초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법 및 한약 성분에 대한 자체 데이터베이스 분석

요약

우리는 한약재인 고산 톱풀 허브인 Achillea millefolium L. 의 복잡한 성분을 분리하고 인식하는 데 적용할 수 있는 일반적인 프로토콜과 체계적인 설계를 설명합니다.

초록

한약은 복잡하고 알려지지 않은 화합물이 많기 때문에 질적 연구가 중요합니다. 초고성능 액체 크로마토그래피 사중극자 비행 시간 질량 분석법(UPLC-Q-TOF-MS)은 화합물의 정성 분석에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법에는 시료 전처리, MS 조정, MS 수집 및 데이터 처리를 위한 표준화되고 프로그래밍된 프로토콜이 포함됩니다. 시료 전처리에는 채취, 분쇄, 용매 추출, 초음파, 원심분리 및 여과가 포함됩니다. 데이터 사후 처리에 대해 자세히 설명했으며 데이터 가져오기, 자체 설정된 데이터베이스 구성, 방법 설정, 데이터 처리 및 기타 수동 작업이 포함됩니다. 알파인 톱풀 허브의 지상 부분인 Achillea millefolium L. 은 염증, 위장 장애 및 통증을 치료하는 데 사용되며 3-oxa-guaianolides는 항염증제 개발에 유용한 단서가 될 수 있습니다. TOF-MS와 자체 구축된 데이터베이스를 결합하여 AML에서 세 가지 대표적인 화합물을 확인했습니다. 또한 기존 문헌과의 차이점, 액상 파라미터 최적화, 스캔 모드 선택, 이온 소스 적합성, 충돌 에너지 조정, 이성질체 스크리닝, 방법 제한 및 가능한 솔루션에 대해 논의했습니다. 이 표준화된 분석 방법은 보편적이며 한약에서 복잡한 화합물을 식별하는 데 적용할 수 있습니다.

서문

한의학은 세계에서 가장 풍부한 실증적 지식을 축적해 왔다¹. 중국 전통 약초의 화학 성분에 대한 정성적 분석은 연구에서 중요한 주제가 되었다². 한약재에서 화학적 차이를 구별하는 것은 범주의 복잡성과 원산지의 다양성 때문에 어렵다³. 한약의 주요 화합물 유형으로는 알칼로이드, 사포닌, 플라보노이드, 안트라퀴논, 테르페노이드, 쿠마린, 리그난, 다당류, 폴리펩티드, 단백질^{등이 있다 1}. 그러나 화합물의 분리와 이성질체의 확인은 한약에 대한 질적 연구의 발전을 방해합니다.

초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)와 적절한 크로마토그래피 컬럼의 조합은 한약에서 복잡한 화합물의 분리를 강력하게 지원합니다⁴. 최근 몇 년 동안 고해상도 질량 분석법은 한약 정성 분석에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 일반적으로 사용되는 고분해능 질량 분석법에는 사중극자 비행 시간 질량 분석법(Q-TOF-MS)⁵, 오비트랩 질량 분석법(Orbitrap-MS)⁶ 및 푸리에 변환 이온 사이클로트론 질량 분석법(FT-ICR-MS)⁷이 있습니다. FT-ICR-MS는 해상도가 가장 높지만 운영 및 유지 보수 비용이 많이 듭니다⁸. Orbitrap-MS는 특히 500Da⁹ 미만의 분자량에서 저분자 화합물을 검출하는 데 이점이 있습니다. Q-TOF-MS는 혈청 약리화학^10,11의 정성 분석에서 가장 널리 사용되는 방법입니다. 기존의 네트워크 데이터베이스 또는 상용 데이터베이스와 비교하여 데이터 처리를 위해 자체 구축된 데이터베이스와의 공동 분석이 점점 더 대중화되고 있습니다.

