JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نصف بروتوكولا عاما وتصميما منهجيا يمكن تطبيقه لفصل المكونات المعقدة والتعرف عليها في عشب اليارو الألبي ، Achillea millefolium L. ، وهو دواء عشبي صيني.

Abstract

طب الأعشاب الصيني معقد ويحتوي على العديد من المركبات غير المعروفة ، مما يجعل البحث النوعي أمرا بالغ الأهمية. يعد قياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة رباعي الأقطاب الكروماتوغرافيا السائل فائق الأداء الطريقة الأكثر استخداما في التحليل النوعي للمركبات. تتضمن الطريقة بروتوكولات موحدة ومبرمجة للمعالجة المسبقة للعينات ، وضبط التصلب العصبي المتعدد ، واكتساب التصلب العصبي المتعدد ، ومعالجة البيانات. تشمل المعالجات المسبقة للعينات الجمع ، والسحق ، واستخراج المذيبات ، والموجات فوق الصوتية ، والطرد المركزي ، والترشيح. تم وصف المعالجة اللاحقة للبيانات بالتفصيل وتشمل استيراد البيانات ، وبناء قاعدة البيانات المنشأة ذاتيا ، وإنشاء الأساليب ، ومعالجة البيانات ، والعمليات اليدوية الأخرى. يستخدم الجزء الموجود فوق سطح الأرض من عشب اليارو الألبي ، Achillea millefolium L. ، لعلاج الالتهابات والاضطرابات المعدية المعوية والألم ويمكن أن تكون 3-oxa-guaianolides خيوطا مفيدة لتطوير الأدوية المضادة للالتهابات. تم تحديد ثلاثة مركبات تمثيلية في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، تجمع بين TOF-MS وقاعدة بيانات تم إنشاؤها ذاتيا. علاوة على ذلك ، تمت مناقشة الاختلافات عن الأدبيات الحالية ، وتحسين معلمات الطور السائل ، واختيار وضع المسح ، وملاءمة مصدر الأيونات ، وتعديل طاقة الاصطدام ، وفحص الأيزومر ، وتحديد الطريقة ، والحلول الممكنة. طريقة التحليل الموحدة هذه عالمية ويمكن تطبيقها لتحديد المركبات المعقدة في طب الأعشاب الصيني.

Introduction

جمع الطب الصيني أغنى المعرفة التجريبية في العالم1. أصبح التحليل النوعي للمكونات الكيميائية في طب الأعشاب الصيني التقليدي موضوعا حاسما في البحث2. من الصعب التمييز بين الاختلافات الكيميائية في طب الأعشاب الصيني بسبب تعقيد الفئة وتنويع الأصل3. تشمل أنواع المركبات الرئيسية في طب الأعشاب الصيني قلويدات ، صابونين ، فلافونويد ، أنثراكينون ، تربينويدات ، كومارين ، قشور ، عديد السكاريد ، عديد الببتيدات ،والبروتينات 1. ومع ذلك ، فإن فصل المركبات وتحديد الأيزومرات يعيق تطوير البحث النوعي حول طب الأعشاب الصيني.

يوفر الجمع بين الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) مع أعمدة الكروماتوغرافيا المناسبة دعما قويا لفصل المركبات المعقدة في طب الأعشاب الصيني4. في السنوات الأخيرة ، أصبح قياس الطيف الكتلي عالي الدقة شائعا بشكل متزايد في التحليل النوعي للأدوية العشبية الصينية. تشمل طرق قياس الطيف الكتلي عالية الدقة شائعة الاستخدام قياس الطيف الكتلي لوقت الطيران رباعي الأقطاب (Q-TOF-MS)5 ، وقياس الطيف الكتلي للمدار (Orbitrap-MS) 6 ، وقياس الطيف الكتلي للسيكلوترون الأيوني بتحويل فورييه (FT-ICR-MS) 7. يتمتع FT-ICR-MS بأعلى دقة ولكنه يستلزم تكاليف تشغيل وصيانةمكلفة 8. يتمتع Orbitrap-MS بمزايا في الكشف عن المركبات الجزيئية الصغيرة ، خاصة عند الأوزان الجزيئية التي تقل عن 500 Da9. Q-TOF-MS هي الطريقة الأكثر استخداما في التحليل النوعي للكيمياء الدوائية في المصل10،11. بالمقارنة مع قاعدة بيانات الشبكة التقليدية أو قاعدة البيانات التجارية ، أصبح التحليل المشترك مع قاعدة بيانات ذاتية الإنشاء لمعالجة البيانات شائعا بشكل متزايد.

عشب اليارو في جبال الألب ، Achillea millefolium L. (AML) ، وهو نوع من الأدوية العشبية الصينية ، ينمو بشكل رئيسي في شينجيانغ ومنغوليا الداخلية والمناطق الشمالية الشرقية من الصين12. يستخدم الجزء الموجود فوق سطح الأرض من ابيضاض الدم النقوي الحاد على نطاق واسع لعلاج الالتهابات واضطرابات الجهاز الهضمي والألم ، بما في ذلك الألم الروماتلي وآلام الأسنان وآلام المعدة13. توفر 3-oxa-guaianolides من AML إمكانات كبيرة كخيوط لتطوير الأدوية المضادةللالتهابات 14. تركز الدراسات الحالية على المكونات الكيميائية في ابيضاض الدم النقوي الحاد على السيسكويتيربينات ، والأحاديات ، والفلافونويد ، والمركبات الفينولية15. ومع ذلك ، لتحديد المركبات في ابيضاض الدم النقوي الحاد ، لا يتوفر مخطط تحريض نوعي منهجي يمكن استخدامه للأدوية العشبية الصينية الأخرى. تهدف هذه الدراسة إلى توفير تحديد موحد للمكونات الكيميائية في طب الأعشاب الصيني من خلال الجمع بين Q-TOF-MS وتحليل قاعدة البيانات الراسخة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. معالجة عينة

  1. مجموعة من الأدوية العشبية الصينية AML
    1. ازرع عشب اليارو الألبي ، بذور Achillea millefolium L. (AML) في الأرض في فبراير. اجمع الجزء الموجود فوق سطح الأرض من مكافحة غسل الأموال في يوليو من نفس العام (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: تم جمع AML المستخدم في هذه الورقة في منطقة جبلية على ارتفاع 400 متر في ميانيانغ ، سيتشوان ، الصين.
  2. علاج التجفيف
    1. اغسل كل AML الذي تم جمعه بالماء النقي لإزالة الرواسب والشوائب. جفف AML في فرن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (الشكل 1 ب).
  3. تحضير المسحوق
    1. بعد التجفيف ، قم بسحق ابيضاض الدم النقوي الحاد إلى مسحوق خشن باستخدام كسارة متعددة الوظائف عالية السرعة. مرر المسحوق من خلال منخل 50 شبكة (الشكل 1 ج).
  4. استخراج المذيبات
    1. ضع 1 جم من عينة AML الموزونة بدقة في قارورة مخروطية الشكل مع 30 مل من محلول ماء الإيثانول بنسبة 75٪ (الشكل 2 أ).
    2. استخرج الخليط في جهاز صوتي للحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية (الشكل 2 ب).
    3. جهاز الطرد المركزي للعينة عند 14,000 × جم لمدة 5 دقائق (الشكل 2 ج).
    4. قم بتركيب حقنة حقن بفلتر غشائي صغير يسهل اختراقه (0.22 ميكرومتر ، عضوي فقط) وقم بتصفية المادة الطافية في زجاجة عينة سعة 2 مل (الشكل 2 د).

2. لحن MS

  1. قم بتشغيل برنامج التحكم LC-MS (الشكل 3 أ). افتح وحدة ضبط MS وقم بتطهير محلول 1 نانوغرام / ميكرولتر ليوسين انسفالين (LE) مرتين.
  2. في لوحة التحكم في تدفق LockSpray ، اضبط معدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة وانقر فوق الزر Flow للسماح لمحلول LE بالدخول إلى مطياف الكتلة (الشكل 3 ب).
  3. انقر فوق الزر LockSpray Source Setup (إعداد مصدر LockSpray ) لإكمال نغمة MS في الوضع الإيجابي (الشكل 3C). انقر فوق الرمز السالب لتبديل وضع الأيونات. انقر فوق الزر LockSpray Source Setup لإكمال ضبط MS في الوضع السلبي.

3. الاستحواذ على MS

  1. قم بتعيين جدول تسلسل ، بما في ذلك اسم الملف وطريقة MS وملف المدخل والقارورة ووحدة التخزين. انقر فوق الزر "حفظ " لتسجيل جدول التسلسل.
  2. انقر فوق الزر " تشغيل " وزر "ابدأ" بالتسلسل (الشكل 3 د). حدد الخيار الحصول على عينة بيانات فقط . انقر فوق الزر "موافق " لبدء الحصول على البيانات.
  3. انقر فوق الزر Chromatogram لفتح نافذة الكروماتوجرام الأيوني الكلي في الوقت الفعلي (TIC) (الشكل 3E). انقر فوق الزر " عرض" وزر TIC بالتسلسل. حدد خيار BPI Chromatogram ، ثم انقر فوق الزر "موافق " لعرض نافذة مخطط كروماتوغرام الذروة الأساسي (BPI) (الشكل 3F).

