Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Zusammenfassung

Neutrophile sind Zellen der myeloischen Linie, die einen entscheidenden Teil des angeborenen Immunsystems bilden. Das letzte Jahrzehnt hat zusätzliche Schlüsselrollen aufgezeigt, die Neutrophile bei der Pathogenese von Krebs, Autoimmunerkrankungen und verschiedenen akuten und chronischen Entzündungszuständen spielen, indem sie durch mehrere Mechanismen zur Initiierung und Aufrechterhaltung von Immundysregulation beitragen, einschließlich der Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile, die für die antimikrobielle Abwehr entscheidend sind. Einschränkungen bei den Techniken zur unvoreingenommenen, reproduzierbaren und effizienten Quantifizierung der NET-Bildung haben unsere Fähigkeit eingeschränkt, die Rolle von Neutrophilen bei Gesundheit und Krankheiten besser zu verstehen. Wir beschreiben eine automatisierte Echtzeit-Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung von Neutrophilen, die sich in der NET-Bildung befinden, unter Verwendung einer Lebendzell-Bildgebungsplattform in Verbindung mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz unter Verwendung von zwei verschiedenen DNA-Farbstoffen zur Abbildung intrazellulärer und extrazellulärer DNA. Diese Methodik ist in der Lage, die Physiologie von Neutrophilen zu bewerten und Moleküle zu testen, die auf die NET-Bildung abzielen können.

Einleitung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind netzartige Chromatinstrukturen, die als Reaktion auf verschiedene Entzündungsreize aus Neutrophilen extrudiert werden. NETs bestehen aus DNA, Histonen und verschiedenen antimikrobiellen Proteinen/Peptiden, die infektiöse Krankheitserreger einfangen und abtöten und Entzündungsreaktionen hervorrufen¹.

Während NETs für die Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger von Vorteil sind, haben sie als potenzieller Treiber verschiedener Autoimmunerkrankungen², Thrombosen³, Stoffwechselerkrankungen⁴ und metastasierend....

Protokoll

Neutrophile von gesunden Probanden wurden nach Einverständniserklärung gemäß dem vom National Institutes of Health (IRB) genehmigten Protokoll des National Institutes of Health (NIH) erhalten. Das Protokoll folgt den Richtlinien der NIH-Ethikkommission für die Humanforschung.

1. Färbung der Neutrophilen und Vorbereitung der Assay-Platte

1. Entnehmen Sie peripheres Blut mit entsprechender schriftlicher Einverständniserklärung gemäß den Richtlinien des jeweiligen Instituts und isolieren Sie Neutrophile mit einer beliebigen Methode. Beispielsweise ist die Ficoll-Dextran-Methode ^10,11

Diskussion

Aktuelle Methoden zur Quantifizierung von NETs ex vivo haben mehrere Nachteile, die unsere Fähigkeit einschränken, Neutrophile, NETs und potenzielle therapeutische Ziele unvoreingenommen und mit hohem Durchsatz zu untersuchen^10,14. Beispielsweise ist die direkte Zählung von NET-bildenden Zellen nach der Immunfluoreszenzfärbung, die als Goldstandard für die Quantifizierung von NETs gilt, mit geringem Durchsatz verbunden und hängt von der subjektiven.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.