한약의 일종인 고산 톱풀 허브인 Achillea millefolium L. (AML)은 주로 신장, 내몽골 및 중국 동북 지역에서 자랍니다¹². AML의 지상 부분은 류마티스통, 치통, 복통을 포함한 염증, 위장 장애 및 통증을 치료하는 데 널리 사용됩니다¹³. AML의 3-옥사-구아이아놀라이드는 항염증제 개발을 위한 선도 물질로서 큰 잠재력을 제공합니다¹⁴. AML의 화학 성분에 대한 현재 연구는 세스키테르펜, 모노테르펜, 플라보노이드 및 페놀 화합물에 초점을 맞추고 있습니다¹⁵. 그러나 AML의 화합물 식별을 위해 다른 한약재에 사용할 수 있는 체계적인 정성적 유도 체계는 없습니다. 본 연구는 Q-TOF-MS와 자체 구축한 데이터베이스 분석을 결합하여 한약의 화학 성분을 표준화된 규범 규명을 제공하는 것을 목표로 한다.

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프로토콜

1. 샘플 전처리

1. 한약재 AML 컬렉션
   1. 고산 톱풀 허브, Achillea millefolium L. (AML) 씨앗을 2 월에 땅에 심습니다. 같은 해 7월에 AML의 지상 부분을 수집합니다(그림 1A).
      참고: 이 백서에 사용된 AML은 중국 쓰촨성 몐양시 고도 400m의 산악 지역에서 수집되었습니다.
2. 건조 처리
   1. 수집된 모든 AML을 순수한 물로 세척하여 침전물과 불순물을 제거합니다. AML을 50°C의 오븐에서 24시간 동안 건조합니다(그림 1B).
3. 분말 준비
   1. 건조 후 고속 다기능 분쇄기를 사용하여 AML을 거친 분말로 분쇄합니다. 분말을 50메쉬 체에 통과시킵니다(그림 1C).
4. 용매 추출
   1. 정확하게 계량된 AML 샘플 1g을 원뿔형 플라스크에 넣고 30mL의 75% 에탄올-물 용액을 넣습니다(그림 2A).
   2. 25°C에서 30분 동안 초음파 수조 초음파 처리기에서 혼합물을 추출합니다(그림 2B).
   3. 14,000 × g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다(그림 2C).
   4. 주사기에 미세다공성 멤브레인 필터(0.22μm, 유기물만 해당)를 장착하고 상층액을 2mL 샘플 병에 여과합니다(그림 2D).

2. MS 튠

1. LC-MS 제어 소프트웨어를 실행합니다(그림 3A). MS tune 모듈을 열고 1ng/μL 류신 뇌(LE) 용액을 두 번 퍼지합니다.
2. LockSpray Flow Control 패널에서 50μL/min 유속을 설정하고 Flow 버튼을 클릭하여 LE 용액이 질량분석기에 들어가도록 합니다(그림 3B).
3. LockSpray Source Setup 버튼을 클릭하여 포지티브 모드에서 MS Tune을 완료합니다(그림 3C). 음수 아이콘을 클릭하여 이온 모드를 전환합니다. LockSpray Source Setup 버튼을 클릭하여 네거티브 모드에서 MS Tune을 완료합니다.

3. MS 인수

1. 파일 이름, MS Method, Inlet 파일, 바이알 및 부피를 포함한 시퀀스 테이블을 설정합니다. 저장 버튼을 클릭하여 시퀀스 테이블을 기록합니다.
2. Run(실행) 버튼과 Start(시작) 버튼을 차례로 클릭합니다(그림 3D). 샘플 데이터만 가져오기 옵션을 선택합니다. 확인 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다.
3. Chromatogram 버튼을 클릭하여 실시간 총 이온 크로마토그램(TIC) 창을 엽니다(그림 3E). 디스플레이 버튼과 TIC 버튼을 차례로 클릭합니다. BPI Chromatogram 옵션을 선택한 다음 OK 버튼을 클릭하여 기본 피크 크로마토그램(BPI) 창을 표시합니다(그림 3F).