4. معالجة البيانات

  1. قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات.
  2. انقر فوق الزر "عملي" وزر "استيراد بيانات MassLynx" بدوره للدخول إلى النافذة الفرعية (الشكل 4 أ). حدد ملفات البيانات الأولية وأدخل اسم مجموعة العينة ، ثم انقر فوق الزر "إنشاء مجموعة عينة UNIFI" لاستيراد البيانات الأولية لأطياف MS.
    ملاحظة: تأكد من استيراد البيانات الأولية الموجبة والسالبة بشكل منفصل.
  3. إنشاء قاعدة البيانات
    1. انقر فوق الزر "الإدارة " في النافذة الأولية (الشكل 4 ب). انقر فوق الزر استيراد عناصر المكتبة . حدد ملف قالب قاعدة البيانات بتنسيق .xlsx مع جميع الهياكل المركبة المنفصلة بتنسيق .mol في نفس المجلد.
    2. أدخل اسما لقاعدة البيانات. انقر فوق الزر "تحقق" للتأكد من عرض جميع المركبات. انقر فوق الزر "استيراد " لإنهاء إنشاء قاعدة بيانات ذاتية التأسيس.
      ملاحظة: يتم إعداد جميع المركبات الموجودة في ملفات تنسيق .mol المستقلة التي يجب استيرادها إلى قاعدة البيانات بناء على مراجع الأدبيات. يتم رسم ملفات الهيكل المركب بنفسه باستخدام برنامج الرسم.
  4. انقر فوق الزر إنشاء طريقة تحليل لفتح نافذة تابعة. انقر فوق الزر إنشاء طريقة عملية فقط لإنشاء طريقة معالجة البيانات.
  5. تحليل البيانات
    1. انقر فوق الزر "إنشاء تحليل" لفتح نافذة تابعة.
    2. انقر فوق الزر إنشاء تحليل من البيانات الموجودة ، ثم حدد البيانات المستوردة والطريقة المحددة.
    3. انقر فوق الزر "معالجة" لبدء حساب البيانات الطويلة (الشكل 4 د).
    4. انقر فوق الزر "تحقيق " للتبديل إلى نافذة TIC.
    5. انقر فوق الزر "تحديد التتبعات" وحدد TOF MSE BPI. انقر فوق الزر "استبدال الكل" لعرض BPI.
  6. انقر بزر الماوس الأيمن وحدد خيار إضافة عمود | عرض المعلومات المركبة ، بما في ذلك الاسم المركب ، والكتلة الطبيعية ، و m / z المرصود ، والخطأ الكتلي ، ووقت الاستبقاء المرصود (RT) ، وعدد الكاشف ، والاستجابة ، والمقاربات ، والتخصيصات البديلة ، والعدد الإجمالي للأجزاء التي تم العثور عليها (الشكل 4E).
  7. حدد خيار شظايا عالية الطاقة لعرض شظايا الطيف الكتلي الثانوي للمركب المحدد (الشكل 4F).
  8. ارسم مسارات الانقسام الجزيئي يدويا وفقا لكل جزء ثانوي (الشكل 4G).
    ملاحظة: يتم وصف الأمثلة بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم استخدام عشب اليارو في جبال الألب كنموذج لعرض النتيجة التمثيلية. كما هو موضح في الشكل 4G ، تحول الكيرسيتين -3'-O-glucoside مع m / z = 463.08935 إلى وسيط مع m / z = 300.02828 عن طريق فقدان جزيء سداسي أثناء تفاعل التحلل المائي. في مسار آخر ، أدى كسر رابطة C-C في الهيكل العظمي لهيكل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر قياس الطيف الكتلي عالي الدقة جنبا إلى جنب مع قاعدة بيانات ذاتية الإنشاء تقنية نوعية منهجية لتحديد المكونات الكيميائية في طب الأعشاب الصيني. على عكس قاعدة البيانات التجارية ، التي تحتوي على الطب الصيني التقليدي الشائع ، توفر قاعدة البيانات المنشأة ذاتيا والتي تستخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2022MD713780) ، وفريق الوراثة والابتكار في علاج الطب الصيني التقليدي للأمراض المناعية ، ومشروع تشونغتشينغ للبحث العلمي الطبي (المشروع المشترك بين لجنة الصحة في تشونغتشينغ ومكتب العلوم والتكنولوجيا) (2022DBXM007) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (cstc2018jcyjAX0370). مشروع خاص لحفز الأداء والتوجيه لمعهد تشونغتشينغ للبحوث العلمية (cstc2022jxjl120005 ، cstc2021jxjl130021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethyl acetateChuandongChemicalCAS 141-78-6
liquid chromatographWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-butyl alcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleum etherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometryWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData analysis software

References

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733(2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -J., Liao, X., Kuang, H. -M., Li, J. -Y., Zhang, S. -H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360(2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

UPLC Q TOF MS Achillea millefolium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved