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摘要

我们描述了一种通用方案和系统设计，可用于分离和识别高山西洋蓍草 Achillea millefolium L.（ 一种中草药）中的复杂成分。

摘要

中草药很复杂，有许多未知化合物，因此定性研究至关重要。超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法 （UPLC-Q-TOF-MS） 是化合物定性分析中使用最广泛的方法。该方法包括用于样品预处理、MS 调谐、MS 采集和数据处理的标准化和编程方案。样品前处理包括收集、粉碎、溶剂萃取、超声、离心和过滤。详细描述了数据后处理，包括数据导入、自建数据库构建、方法建立、数据处理和其他手动作。高山西洋蓍草的地上部分 Achillea millefolium L. 用于治疗炎症、胃肠道紊乱和疼痛，其 3-oxa-愈创木内酯可能是抗炎药开发的有用线索。将 TOF-MS 与自建数据库相结合，确定了 AML 中的 3 种代表性化合物。此外，还讨论了与现有文献的差异、液相参数优化、扫描模式选择、离子源适用性、碰撞能量调整、异构体筛选、方法限制和可能的解决方案。这种标准化分析方法是通用的，可用于鉴定中草药中的复杂化合物。

引言

中医积累了世界上最丰富的实证知识1.中草药中化学成分的定性分析已成为研究的关键课题2.由于类别的复杂性和来源的多样化，区分中草药的化学差异是困难的3。中草药中的主要化合物类型包括生物碱、皂苷、类黄酮、蒽醌、萜类化合物、香豆素、木脂素、多糖、多肽和蛋白质1。然而，化合物的分离和异构体的鉴定阻碍了中草药定性研究的发展。

超高效液相色谱 （UPLC） 与合适的色谱柱相结合，为中草药中复杂化合物的分离提供了有力支持4。近年来，高分辨率质谱在中草药定性分析中越来越受欢迎。常用的高分辨率质谱方法包括四极杆飞行时间质谱法 （Q-TOF-MS）5、Orbitrap 质谱法 （Orbitrap-MS）6 和傅里叶变换离子回旋加速器质谱法 （FT-ICR-MS）7。FT-ICR-MS 具有最高的分辨率，但需要昂贵的作和维护成本8。Orbitrap-MS 在检测小分子化合物方面具有优势，尤其是在分子量低于 500 Da9 时。Q-TOF-MS 是血清药物化学定性分析中使用最广泛的方法10,11。与传统的网络数据库或商业数据库相比，与自建数据库联合分析进行数据处理已越来越受欢迎。

高山西洋蓍草 （ AML） 是一种中草药，主要生长在新疆、内蒙古和中国东北地区12.AML 的地上部分广泛用于治疗炎症、胃肠道紊乱和疼痛，包括风湿痛、牙痛和胃痛13。来自 AML 的 3-氧杂愈创木内酯具有巨大的抗炎药物开发潜力14。目前对 AML 中化学成分的研究集中在倍半萜、单萜、类黄酮和酚类化合物15。然而，对于AML中化合物的鉴定，尚无可用于其他中草药的系统定性诱导方案。本研究旨在通过结合 Q-TOF-MS 和自建数据库分析，提供中草药中化学成分的标准化鉴定。

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研究方案

1. 样品前处理

  1. 中草药 AML 的收集
    1. 2 月在地里种植高山蓍草 （Achillea millefolium L. （AML） 种子。同年 7 月收集 AML 的地上部分（图 1A）。
      注：本文使用的 AML 采集于中国四川绵阳海拔 400 m 的山区。
  2. 干燥处理
    1. 用纯水清洗所有收集的 AML 以去除沉淀物和杂质。将 AML 在 50 °C 的烘箱中干燥 24 小时（图 1B）。
  3. 粉末制备
    1. 干燥后，使用高速多功能破碎机将 AML 粉碎成粗粉末。将粉末通过 50 目筛子（图 1C）。
  4. 溶剂萃取
    1. 将 1 g 准确称量的 AML 样品放入装有 30 mL 75% 乙醇-水溶液的锥形瓶中（图 2A）。
    2. 在超声浴超声仪中于 25 °C 下提取混合物 30 分钟（图 2B）。
    3. 将样品以 14,000 × g 离心 5 分钟（图 2C）。
    4. 安装带有微孔膜过滤器（0.22 μm，仅有机物）的注射注射器，并将上清液过滤到 2 mL 样品瓶中（图 2D）。

2. MS 调音

  1. 启动 LC-MS 控制软件（图 3A）。打开 MS 调谐模块，将 1 ng/μL 亮氨酸脑蛋白 （LE） 溶液灌注两次。
  2. 在 LockSpray 流量控制面板 中，设置 50 μL/min 的流速 ，然后单击 “流量 ”按钮，让 LE 溶液进入质谱仪（图 3B）。
  3. 单击 LockSpray Source Setup（LockSpray 源设置） 按钮，在正离子模式下完成 MS 调谐（图 3C）。单击 负片图标 可切换离子模式。单击 LockSpray Source Setup（LockSpray 源设置） 按钮，在负离子模式下完成 MS 调谐。

3. MS 采集

  1. 设置 序列表，包括 文件名、MS 方法、进样口文件、样品瓶和 体积。单击 Save 按钮以记录序列表。
  2. 依次单击 Run 按钮和 Start 按钮 （图 3D）。选择 Acquire sample data only 选项。点击 OK 按钮开始数据采集。
  3. 单击 “色谱图 ”按钮打开实时总离子色谱图 （TIC） 窗口（图 3E）。依次单击 Display 按钮和 TIC 按钮。选择 BPI 色谱图 选项，然后单击 OK 按钮以显示基峰色谱图 （BPI） 窗口（图 3F）。

4. 数据处理

  1. 启动数据分析软件。
  2. 依次单击 My Work（我的工作 ）按钮和 Import MassLynx Data（导入 MassLynx 数据 ）按钮，进入子窗口（图 4A）。选择原始数据文件并输入样品组名称，然后单击“ 创建 UNIFI 样品组 ”按钮以导入 MS 谱图的原始数据。
    注意：确保分别导入正负原始数据。
  3. 数据库建立
    1. 单击初始窗口中的 Administration 按钮（图 4B）。单击 Import library items 按钮。选择.xlsx格式的数据库模板文件，所有分隔的化合物结构都为 .mol 格式，位于同一文件夹中。
    2. 输入数据库的名称。单击 Verify 按钮以确保显示所有化合物。单击 Import 按钮，完成自建数据库的构建。
      注：所有需要导入数据库的独立 .mol 格式文件的化合物均基于文献参考文献制备。复合结构文件是自己使用绘图软件绘制的。
  4. 单击 Create analysis method 按钮以打开子窗口。单击 Generate a process only method 按钮以建立数据处理方法。
  5. 数据分析
    1. 单击 Create analysis 按钮打开子窗口。
    2. 单击 Create analysis from existing data 按钮，然后选择导入的数据和已建立的方法。
    3. 单击 Process 按钮开始长数据计算（图 4D）。
    4. 单击 Investigate 按钮切换到 TIC 窗口。
    5. 单击 Select traces 按钮，然后选择 TOF MSE BPI。单击 Replace all 按钮查看 BPI。
  6. 右键单击并选择 “添加列 ”选项 |显示化合物信息，包括 化合物名称、自然质量数、观察到的 m/z、质量数误差、观察到的保留时间 （RT）、检测器计数、响应、加合物、替代分配和 找到的碎片总数 （图 4E）。
  7. 选择 High-energy fragments 选项以显示所选化合物的二级质谱碎片（图 4F）。
  8. 根据每个二级片段手动绘制分子切割路径（图 4G）。
    注意：代表性结果部分详细介绍了示例。

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结果

以高山西洋蓍草为模型，显示代表性结果。如图 4G 所示，m/z = 463.08935 的槲皮素-3'-O-葡萄糖苷在水解反应过程中通过失去己糖分子转化为 m/z = 300.02828 的中间体。在另一种途径中，类黄酮结构骨架中 C-C 键的断裂导致形成 m/z = 223.06232 的中间体，其中己糖单元中的羟甲基和相邻羟基消失。此外，己糖骨架的裂解导致 m/z = 71.01498 的中间体。对于酚酸，m/z...

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讨论

高分辨率质谱法与自建数据库相结合，为鉴定中草药中的化学成分提供了系统的定性技术。与包含常见中药的商业数据库不同，使用文献中报道的化合物的自建数据库在稀有或民族医学的分析中提供了更高的准确性16。类似的方法已应用于其他研究领域，包括成品药17（finished drug products）、染料18（dyes）和塑料包装

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披露声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

致谢

这项工作由中国博士后科学基金（2022MD713780）、中医治疗免疫病传承与创新团队、重庆市医学科研项目（重庆市卫健委与科技局联合项目）（2022DBXM007）和重庆市自然科学基金（cstc2018jcyjAX0370）资助。重庆市科学研究院绩效激励与指导专项（cstc2022jxjl120005、cstc2021jxjl130021）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethyl acetateChuandongChemicalCAS 141-78-6
liquid chromatographWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-butyl alcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleum etherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometryWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData analysis software

参考文献

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
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  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
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  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

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