JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем общий протокол и систематический дизайн, которые могут быть применены для разделения и распознавания сложных компонентов в траве альпийского тысячелистника, Achillea millefolium L., китайском травяном препарате.

Аннотация

Китайская фитотерапия сложна и содержит множество неизвестных соединений, что делает качественные исследования критически важными. Квадрупольная времяпролетная масс-спектрометрия со сверхвысокими эксплуатационными характеристиками жидкостной хроматографии (UPLC-Q-TOF-MS) является наиболее широко используемым методом качественного анализа соединений. Метод включает в себя стандартизированные и запрограммированные протоколы предварительной обработки образцов, настройки МС, сбора МС и обработки данных. Предварительная обработка образцов включает в себя сбор, измельчение, экстракцию растворителем, ультразвук, центрифугирование и фильтрацию. Постобработка данных была подробно описана и включает в себя импорт данных, самостоятельное построение базы данных, установление метода, обработку данных и другие ручные операции. Надземная часть травы альпийского тысячелистника, Achillea millefolium L., используется для лечения воспаления, желудочно-кишечных расстройств и боли, а содержащиеся в ней 3-окса-гуянолиды могут быть полезными для разработки противовоспалительных препаратов. Были идентифицированы три типичных соединения при ОМЛ, сочетающие TOF-MS с самосозданной базой данных. Кроме того, обсуждались отличия от существующей литературы, оптимизация параметров жидкой фазы, выбор режима сканирования, пригодность ионного источника, регулировка энергии столкновений, скрининг изомеров, ограничение метода и возможные решения. Этот стандартизированный метод анализа является универсальным и может быть применен для идентификации сложных соединений в китайской фитотерапии.

Введение

Китайская медицина накопила богатейшие эмпирические знания в мире1. Качественный анализ химических компонентов в традиционной китайской фитотерапии стал ключевой темой в исследованиях2. Различить химические различия в китайской фитотерапии сложно из-за сложности категорий и диверсификации происхождения3. К основным типам соединений в китайской фитотерапии относятся алкалоиды, сапонины, флавоноиды, антрахиноны, терпеноиды, кумарины, лигнаны, полисахариды, полипептиды и белки. Тем не менее, разделение соединений и идентификация изомеров препятствуют развитию качественных исследований в области китайской фитотерапии.

Комбинация сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ВПЖ) с подходящими хроматографическими колонками обеспечивает надежную поддержку разделения сложных соединений в китайской фитотерапии4. В последние годы масс-спектрометрия высокого разрешения становится все более популярной в китайском фитотерапевтическом качественном анализе. Обычно используемые методы масс-спектрометрии с высоким разрешением включают квадрупольную времяпролетную масс-спектрометрию (Q-TOF-MS)5, масс-спектрометрию Orbitrap (Orbitrap-MS)6 и ионно-циклотронную масс-спектрометрию с преобразованием Фурье (FT-ICR-MS)7. FT-ICR-MS имеет самое высокое разрешение, но влечет за собой дорогостоящие расходы на эксплуатацию и техническое обслуживание8. Orbitrap-MS имеет преимущества в обнаружении малых молекулярных соединений, особенно при молекулярной массе ниже 500Да9. Q-TOF-MS является наиболее широко используемым методом в качественном анализе фармакохимии сыворотки крови 10,11. По сравнению с традиционной сетевой базой данных или коммерческой базой данных, совместный анализ с самостоятельно созданной базой данных для обработки данных становится все более популярным.

Трава тысячелистника альпийского, Achillea millefolium L. (AML), разновидность китайской травяной медицины, произрастает в основном в Синьцзяне, Внутренней Монголии и северо-восточных районах Китая12. Надземная часть ОМЛ широко используется для лечения воспаления, желудочно-кишечных расстройств и боли, включая ревматалгию, зубную боль и боль в животе13. 3-окса-гуаянолиды из ОМЛ обладают большим потенциалом в качестве ведущих источников для разработки противовоспалительных препаратов14. Современные исследования химических компонентов при ОМЛ сосредоточены на сесквитерпенах, монотерпенах, флавоноидах и фенольных соединениях15. Тем не менее, для идентификации соединений при ОМЛ не существует систематической качественной схемы индукции, которая могла бы быть использована для других китайских растительных препаратов. Данное исследование направлено на обеспечение стандартизированной идентификации химических компонентов в китайской фитотерапии путем сочетания Q-TOF-MS и самостоятельного анализа базы данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Предварительная обработка образца

  1. Сборник китайской фитотерапии ОМЛ
    1. Посадите семена альпийского тысячелистника Herb, Achillea millefolium L. (AML) в грунт в феврале. Соберите надземную часть AML в июле того же года (рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ОМЛ, используемый в этой статье, был собран в горной местности на высоте 400 м в Мяньяне, провинция Сычуань, Китай.
  2. Процедура сушки
    1. Промойте весь собранный ОМЛ в чистой воде, чтобы удалить осадок и загрязнения. Высушите AML в духовке при температуре 50 °C в течение 24 часов (рис. 1B).
  3. Приготовление порошка
    1. После сушки измельчите AML в крупный порошок с помощью высокоскоростной многофункциональной дробилки. Пропустите порошок через сито с плотностью 50 меш (рисунок 1C).
  4. Экстракция растворителем
    1. Поместите 1 г точно взвешенного образца ОМЛ в коническую колбу с 30 мл 75% раствора этанола и воды (рис. 2А).
    2. Экстрагируйте смесь в ультразвуковом аппарате для ванны в течение 30 минут при температуре 25 °C (рис. 2B).
    3. Центрифугируйте образец при давлении 14 000 × г в течение 5 минут (рисунок 2C).
    4. Установите инъекционный шприц с микропористым мембранным фильтром (0,22 мкм, только органический) и отфильтруйте надосадочную жидкость во флакон для образца объемом 2 мл (рис. 2D).

