Chromatographie liquide à ultra haute performance-spectrométrie de masse et analyse de bases de données auto-établies de composants de phytothérapie chinoise

Résumé

Nous décrivons un protocole général et une conception systématique qui pourraient être appliqués pour séparer et reconnaître les composants complexes de l’achillée millefeuille alpine, Achillea millefolium L., une plante médicinale chinoise.

Résumé

La phytothérapie chinoise est complexe et comporte de nombreux composés inconnus, ce qui rend la recherche qualitative cruciale. La chromatographie liquide à ultra-haute performance et la spectrométrie de masse quadripolaire à temps de vol (UPLC-Q-TOF-MS) est la méthode la plus utilisée dans l’analyse qualitative des composés. La méthode comprend des protocoles standardisés et programmés pour le prétraitement des échantillons, la mise au point de la MS, l’acquisition de la MS et le traitement des données. Les prétraitements d’échantillons comprennent la collecte, la pulvérisation, l’extraction par solvant, les ultrasons, la centrifugation et la filtration. Le post-traitement des données a été décrit en détail et comprend l’importation de données, la construction de bases de données auto-établies, l’établissement de méthodes, le traitement des données et d’autres opérations manuelles. La partie aérienne de l’achillée millefeuille alpine, Achillea millefolium L., est utilisée pour traiter l’inflammation, les troubles gastro-intestinaux et la douleur et ses 3-oxa-guaianolides pourraient être des pistes utiles pour le développement de médicaments anti-inflammatoires. Trois composés représentatifs de la LMA ont été identifiés, en combinant la TOF-MS avec une base de données auto-établie. De plus, les différences par rapport à la littérature existante, l’optimisation des paramètres en phase liquide, la sélection du mode de balayage, l’adéquation des sources d’ions, l’ajustement de l’énergie de collision, le criblage des isomères, la limitation des méthodes et les solutions possibles ont été discutées. Cette méthode d’analyse standardisée est universelle et peut être appliquée pour identifier des composés complexes en phytothérapie chinoise.

Introduction

La médecine chinoise a accumulé les connaissances empiriques les plus riches au monde¹. L’analyse qualitative des composants chimiques de la phytothérapie traditionnelle chinoise est devenue un sujet crucial dans la recherche². Il est difficile de distinguer les différences chimiques en phytothérapie chinoise en raison de la complexité des catégories et de la diversification des origines³. Les principaux types de composés en phytothérapie chinoise comprennent les alcaloïdes, les saponines, les flavonoïdes, les anthraquinones, les terpénoïdes, les coumarines, les lignanes, les polysaccharides, les polypeptides et les protéines¹. Cependant, la séparation des composés et l’identification des isomères entravent le développement de la recherche qualitative sur la phytothérapie chinoise.

La combinaison de la chromatographie liquide à ultra-haute performance (UPLC) et de colonnes de chromatographie appropriées fournit un support solide pour la séparation de composés complexes en phytothérapie chinoise⁴. Ces dernières années, la spectrométrie de masse à haute résolution est devenue de plus en plus populaire dans l’analyse qualitative de la phytothérapie chinoise. Les méthodes de spectrométrie de masse à haute résolution couramment utilisées comprennent la spectrométrie de masse quadripolaire à temps de vol (Q-TOF-MS⁾⁵, la spectrométrie de masse orbitrap (Orbitrap-MS)⁶ et la spectrométrie de masse cyclotron ionique à transformée de Fourier (FT-ICR-MS⁾⁷. FT-ICR-MS a la résolution la plus élevée, mais entraîne des coûts d’exploitation et de maintenance coûteux⁸. Orbitrap-MS présente des avantages dans la détection de petits composés moléculaires, en particulier à des poids moléculaires inférieurs à 500 Da⁹. Q-TOF-MS est la méthode la plus largement utilisée dans l’analyse qualitative de la pharmacochimie sérique^10,11. Par rapport à la base de données réseau traditionnelle ou à la base de données commerciale, l’analyse conjointe avec une base de données auto-établie pour le traitement des données est devenue de plus en plus populaire.

L’achillée millefeuille des Alpes, Achillea millefolium L. (AML), une sorte de phytothérapie chinoise, pousse principalement dans le Xinjiang, la Mongolie intérieure et les régions du nord-est de la Chine¹². La partie aérienne de la LMA est largement utilisée pour traiter l’inflammation, les troubles gastro-intestinaux et la douleur, y compris les rhumatalgies, les maux de dents et les maux d’estomac¹³. Les 3-oxa-guaianolides issus de la LMA offrent un grand potentiel en tant que pistes pour le développement de médicaments anti-inflammatoires¹⁴. Les études actuelles sur les composants chimiques de la LMA se concentrent sur les sesquiterpènes, les monoterpènes, les flavonoïdes et les composés phénoliques¹⁵. Cependant, pour l’identification des composés dans la LAM, il n’existe pas de schéma d’induction qualitatif systématique qui pourrait être utilisé pour d’autres plantes médicinales chinoises. Cette étude vise à fournir une identification standardisée des composants chimiques en phytothérapie chinoise en combinant Q-TOF-MS et l’analyse de bases de données auto-établies.

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Protocole

1. Prétraitement de l’échantillon

1. Collection de phytothérapie chinoise LMA
   1. Plantez des graines d’achillée millefeuille d’achillée millefeuille, Achillea millefolium L. (AML) dans le sol en février. Collecte de la partie aérienne de la LRA en juillet de la même année (figure 1A).
      REMARQUE : La LMA utilisée dans cet article a été prélevée dans une zone montagneuse à une altitude de 400 m à Mianyang, Sichuan, Chine.
2. Traitement de séchage
   1. Lavez toute la LMA recueillie dans de l’eau pure pour éliminer les sédiments et les impuretés. Faites sécher la LMA dans un four à 50 °C pendant 24 h (Figure 1B).
3. Préparation de la poudre
   1. Après séchage, écrasez la LMA en une poudre grossière à l’aide d’un broyeur multifonctionnel à grande vitesse. Passez la poudre dans un tamis de 50 mailles (Figure 1C).
4. Extraction par solvant
   1. Placer 1 g d’échantillon de LAM pesé avec précision dans une fiole conique avec 30 mL d’une solution d’éthanol-eau à 75 % (figure 2A).
   2. Extrayez le mélange dans un sonicateur à bain d’ultrasons pendant 30 min à 25 °C (Figure 2B).
   3. Centrifuger l’échantillon à 14 000 × g pendant 5 min (Figure 2C).
   4. Ajuster une seringue d’injection d’un filtre à membrane microporeuse (0,22 μm, organique seulement) et filtrer le surnageant dans un flacon d’échantillon de 2 mL (figure 2D).

2. Réglage MS

1. Lancez le logiciel de contrôle LC-MS (Figure 3A). Ouvrez le module MS tune et purgez deux fois la solution de leucine encéphaline (LE) de 1 ng/μL.
2. Dans le panneau de contrôle de débit LockSpray , réglez un débit de 50 μL/min et cliquez sur le bouton Débit pour laisser la solution LE entrer dans le spectromètre de masse (Figure 3B).
3. Cliquez sur le bouton LockSpray Source Setup (Configuration de la source LockSpray) pour terminer le réglage MS en mode positif (Figure 3C). Cliquez sur l’icône négative pour changer le mode ionique. Cliquez sur le bouton LockSpray Source Setup pour terminer le réglage MS en mode négatif.

3. Acquisition de MS

1. Définissez une table de séquences, y compris le nom de fichier, la méthode MS, le fichier d’entrée, le flacon et le volume. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer la table de séquence.
2. Cliquez successivement sur les boutons Exécuter et Démarrer (Figure 3D). Sélectionnez l’option Acquérir uniquement des données d’échantillonnage . Cliquez sur le bouton OK pour lancer l’acquisition des données.
3. Cliquez sur le bouton Chromatogramme pour ouvrir la fenêtre du chromatogramme d’ions totaux (TIC) en temps réel (Figure 3E). Cliquez sur le bouton Affichage et le bouton TIC dans l’ordre. Sélectionnez l’option Chromatogramme BPI , puis cliquez sur le bouton OK pour afficher la fenêtre du chromatogramme à pic de base (BPI) (Figure 3F).