4. 데이터 처리

1. 데이터 분석 소프트웨어를 실행합니다.
2. My Work 버튼과 Import MassLynx Data 버튼을 차례로 클릭하여 하위 창으로 들어갑니다(그림 4A). 원시 데이터 파일을 선택하고 Sample Set 이름을 입력한 다음 Create UNIFI Sample Set 버튼을 클릭하여 MS 스펙트럼의 원시 데이터를 가져옵니다.
   참고: 양수 및 음수 원시 데이터를 별도로 가져와야 합니다.
3. 데이터베이스 구축
   1. 초기 창에서 Administration(관리 ) 버튼을 클릭합니다(그림 4B). Import library items 버튼을 클릭합니다. 동일한 폴더에서 .mol 형식의 모든 분리된 화합물 구조가 포함된 .xlsx 형식의 데이터베이스 템플릿 파일을 선택합니다.
   2. 데이터베이스의 이름을 입력합니다. 확인 버튼을 클릭하여 모든 화합물이 표시되는지 확인합니다. Import 버튼을 클릭하여 자체 설정된 데이터베이스 구축을 완료합니다.
      참고: 데이터베이스로 가져와야 하는 독립적인 .mol 형식 파일의 모든 화합물은 문헌 참조를 기반으로 준비됩니다. 복합 구조 파일은 드로잉 소프트웨어를 사용하여 직접 그립니다.
4. Create analysis method 버튼을 클릭하여 자식 창을 엽니다. Generate a process only method 버튼을 클릭하여 데이터 처리 방법을 설정합니다.
5. 데이터 분석
   1. 분석 만들기 버튼을 클릭하여 자식 창을 엽니다.
   2. Create analysis from existing data 버튼을 클릭한 다음 가져온 데이터와 설정된 방법을 선택합니다.
   3. Process 버튼을 클릭하여 긴 데이터 계산을 시작합니다(그림 4D).
   4. Investigate(조사) 버튼을 클릭하여 TIC 창으로 전환합니다.
   5. 추적 선택 버튼을 클릭하고 TOF MS^E BPI를 선택합니다. 모두 바꾸기 버튼을 클릭하여 BPI를 봅니다.
6. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Add column(열 추가) 옵션을 선택합니다 | 화합물 이름, 자연 질량, 관찰된 m/z, 질량 오류, 관찰된 머무름 시간(RT), 검출기 수, 반응, 부가물, 대체 할당 및 발견된 총 단편 수를 포함한 화합물 정보를 표시합니다(그림 4E).
7. High-energy fragments 옵션을 선택하여 선택한 화합물의 2차 질량 스펙트럼 단편을 표시합니다(그림 4F).
8. 각 2차 단편에 따라 분자 분할 경로를 수동으로 그립니다(그림 4G).
   참고: 예는 대표 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.

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결과

알파인 톱풀 허브를 모델로 사용하여 대표적인 결과를 표시했습니다. 그림 4G에서 볼 수 있듯이, m/z = 463.08935인 케르세틴-3'-O-글루코시드는 가수분해 반응 중 헥소스 분자의 소실을 통해 m/z = 300.02828의 중간체로 변형되었습니다. 또 다른 경로에서, 플라보노이드 구조 골격에서 C-C 결합의 단절은 m/z = 223.06232를 갖는 중간체의 형성으로 이어졌고, 여기?...

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토론

자체 구축된 데이터베이스와 결합된 고분해능 질량 분석법은 한약의 화학 성분을 식별할 수 있는 체계적인 정성적 기술을 제공합니다. 일반적인 전통 한의학을 포함하는 상용 데이터베이스와 달리, 문헌에 보고된 화합물을 사용하는 자체 구축된 데이터베이스는 희귀 또는 민족 의학을 분석하는 데 더 정확한 정보를 제공한다¹⁶. 완제품¹⁷

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
Methanol	ChuandongChemical	CAS 67-56-1
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software