2. Настройка MS

  1. Запустите управляющее программное обеспечение LC-MS (рис. 3A). Откройте модуль настройки MS и дважды продуйте раствор лейцинового энцефалина (LE) с концентрацией 1 нг/μл.
  2. На панели управления потоком LockSpray установите расход 50 μл/мин и нажмите кнопку Flow, чтобы раствор LE вошел в масс-спектрометр (рис. 3B).
  3. Нажмите кнопку LockSpray Source Setup, чтобы завершить настройку MS в положительном режиме (рисунок 3C). Нажмите на отрицательный значок , чтобы переключить ионный режим. Нажмите кнопку LockSpray Source Setup, чтобы завершить настройку MS в негативном режиме.

3. Получение MS

  1. Установите таблицу последовательностей, включая имя файла, метод MS, входной файл, флакон и объем. Нажмите на кнопку «Сохранить », чтобы записать таблицу последовательностей.
  2. Нажмите последовательно на кнопки «Выполнить» и «Старт » (Рисунок 3D). Выберите параметр Получать только образцы данных . Нажмите на кнопку OK , чтобы начать сбор данных.
  3. Нажмите кнопку «Хроматограмма», чтобы открыть окно общей ионной хроматограммы (TIC) в режиме реального времени (Рисунок 3E). Нажмите на кнопку Display (Дисплей) и кнопку TIC (Дисплей) и кнопку TIC (Tic) по очереди. Выберите опцию «Хроматограмма BPI», затем нажмите кнопку «ОК», чтобы отобразить окно базовой пиковой хроматограммы (BPI) (рисунок 3F).

4. Обработка данных

  1. Запустите программное обеспечение для анализа данных.
  2. Нажмите кнопку « Моя работа» и кнопку «Импортировать данные MassLynx » по очереди, чтобы войти в дочернее окно (рисунок 4A). Выберите файлы исходных данных и введите имя набора образцов, затем нажмите кнопку «Создать набор образцов UNIFI », чтобы импортировать необработанные данные спектров MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что положительные и отрицательные исходные данные импортируются отдельно.
  3. Создание базы данных
    1. Нажмите на кнопку "Администрирование " в первом окне (рисунок 4B). Нажмите на кнопку Импортировать элементы библиотеки . Выберите файл шаблона базы данных в формате .xlsx со всеми разделенными составными структурами в формате .mol в одной папке.
    2. Введите имя базы данных. Нажмите на кнопку «Подтвердить », чтобы убедиться, что отображаются все соединения. Нажмите кнопку «Импорт », чтобы завершить сборку самостоятельно созданной базы данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все соединения в независимых файлах формата .mol, которые должны быть импортированы в базу данных, подготовлены на основе ссылок на литературу. Файлы составной структуры рисуются самостоятельно с помощью программы для рисования.
  4. Нажмите на кнопку Создать метод анализа , чтобы открыть дочернее окно. Нажмите кнопку Generate a process only method (Создать метод только обработки ), чтобы установить метод обработки данных.
  5. Анализ данных
    1. Нажмите на кнопку Создать анализ , чтобы открыть дочернее окно.
    2. Нажмите на кнопку Создать анализ из существующих данных , затем выберите импортируемые данные и установленный метод.
    3. Нажмите на кнопку Process , чтобы начать вычисление длинных данных (Рисунок 4D).
    4. Нажмите на кнопку «Исследовать », чтобы переключиться в окно ТИЦ.
    5. Нажмите кнопку Select traces и выберите TOF MSE BPI. Нажмите кнопку «Заменить все », чтобы просмотреть BPI.
  6. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите опцию «Добавить столбец » | отобразить информацию о соединении, включая название соединения, натуральную массу, наблюдаемый m/z, погрешность массы, наблюдаемое время удержания (RT), количество детекторов, отклик, аддукты, альтернативные назначения и общее количество найденных фрагментов (рис. 4E).
  7. Выберите опцию High-energy fragments (Высокоэнергетические фрагменты ), чтобы отобразить фрагменты вторичного масс-спектра выбранного соединения (рис. 4F).
  8. Вручную нарисуйте пути молекулярного расщепления в соответствии с каждым вторичным фрагментом (Рисунок 4G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры подробно описаны в разделе репрезентативных результатов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В качестве модели использовалась трава альпийского тысячелистника для отображения репрезентативного результата. Как показано на рисунке 4G, кверцетин-3'-О-глюкозид с m/z = 463,08935 трансформировался в промежуточный продукт с m/z = 300,02828 за счет потери молекул?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Масс-спектрометрия высокого разрешения в сочетании с самостоятельно созданной базой данных предлагает систематическую качественную технологию для идентификации химических компонентов в китайской фитотерапии. В отличие от коммерческой базы данных, которая содерж?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Китайским фондом постдокторантуры (2022MD713780), Группой наследования и инноваций ТКМ по лечению иммунных заболеваний, Медицинским научно-исследовательским проектом Чунцина (совместный проект Комиссии по здравоохранению Чунцина и Бюро по науке и технике) (2022DBXM007) и Фондом естественных наук Чунцина (cstc2018jcyjAX0370). Специальный проект по стимулированию и руководству по результатам работы Чунцинского научно-исследовательского института (cstc2022jxjl120005, cstc2021jxjl130021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethyl acetateChuandongChemicalCAS 141-78-6
liquid chromatographWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-butyl alcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleum etherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometryWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData analysis software

Ссылки

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733(2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -J., Liao, X., Kuang, H. -M., Li, J. -Y., Zhang, S. -H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360(2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

UPLC Q TOF MSAchillea Millefolium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены