Cromatografía líquida de ultra alta resolución-espectrometría de masas y análisis de bases de datos autoestablecidas de componentes de hierbas medicinales chinas

Resumen

Describimos un protocolo general y un diseño sistemático que podría aplicarse para separar y reconocer componentes complejos en la hierba de milenrama alpina, Achillea millefolium L., una medicina herbal china.

Resumen

La medicina herbal china es compleja y tiene numerosos compuestos desconocidos, lo que hace que la investigación cualitativa sea crucial. La cromatografía líquida de ultra alta resolución, espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (UPLC-Q-TOF-MS) es el método más utilizado en el análisis cualitativo de compuestos. El método incluye protocolos estandarizados y programados para el pretratamiento de muestras, la sintonía de MS, la adquisición de MS y el procesamiento de datos. Los pretratamientos de muestras incluyen recolección, pulverización, extracción con solventes, ultrasonidos, centrifugación y filtración. El posprocesamiento de datos se describió en detalle e incluye la importación de datos, la construcción de bases de datos autoestablecidas, el establecimiento de métodos, el procesamiento de datos y otras operaciones manuales. La parte aérea de la hierba de milenrama alpina, Achillea millefolium L., se utiliza para tratar la inflamación, los trastornos gastrointestinales y el dolor, y sus 3-oxa-guaianólidos podrían ser pistas útiles para el desarrollo de fármacos antiinflamatorios. Se identificaron tres compuestos representativos en la LMA, combinando TOF-MS con una base de datos autoestablecida. Además, se discutieron las diferencias con la literatura existente, la optimización de parámetros de fase líquida, la selección del modo de escaneo, la idoneidad de la fuente de iones, el ajuste de la energía de colisión, el cribado de isómeros, la limitación del método y las posibles soluciones. Este método de análisis estandarizado es universal y se puede aplicar para identificar compuestos complejos en la medicina herbal china.

Introducción

La medicina china ha acumulado el conocimiento empírico más rico del mundo¹. El análisis cualitativo de los componentes químicos en la medicina herbal tradicional china se ha convertido en un tema crucial en la investigación². Distinguir las diferencias químicas en la medicina herbal china es difícil debido a la complejidad de la categoría y la diversificación del origen³. Los principales tipos de compuestos en la medicina herbal china incluyen alcaloides, saponinas, flavonoides, antraquinonas, terpenoides, cumarinas, lignanos, polisacáridos, polipéptidos y proteínas^. Sin embargo, la separación de compuestos y la identificación de isómeros dificultan el desarrollo de la investigación cualitativa sobre la medicina herbal china.

La combinación de cromatografía líquida de ultra alta resolución (UPLC) con columnas de cromatografía adecuadas proporciona un fuerte apoyo para la separación de compuestos complejos en la medicina herbal china⁴. En los últimos años, la espectrometría de masas de alta resolución se ha vuelto cada vez más popular en el análisis cualitativo de la medicina herbal china. Los métodos de espectrometría de masas de alta resolución comúnmente utilizados incluyen la espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (Q-TOF-MS⁾⁵, la espectrometría de masas orbitrap (Orbitrap-MS)⁶ y la espectrometría de masas de ciclotrón iónico por transformada de Fourier (FT-ICR-MS)⁷. FT-ICR-MS tiene la resolución más alta, pero implica costosos costos de operación y mantenimiento⁸. Orbitrap-MS tiene ventajas en la detección de compuestos moleculares pequeños, especialmente a pesos moleculares inferiores a 500 Da⁹. El Q-TOF-MS es el método más utilizado en el análisis cualitativo de la farmacoquímica sérica^10,11. En comparación con la base de datos de red tradicional o la base de datos comercial, el análisis conjunto con una base de datos autoestablecida para el procesamiento de datos se ha vuelto cada vez más popular.

La hierba de milenrama alpina, Achillea millefolium L. (AML), un tipo de medicina herbal china, crece principalmente en Xinjiang, Mongolia Interior y las áreas del noreste de China¹². La parte aérea de la LMA se usa ampliamente para tratar la inflamación, los trastornos gastrointestinales y el dolor, incluida la reumatalgia, el dolor de muelas y el dolor de estómago¹³. Los 3-oxa-guaianitos de la LMA ofrecen un gran potencial como líderes para el desarrollo de fármacos antiinflamatorios¹⁴. Los estudios actuales sobre los componentes químicos de la LMA se centran en los sesquiterpenos, monoterpenos, flavonoides y compuestos fenólicos¹⁵. Sin embargo, para la identificación de compuestos en la LMA, no se dispone de un esquema de inducción cualitativa sistemática que pueda utilizarse para otras hierbas medicinales chinas. Este estudio tiene como objetivo proporcionar una identificación estandarizada de los componentes químicos en la medicina herbal china mediante la combinación de Q-TOF-MS y el análisis de bases de datos autoestablecidas.

Protocolo

1. Pretratamiento de la muestra

1. Colección de hierbas medicinales chinas AML
   1. Plante semillas de milenrama alpina Hierba, Achillea millefolium L. (AML) en el suelo en febrero. Recoja la parte aérea de la LMA en julio del mismo año (Figura 1A).
      NOTA: La LMA utilizada en este trabajo se colectó en una zona montañosa a una altitud de 400 m en Mianyang, Sichuan, China.
2. Tratamiento de secado
   1. Lave toda la AML recolectada en agua pura para eliminar los sedimentos y las impurezas. Secar la AML en un horno a 50 °C durante 24 h (Figura 1B).
3. Preparación del polvo
   1. Después del secado, triture AML hasta convertirlo en polvo grueso con una trituradora multifuncional de alta velocidad. Pase el polvo a través de un tamiz de malla 50 (Figura 1C).
4. Extracción con disolventes
   1. Coloque 1 g de muestra de LMA pesada con precisión en un matraz cónico con 30 mL de una solución de etanol y agua al 75% (Figura 2A).
   2. Extraiga la mezcla en un sonicador de baño de ultrasonidos durante 30 min a 25 °C (figura 2B).
   3. Centrifugar la muestra a 14.000 × g durante 5 min (Figura 2C).
   4. Coloque una jeringa inyectable con un filtro de membrana microporosa (0,22 μm, solo orgánico) y filtre el sobrenadante en un frasco de muestra de 2 ml (Figura 2D).

2. Sintonía MS

1. Inicie el software de control LC-MS (Figura 3A). Abra el módulo MS tune y purgue la solución de leucina encefalina (LE) de 1 ng/μL dos veces.
2. En el panel de control de flujo LockSpray , establezca un caudal de 50 μL/min y haga clic en el botón Flujo para permitir que la solución de LE ingrese al espectrómetro de masas (Figura 3B).
3. Haga clic en el botón LockSpray Source Setup para completar la sintonía de MS en modo positivo (Figura 3C). Haga clic en el icono negativo para cambiar el modo de iones. Haga clic en el botón LockSpray Source Setup para completar la sintonía MS en modo negativo.

3. Adquisición de MS

1. Establezca una tabla de secuencias, que incluya el nombre del archivo, el método MS, el archivo de entrada, el vial y el volumen. Haga clic en el botón Guardar para registrar la tabla de secuencias.
2. Haga clic en el botón Ejecutar y en el botón Iniciar en secuencia (Figura 3D). Seleccione la opción Adquirir solo datos de muestra . Haga clic en el botón Aceptar para iniciar la adquisición de datos.
3. Haga clic en el botón Cromatograma para abrir la ventana de cromatograma de iones totales (TIC) en tiempo real (Figura 3E). Haga clic en el botón Pantalla y en el botón TIC en secuencia. Seleccione la opción Cromatograma BPI , luego haga clic en el botón OK para mostrar la ventana del cromatograma de pico base (BPI) (Figura 3F).

4. Tratamiento de datos

1. Inicie el software de análisis de datos.
2. Haga clic en el botón Mi trabajo y en el botón Importar datos de MassLynx a su vez para ingresar a la ventana secundaria (Figura 4A). Seleccione los archivos de datos sin procesar e ingrese el nombre del conjunto de muestras, luego haga clic en el botón Crear conjunto de muestras UNIFI para importar los datos sin procesar de los espectros MS.
   NOTA: Asegúrese de que los datos brutos positivos y negativos se importen por separado.
3. Establecimiento de la base de datos
   1. Haga clic en el botón Administración en la ventana inicial (Figura 4B). Haga clic en el botón Importar elementos de la biblioteca. Seleccione el archivo de plantilla de base de datos en formato .xlsx con todas las estructuras compuestas separadas en formato .mol en la misma carpeta.
   2. Escriba un nombre para la base de datos. Haga clic en el botón Verificar para asegurarse de que se muestren todos los compuestos. Haga clic en el botón Importar para finalizar la construcción de una base de datos autoestablecida.
      NOTA: Todos los compuestos en archivos independientes en formato .mol que deben importarse a la base de datos se preparan en base a las referencias bibliográficas. Los archivos de estructuras compuestas son dibujados por uno mismo utilizando software de dibujo.
4. Haga clic en el botón Crear método de análisis para abrir una ventana secundaria. Haga clic en el botón Generar un método de solo proceso para establecer un método de procesamiento de datos.
5. Análisis de datos
   1. Haga clic en el botón Crear análisis para abrir una ventana secundaria.
   2. Haga clic en el botón Crear análisis a partir de datos existentes , luego seleccione los datos importados y el método establecido.
   3. Haga clic en el botón Procesar para iniciar un cálculo de datos largo (Figura 4D).
   4. Haga clic en el botón Investigar para cambiar a la ventana TIC.
   5. Haga clic en el botón Seleccionar trazas y seleccione el TOF MS^E BBI. Haga clic en el botón Reemplazar todo para ver el BPI.
6. Haga clic con el botón derecho y seleccione la opción Agregar columna | mostrar información del compuesto, incluido el nombre del compuesto, la masa natural, m/z observado, el error de masa, el tiempo de retención (RT) observado, los recuentos de detectores, la respuesta, los aductos, las asignaciones alternativas y el número total de fragmentos encontrados (Figura 4E).
7. Seleccione la opción Fragmentos de alta energía para mostrar los fragmentos de espectro de masa secundarios del compuesto seleccionado (Figura 4F).
8. Dibuje manualmente las trayectorias de escisión molecular de acuerdo con cada fragmento secundario (Figura 4G).
   NOTA: Los ejemplos se describen en detalle en la sección de resultados representativos.

Resultados

Se utilizó la hierba de milenrama alpina como modelo para mostrar el resultado representativo. Como se muestra en la Figura 4G, la quercetina-3'-O-glucósido con m/z = 463.08935 se transformó en un intermediario con m/z = 300.02828 a través de la pérdida de una molécula de hexosa durante la reacción de hidrólisis. En otra vía, la ruptura del enlace C-C en el esqueleto de la estructura flavonoide condujo a la formación de un intermediario con m/z = 2...

Discusión

La espectrometría de masas de alta resolución combinada con una base de datos autoestablecida ofrece una tecnología cualitativa sistemática para identificar componentes químicos en la medicina herbal china. A diferencia de una base de datos comercial, que contiene medicina tradicional china común, una base de datos autoestablecida que utiliza compuestos reportados en la literatura proporciona más precisión en el análisis de la medicina rara o étnica¹⁶. S...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
Methanol	ChuandongChemical	CAS 67-56-1
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software