Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie und selbst etablierte Datenbankanalyse von Bestandteilen der chinesischen Pflanzenheilkunde

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein allgemeines Protokoll und ein systematisches Design, das angewendet werden könnte, um komplexe Komponenten im alpinen Schafgarbenkraut Achillea millefolium L., einem chinesischen pflanzlichen Arzneimittel, zu trennen und zu erkennen.

Zusammenfassung

Die chinesische Kräutermedizin ist komplex und enthält zahlreiche unbekannte Verbindungen, was qualitative Forschung entscheidend macht. Die Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-Q-TOF-MS) ist die am weitesten verbreitete Methode zur qualitativen Analyse von Verbindungen. Die Methode umfasst standardisierte und programmierte Protokolle für die Probenvorbehandlung, MS-Tune, MS-Erfassung und Datenverarbeitung. Die Probenvorbehandlungen umfassen Sammlung, Pulverisierung, Lösungsmittelextraktion, Ultraschall, Zentrifugation und Filtration. Die Datennachbearbeitung wurde ausführlich beschrieben und umfasst den Datenimport, den selbst erstellten Datenbankaufbau, die Methodeneinrichtung, die Datenverarbeitung und andere manuelle Operationen. Der oberirdische Teil des Alpenschafgarbenkrauts, Achillea millefolium L., wird zur Behandlung von Entzündungen, Magen-Darm-Störungen und Schmerzen eingesetzt, und seine 3-Oxa-Guaianolide könnten nützliche Hinweise für die Entwicklung entzündungshemmender Medikamente sein. Es wurden drei repräsentative Verbindungen bei AML identifiziert, die TOF-MS mit einer selbst etablierten Datenbank kombinieren. Darüber hinaus wurden die Unterschiede zur vorhandenen Literatur, die Optimierung der Flüssigphasenparameter, die Auswahl des Scan-Modus, die Eignung der Ionenquelle, die Anpassung der Kollisionsenergie, das Isomerenscreening, die Methodenbegrenzung und mögliche Lösungen diskutiert. Diese standardisierte Analysemethode ist universell einsetzbar und kann zur Identifizierung komplexer Verbindungen in der chinesischen Kräutermedizin angewendet werden.

Einleitung

Die chinesische Medizin hat das reichste empirische Wissen der Welt angesammelt¹. Die qualitative Analyse chemischer Bestandteile in der traditionellen chinesischen Kräutermedizin ist zu einem zentralen Thema in der Forschung geworden². Die Unterscheidung chemischer Unterschiede in der chinesischen Kräutermedizin ist aufgrund der Komplexität der Kategorien und der Diversifizierung der Herkunft schwierig³. Zu den wichtigsten Verbindungstypen in der chinesischen Kräutermedizin gehören Alkaloide, Saponine, Flavonoide, Anthrachinonen, Terpenoide, Cumarine, Lignane, Polysaccharide, Polypeptide und Proteine¹. Die Trennung von Verbindungen und die Identifizierung von Isomeren behindern jedoch die Entwicklung der qualitativen Forschung zur chinesischen Kräutermedizin.

Die Kombination von Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC) mit geeigneten Chromatographiesäulen bietet eine starke Unterstützung für die Trennung komplexer Verbindungen in der chinesischen Kräutermedizin⁴. In den letzten Jahren hat die hochauflösende Massenspektrometrie in der qualitativen Analyse der chinesischen Kräutermedizin immer mehr an Popularität gewonnen. Zu den häufig verwendeten hochauflösenden Massenspektrometriemethoden gehören die Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (Q-TOF-MS⁾⁵, die Orbitrap-Massenspektrometrie (Orbitrap-MS)⁶ und die Fourier-Transformations-Ionenzyklotron-Massenspektrometrie (FT-ICR-MS⁾⁷. FT-ICR-MS hat die höchste Auflösung, ist aber mit kostspieligen Betriebs- und Wartungskosten verbunden⁸. Orbitrap-MS hat Vorteile beim Nachweis kleinmolekularer Verbindungen, insbesondere bei Molekulargewichten unter 500 Da⁹. Die Q-TOF-MS ist die am weitesten verbreitete Methode in der qualitativen Analyse der Pharmakochemie des Serums^10,11. Im Vergleich zur traditionellen Netzwerkdatenbank oder kommerziellen Datenbank hat sich die gemeinsame Analyse mit einer selbst etablierten Datenbank zur Datenverarbeitung immer mehr durchgesetzt.

Alpenschafgarbenkraut, Achillea millefolium L. (AML), eine Art chinesisches Kräuterheilmittel, wächst hauptsächlich in Xinjiang, in der Inneren Mongolei und in den nordöstlichen Gebieten Chinas¹². Der oberirdische Teil der AML wird häufig zur Behandlung von Entzündungen, Magen-Darm-Störungen und Schmerzen eingesetzt, einschließlich Rheumatalgie, Zahnschmerzen und Bauchschmerzen¹³. Die 3-Oxa-Guaianolide aus AML bieten großes Potenzial als Leitstrukturen für die Entwicklung entzündungshemmender Medikamente¹⁴. Aktuelle Studien zu chemischen Komponenten bei AML konzentrieren sich auf Sesquiterpene, Monoterpene, Flavonoide und phenolische Verbindungen¹⁵. Für die Identifizierung von Verbindungen bei AML steht jedoch kein systematisches qualitatives Induktionsschema zur Verfügung, das für andere chinesische pflanzliche Arzneimittel verwendet werden könnte. Ziel dieser Studie ist es, durch die Kombination von Q-TOF-MS und selbst etablierter Datenbankanalyse eine standardisierte Identifizierung chemischer Komponenten in der chinesischen Kräutermedizin zu ermöglichen.

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Protokoll

1. Vorbehandlung der Proben

1. Sammlung der chinesischen Kräutermedizin AML
   1. Pflanzen Sie im Februar die Samen des Alpenschafgarbenkrauts, Achillea millefolium L. (AML) in die Erde. Sammeln Sie den oberirdischen Teil der AML im Juli desselben Jahres (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die in dieser Arbeit verwendete AML wurde in einem bergigen Gebiet in einer Höhe von 400 m in Mianyang, Sichuan, China, gesammelt.
2. Trocknungsbehandlung
   1. Waschen Sie alle gesammelten AML in reinem Wasser, um Sedimente und Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie die AML 24 h lang bei 50 °C im Ofen (Abbildung 1B).
3. Zubereitung von Pulver
   1. Nach dem Trocknen wird AML mit einem Hochgeschwindigkeits-Multifunktionsbrecher zu einem groben Pulver zerkleinert. Das Pulver durch ein 50-Mesh-Sieb passieren (Abbildung 1C).
4. Extraktion mit Lösungsmitteln
   1. 1 g der genau gewogenen AML-Probe wird in einen ermächtigten Kolben mit 30 ml einer 75%igen Ethanol-Wasser-Lösung gegeben (Abbildung 2A).
   2. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 25 °C in einem Ultraschallbad-Ultraschallgerät extrahiert (Abbildung 2B).
   3. Zentrifugieren Sie die Probe 5 Minuten lang bei 14.000 × g (Abbildung 2C).
   4. Setzen Sie eine Injektionsspritze mit einem mikroporösen Membranfilter (0,22 μm, nur organisch) ein und filtrieren Sie den Überstand in eine 2-ml-Probenflasche (Abbildung 2D).

2. MS-Optimierung

1. Starten Sie die LC-MS-Steuerungssoftware (Abbildung 3A). Öffnen Sie das MS tune-Modul und spülen Sie die 1 ng/μl Leucin-Enzephalin (LE)-Lösung zweimal.
2. Stellen Sie im LockSpray Flow Control Panel eine Durchflussrate von 50 μl/min ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Flow , um die LE-Lösung in das Massenspektrometer gelangen zu lassen (Abbildung 3B).
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche LockSpray Source Setup , um die MS-Optimierung im positiven Modus abzuschließen (Abbildung 3C). Klicken Sie auf das negative Symbol , um den Ionenmodus zu wechseln. Klicken Sie auf die Schaltfläche LockSpray Source Setup , um die MS-Optimierung im Negativmodus abzuschließen.

3. MS-Erwerb

1. Legen Sie eine Sequenztabelle fest, die den Dateinamen, die MS-Methode, die Einlassdatei, das Fläschchen und das Volumen enthält. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Sequenztabelle aufzuzeichnen.
2. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Ausführen und Starten (Abbildung 3D). Wählen Sie die Option Nur Beispieldaten erfassen . Klicken Sie auf die Schaltfläche OK , um die Datenerfassung zu starten.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Chromatogramm , um das Echtzeit-Fenster für das Gesamtionenchromatogramm (TIC) zu öffnen (Abbildung 3E). Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen Anzeige und TIC . Wählen Sie die Option BPI-Chromatogramm und klicken Sie dann auf die Schaltfläche OK , um das Fenster für das Basis-Peak-Chromatogramm (BPI) anzuzeigen (Abbildung 3F).

4. Datenverarbeitung

1. Starten Sie die Datenanalysesoftware.
2. Klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen "Meine Arbeit " und dann auf die Schaltfläche "MassLynx-Daten importieren ", um das untergeordnete Fenster aufzurufen (Abbildung 4A). Wählen Sie die Rohdatendateien aus, geben Sie den Namen des Sample-Sets ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche UNIFI Sample-Set erstellen , um die Rohdaten der MS-Spektren zu importieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die positiven und negativen Rohdaten separat importiert werden.
3. Aufbau einer Datenbank
   1. Klicken Sie im ersten Fenster auf die Schaltfläche Administration (Abbildung 4B). Klicken Sie auf die Schaltfläche Bibliothekselemente importieren . Wählen Sie die Datenbankvorlagendatei in .xlsx Format mit allen getrennten zusammengesetzten Strukturen im .mol-Format im selben Ordner aus.
   2. Geben Sie einen Namen für die Datenbank ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Überprüfen , um sicherzustellen, dass alle Verbindungen angezeigt werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche Importieren , um den Aufbau einer selbst erstellten Datenbank abzuschließen.
      HINWEIS: Alle Verbindungen in unabhängigen Dateien im .mol-Format, die in die Datenbank importiert werden müssen, werden auf der Grundlage der Literaturhinweise erstellt. Zusammengesetzte Strukturdateien werden von einem selbst mit Hilfe einer Zeichensoftware gezeichnet.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysemethode erstellen , um ein untergeordnetes Fenster zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Nur Prozessmethode generieren , um eine Datenverarbeitungsmethode einzurichten.
5. Datenanalyse
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse erstellen , um ein untergeordnetes Fenster zu öffnen.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse aus vorhandenen Daten erstellen und wählen Sie dann die importierten Daten und die etablierte Methode aus.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verarbeiten , um eine Berechnung langer Daten zu starten (Abbildung 4D).
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Untersuchen , um zum TIC-Fenster zu wechseln.
   5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ablaufverfolgungen auswählen und wählen Sie den TOF MS^E BPI AUS. Klicken Sie auf die Schaltfläche Alle ersetzen , um den BPI anzuzeigen.
6. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Option Spalte hinzufügen | Zeigen Sie Verbindungsinformationen an, einschließlich des Verbindungsnamens, der natürlichen Masse, der beobachteten m/z, des Massenfehlers, der beobachteten Retentionszeit (RT), der Detektoranzahl, der Antwort, der Addukte, alternativer Zuordnungen und der Gesamtzahl der gefundenen Fragmente (Abbildung 4E).
7. Wählen Sie die Option Hochenergetische Fragmente , um die Fragmente des sekundären Massenspektrums der ausgewählten Verbindung anzuzeigen (Abbildung 4F).
8. Zeichnen Sie die molekularen Spaltungspfade manuell für jedes Sekundärfragment (Abbildung 4G).
   HINWEIS: Beispiele werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" ausführlich beschrieben.

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Ergebnisse

Als Vorbild diente das Alpenschafgarbenkraut, um das repräsentative Ergebnis darzustellen. Wie in Abbildung 4G gezeigt, wurde Quercetin-3'-O-Glucosid mit m/z = 463,08935 durch Verlust eines Hexose-Moleküls während der Hydrolysereaktion in ein Zwischenprodukt mit m/z = 300,02828 umgewandelt. In einem anderen Weg führte der Bruch der C-C-Bindung im Flavonoid-Strukturskelett zur Bildung eines Zwischenprodukts mit m/z = 223,06232, bei dem Hydroxymethyl und b...

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Diskussion

Die hochauflösende Massenspektrometrie in Kombination mit einer selbst etablierten Datenbank bietet eine systematische qualitative Technologie zur Identifizierung chemischer Bestandteile in der chinesischen Kräutermedizin. Im Gegensatz zu einer kommerziellen Datenbank, die gängige traditionelle chinesische Medizin enthält, bietet eine selbst erstellte Datenbank, die in der Literatur berichtete Verbindungen verwendet, eine höhere Genauigkeit bei der Analyse seltener oder ethnischer M...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
Methanol	ChuandongChemical	CAS 67-56-1
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software