストするのに役立ちます。

概要

好中球細胞外トラップ(NET)は、さまざまな炎症刺激に応答して好中球から押し出されるウェブ状のクロマチン構造です。NETは、DNA、ヒストン、およびさまざまな抗菌タンパク質/ペプチドで構成されており、感染性病原体を捕捉して殺し、炎症反応を引き起こします¹。

NETは病原体に対する宿主防御に有益である一方で、様々な自己免疫疾患²、血栓症³、代謝性疾患⁴、がんの転移増殖5の潜在的なドライバーとして注目^{されています。}そのため、NET形成の阻害は、これらの疾患の潜在的な治療選択肢です。しかし^{、いくつかの}有望なNETを標的とする分子が開発中であるにもかかわらず6、このメカニズムに特異的に作用する承認された治療法はまだありません。これは、少なくとも部分的には、NET形成のための客観的で、偏りがなく、再現性があり、ハイスループットの定量化方法の欠如に起因しています。

我々は、2色生細胞^{イメージングプラットフォームを利用した}新しい手法を確立し、報告^した

プロトコル

健康なヒト被験者からの好中球は、国立衛生研究所(NIH)治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに基づいてインフォームドコンセントが提供された後に取得されました。プロトコルは、NIHヒト研究倫理委員会のガイドラインに従います。

1. 好中球の染色とアッセイプレートの調製

1. 各施設のガイドラインに従って、適切な書面によるインフォームドコンセントで末梢血を採取し、任意の方法で好中球を分離します。例えば、フィコール-デキストラン法^10,11は、ヒト末梢血から好中球を単離するために一般的に使用される方法です。
   注:ここで説明する方法はヒト好中球を使用しますが、マウス好中球も同様のプロトコルを使用して分析できます。
2. 好中球をRoswell Park Memorial Institute(RPMI; 材料表を参照)1640培地で2.0 x 10⁶ 好中球/mLで再懸濁し、好中球懸濁液を1.5 mL遠心チューブに入れます。
   注:FBS中のアルブミンはNET形成を減少させる可能性があり¹² 、FBS中の熱安定性ヌクレアーゼはNETを分解する可能性があるため、通常はウシ胎児血清(FBS)を....

ディスカッション

ex vivoでNETを定量する現在の方法には、好中球、NET、および潜在的な治療標的を偏りのないハイスループットな方法で研究する能力を制限するいくつかの欠点があります^10,14。例えば、NETの定量のためのゴールドスタンダードと考えられている免疫蛍光染色後のNET形成細胞の直接計数は、スループットが低く、オペレーターの主観的な見方に?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.