Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência-Espectrometria de Massa e Análise de Banco de Dados Autoestabelecida de Componentes da Fitoterapia Chinesa

Resumo

Descrevemos um protocolo geral e um projeto sistemático que pode ser aplicado para separar e reconhecer componentes complexos na erva de mil-folhas alpina, Achillea millefolium L., um fitoterápico chinês.

Resumo

A fitoterapia chinesa é complexa e possui vários compostos desconhecidos, tornando a pesquisa qualitativa crucial. A espectrometria de massa de tempo de voo quadrupolo de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UPLC-Q-TOF-MS) é o método mais amplamente utilizado na análise qualitativa de compostos. O método inclui protocolos padronizados e programados para pré-tratamento de amostras, sintonia de MS, aquisição de MS e processamento de dados. Os pré-tratamentos da amostra incluem coleta, pulverização, extração de solvente, ultrassom, centrifugação e filtração. O pós-processamento de dados foi descrito em detalhes e inclui importação de dados, construção de banco de dados autoestabelecido, estabelecimento de método, processamento de dados e outras operações manuais. A parte acima do solo da erva de mil-folhas alpina, Achillea millefolium L., é usada para tratar inflamações, distúrbios gastrointestinais e dores e seus 3-oxa-guaianolídeos podem ser pistas úteis para o desenvolvimento de medicamentos anti-inflamatórios. Três compostos representativos na LMA foram identificados, combinando TOF-MS com um banco de dados autoestabelecido. Além disso, foram discutidas as diferenças em relação à literatura existente, otimização de parâmetros em fase líquida, seleção do modo de varredura, adequação da fonte de íons, ajuste da energia de colisão, triagem de isômeros, limitação do método e possíveis soluções. Este método de análise padronizado é universal e pode ser aplicado para identificar compostos complexos na fitoterapia chinesa.

Introdução

A medicina chinesa acumulou o conhecimento empírico mais rico do mundo¹. A análise qualitativa dos componentes químicos na fitoterapia tradicional chinesa tornou-se um tópico crucial na pesquisa². Distinguir as diferenças químicas na fitoterapia chinesa é difícil devido à complexidade da categoria e à diversificação da origem³. Os principais tipos de compostos na fitoterapia chinesa incluem alcalóides, saponinas, flavonóides, antraquinonas, terpenóides, cumarinas, lignanas, polissacarídeos, polipeptídeos e proteínas¹. No entanto, a separação de compostos e a identificação de isômeros dificultam o desenvolvimento de pesquisas qualitativas sobre fitoterapia chinesa.

A combinação de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UPLC) com colunas de cromatografia adequadas fornece forte suporte para a separação de compostos complexos na fitoterapia chinesa⁴. Nos últimos anos, a espectrometria de massa de alta resolução tornou-se cada vez mais popular na análise qualitativa da fitoterapia chinesa. Os métodos de espectrometria de massa de alta resolução comumente usados incluem espectrometria de massa de tempo de voo quadrupolo (Q-TOF-MS)⁵, espectrometria de massa orbitrap (Orbitrap-MS)⁶ e espectrometria de massa ciclotron de íons com transformada de Fourier (FT-ICR-MS)⁷. O FT-ICR-MS tem a resolução mais alta, mas acarreta custos dispendiosos de operação e manutenção⁸. Orbitrap-MS tem vantagens na detecção de pequenos compostos moleculares, especialmente em pesos moleculares abaixo de 500 Da⁹. O Q-TOF-MS é o método mais utilizado na análise qualitativa da farmacoquímica sérica^10,11. Em comparação com o banco de dados de rede tradicional ou banco de dados comercial, a análise conjunta com um banco de dados autoestabelecido para processamento de dados tornou-se cada vez mais popular.

A erva de mil-folhas alpina, Achillea millefolium L. (AML), um tipo de fitoterapia chinesa, cresce principalmente em Xinjiang, Mongólia Interior e nas áreas nordeste da China¹². A parte aérea da LMA é amplamente utilizada para tratar inflamação, distúrbios gastrointestinais e dor, incluindo reumatalgia, dor de dente e dor de estômago¹³. Os 3-oxa-guaianolidos da LMA oferecem grande potencial como pistas para o desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias¹⁴. Os estudos atuais sobre componentes químicos na LMA se concentram em sesquiterpenos, monoterpenos, flavonóides e compostos fenólicos¹⁵. No entanto, para a identificação de compostos na LMA, não está disponível nenhum esquema sistemático de indução qualitativa que possa ser usado para outros medicamentos fitoterápicos chineses. Este estudo tem como objetivo fornecer uma identificação padronizada de componentes químicos na fitoterapia chinesa, combinando Q-TOF-MS e análise de banco de dados autoestabelecida.

Protocolo

1. Pré-tratamento da amostra

1. Coleção de fitoterapia chinesa AML
   1. Plante sementes de mil-folhas alpinas, Achillea millefolium L. (AML) no solo em fevereiro. Colete a parte acima do solo da AML em julho do mesmo ano (Figura 1A).
      NOTA: A LMA usada neste artigo foi coletada em uma área montanhosa a uma altitude de 400 m em Mianyang, Sichuan, China.
2. Tratamento de secagem
   1. Lave todo o AML coletado em água pura para remover sedimentos e impurezas. Secar o LMA numa estufa a 50 °C durante 24 h (figura 1B).
3. Preparação de pó
   1. Após a secagem, esmague o AML em um pó grosso usando um triturador multifuncional de alta velocidade. Passe o pó por uma peneira de 50 malhas (Figura 1C).
4. Extração por solvente
   1. Coloque 1 g de amostra de LMA pesada com precisão em um frasco cônico com 30 mL de uma solução de etanol e água a 75% (Figura 2A).
   2. Extrair a mistura num sonicador de banho de ultrassons durante 30 min a 25 °C (figura 2B).
   3. Centrifugue a amostra a 14.000 × g por 5 min (Figura 2C).
   4. Encaixe uma seringa de injeção com um filtro de membrana microporosa (0,22 μm, apenas orgânico) e filtre o sobrenadante em um frasco de amostra de 2 mL (Figura 2D).

2. Sintonia MS

1. Inicie o software de controle LC-MS (Figura 3A). Abra o módulo MS tune e purgue a solução de leucina encefalina (LE) de 1 ng/μL duas vezes.
2. No painel de controle de fluxo LockSpray , defina uma taxa de fluxo de 50 μL/min e clique no botão Fluxo para permitir que a solução LE entre no espectrômetro de massa (Figura 3B).
3. Clique no botão LockSpray Source Setup para concluir o ajuste do MS no modo positivo (Figura 3C). Clique no ícone negativo para alternar o modo de íon. Clique no botão LockSpray Source Setup para concluir a sintonia do MS no modo negativo.

3. Aquisição da MS

1. Defina uma tabela de sequência, incluindo nome do arquivo, método MS, arquivo de entrada, frasco e volume. Clique no botão Salvar para gravar a tabela de sequências.
2. Clique no botão Executar e no botão Iniciar em sequência (Figura 3D). Selecione a opção Adquirir somente dados de exemplo . Clique no botão OK para iniciar a aquisição de dados.
3. Clique no botão Cromatograma para abrir a janela do cromatograma de íons totais (TIC) em tempo real (Figura 3E). Clique no botão Exibir e no botão TIC em sequência. Selecione a opção Cromatograma BPI e clique no botão OK para exibir a janela do cromatograma de pico de base (BPI) (Figura 3F).

4. Processamento de dados

1. Inicie o software de análise de dados.
2. Clique no botão Meu Trabalho e no botão Importar Dados do MassLynx para entrar na janela filho (Figura 4A). Selecione os arquivos de dados brutos e insira o nome do conjunto de amostras e clique no botão Criar conjunto de amostras UNIFI para importar os dados brutos dos espectros MS.
   NOTA: Certifique-se de que os dados brutos positivos e negativos sejam importados separadamente.
3. Estabelecimento de banco de dados
   1. Clique no botão Administração na janela inicial (Figura 4B). Clique no botão Importar itens da biblioteca . Selecione o arquivo de modelo de banco de dados em .xlsx formato com todas as estruturas compostas separadas no formato .mol na mesma pasta.
   2. Insira um nome para o banco de dados. Clique no botão Verificar para garantir que todos os compostos sejam exibidos. Clique no botão Importar para concluir a compilação de um banco de dados autoestabelecido.
      NOTA: Todos os compostos em arquivos de formato .mol independentes que precisam ser importados para o banco de dados são preparados com base nas referências da literatura. Os arquivos de estrutura composta são desenhados por si mesmo usando um software de desenho.
4. Clique no botão Criar método de análise para abrir uma janela secundária. Clique no botão Gerar um método somente de processo para estabelecer um método de processamento de dados.
5. Análise de dados
   1. Clique no botão Criar análise para abrir uma janela secundária.
   2. Clique no botão Criar análise a partir de dados existentes e selecione os dados importados e o método estabelecido.
   3. Clique no botão Processar para iniciar um cálculo de dados longo (Figura 4D).
   4. Clique no botão Investigar para alternar para a janela TIC.
   5. Clique no botão Selecionar rastreamentos e selecione o TOF MS^E BPI. Clique no botão Substituir tudo para visualizar o BPI.
6. Clique com o botão direito do mouse e selecione a opção Adicionar coluna | exibir informações compostas, incluindo nome do composto, massa natural, m/z observado, erro de massa, tempo de retenção observado (RT), contagens de detectores, resposta, adutos, atribuições alternativas e número total de fragmentos encontrados (Figura 4E).
7. Selecione a opção Fragmentos de alta energia para exibir os fragmentos secundários do espectro de massa do composto selecionado (Figura 4F).
8. Desenhe manualmente os caminhos de clivagem molecular de acordo com cada fragmento secundário (Figura 4G).
   NOTA: Os exemplos são descritos em detalhes na seção de resultados representativos.

Resultados

A erva mil-folhas alpina foi usada como modelo para exibir o resultado representativo. Conforme mostrado na Figura 4G, a quercetina-3'-O-glicosídeo com m / z = 463,08935 se transformou em um intermediário com m / z = 300,02828 por perda de uma molécula de hexose durante a reação de hidrólise. Em outra via, a quebra da ligação C-C no esqueleto da estrutura flavonóide levou à formação de um intermediário com m/z = 223,06232, onde a hidroximetil e ...

Discussão

A espectrometria de massa de alta resolução combinada com um banco de dados auto-estabelecido oferece uma tecnologia qualitativa sistemática para identificar componentes químicos na fitoterapia chinesa. Ao contrário de um banco de dados comercial, que contém medicina tradicional chinesa comum, um banco de dados autoestabelecido que usa compostos relatados na literatura fornece mais precisão na análise de medicamentos raros ou étnicos¹⁶. Métodos semelhant...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
Methanol	ChuandongChemical	CAS 67-56-1
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software