4. Traitement des données

1. Lancez le logiciel d’analyse de données.
2. Cliquez successivement sur le bouton Mon travail et sur le bouton Importer des données MassLynx pour accéder à la fenêtre enfant (Figure 4A). Sélectionnez les fichiers de données brutes et entrez le nom du jeu d’échantillons, puis cliquez sur le bouton Créer un jeu d’échantillons UNIFI pour importer les données brutes des spectres MS.
   REMARQUE : Assurez-vous que les données brutes positives et négatives sont importées séparément.
3. Création d’une base de données
   1. Cliquez sur le bouton Administration dans la fenêtre initiale (Figure 4B). Cliquez sur le bouton Importer des éléments de bibliothèque . Sélectionnez le fichier de modèle de base de données au format .xlsx avec toutes les structures composées séparées au format .mol dans le même dossier.
   2. Entrez un nom pour la base de données. Cliquez sur le bouton Vérifier pour vous assurer que tous les composés sont affichés. Cliquez sur le bouton Importer pour terminer la construction d’une base de données auto-établie.
      REMARQUE : Tous les composés dans des fichiers indépendants au format .mol qui doivent être importés dans la base de données sont préparés sur la base des références bibliographiques. Les fichiers de structure composés sont dessinés par soi-même à l’aide d’un logiciel de dessin.
4. Cliquez sur le bouton Créer une méthode d’analyse pour ouvrir une fenêtre enfant. Cliquez sur le bouton Générer une méthode de traitement uniquement pour établir une méthode de traitement des données.
5. Analyse des données
   1. Cliquez sur le bouton Créer une analyse pour ouvrir une fenêtre enfant.
   2. Cliquez sur le bouton Créer une analyse à partir de données existantes , puis sélectionnez les données importées et la méthode établie.
   3. Cliquez sur le bouton Traiter pour lancer un calcul de données longues (Figure 4D).
   4. Cliquez sur le bouton Examiner pour passer à la fenêtre TIC.
   5. Cliquez sur le bouton Sélectionner des traces et sélectionnez le TOF MS^E BPI. Cliquez sur le bouton Remplacer tout pour afficher le BPI.
6. Cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez l’option Ajouter une colonne | afficher les informations sur le composé, y compris le nom du composé, la masse naturelle, le m/z observé, l’erreur de masse, le temps de rétention observé (RT), le nombre de détecteurs, la réponse, les adduits, les autres affectations et le nombre total de fragments trouvés (Figure 4E).
7. Sélectionnez l’option Fragments de haute énergie pour afficher les fragments de spectre de masse secondaire du composé sélectionné (Figure 4F).
8. Dessinez manuellement les chemins de clivage moléculaire en fonction de chaque fragment secondaire (Figure 4G).
   REMARQUE : Des exemples sont décrits en détail dans la section des résultats représentatifs.

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Résultats

L’achillée millefeuille des Alpes a été utilisée comme modèle pour afficher le résultat représentatif. Comme le montre la figure 4G, la quercétine-3'-O-glucoside avec m/z = 463,08935 s’est transformée en un intermédiaire avec m/z = 300,02828 par la perte d’une molécule d’hexose pendant la réaction d’hydrolyse. Dans une autre voie, la rupture de la liaison C-C dans le squelette de la structure flavonoïde a conduit à la formation d’un...

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Discussion

La spectrométrie de masse à haute résolution combinée à une base de données auto-établie offre une technologie qualitative systématique pour identifier les composants chimiques en phytothérapie chinoise. Contrairement à une base de données commerciale, qui contient la médecine traditionnelle chinoise courante, une base de données auto-établie qui utilise des composés rapportés dans la littérature offre plus de précision dans l’analyse de la médecine rare ou ethnique<...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
Methanol	ChuandongChemical	CAS 67-56-1
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software