JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir Çin bitkisel ilacı olan Alp civanperçemi bitkisi Achillea millefolium L.' deki karmaşık bileşenleri ayırmak ve tanımak için uygulanabilecek genel bir protokol ve sistematik tasarım açıklıyoruz.

Özet

Çin bitkisel tıbbı karmaşıktır ve çok sayıda bilinmeyen bileşiğe sahiptir, bu da nitel araştırmayı çok önemli hale getirir. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometresi (UPLC-Q-TOF-MS), bileşiklerin kalitatif analizinde en yaygın kullanılan yöntemdir. Yöntem, numune ön işlemi, MS ayarı, MS alımı ve veri işleme için standartlaştırılmış ve programlanmış protokolleri içerir. Numune ön işlemleri arasında toplama, toz haline getirme, solvent ekstraksiyonu, ultrason, santrifüjleme ve filtrasyon yer alır. Veri işleme sonrası ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve veri içe aktarma, kendi kendine kurulan veritabanı oluşturma, yöntem oluşturma, veri işleme ve diğer manuel işlemleri içerir. Alp civanperçemi otunun toprak üstü kısmı olan Achillea millefolium L., iltihabı, gastrointestinal rahatsızlıkları ve ağrıyı tedavi etmek için kullanılır ve 3-oksa-guaianolidleri, anti-enflamatuar ilaç gelişimi için yararlı ipuçları olabilir. AML'de, TOF-MS'yi kendi kendine kurulan bir veri tabanı ile birleştiren üç temsili bileşik tanımlandı. Ayrıca, mevcut literatürden farklılıklar, sıvı faz parametre optimizasyonu, tarama modu seçimi, iyon kaynağı uygunluğu, çarpışma enerjisi ayarı, izomer taraması, yöntem sınırlaması ve olası çözümler tartışılmıştır. Bu standartlaştırılmış analiz yöntemi evrenseldir ve Çin bitkisel tıbbındaki karmaşık bileşikleri tanımlamak için uygulanabilir.

Giriş

Çin tıbbı dünyadaki en zengin ampirik bilgiyi biriktirmiştir1. Geleneksel Çin bitkisel tıbbındaki kimyasal bileşenlerin kalitatif analizi, araştırmada çok önemli bir konu haline gelmiştir2. Çin bitkisel tıbbındaki kimyasal farklılıkları ayırt etmek, kategori karmaşıklığı ve köken çeşitlendirmesi nedeniyle zordur3. Çin bitkisel tıbbındaki başlıca bileşik türleri arasında alkaloidler, saponinler, flavonoidler, antrakinonlar, terpenoidler, kumarinler, lignanlar, polisakkaritler, polipeptitler ve proteinler bulunur1. Bununla birlikte, bileşiklerin ayrılması ve izomerlerin tanımlanması, Çin bitkisel tıbbı üzerine nitel araştırmaların geliştirilmesini engellemektedir.

Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin (UPLC) uygun kromatografi kolonları ile kombinasyonu, Çin bitkisel tıbbında karmaşık bileşiklerin ayrılması için güçlü destek sağlar4. Son yıllarda, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, Çin bitkisel tıbbı kalitatif analizinde giderek daha popüler hale geldi. Yaygın olarak kullanılan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi yöntemleri arasında dört kutuplu uçuş süresi kütle spektrometrisi (Q-TOF-MS)5, orbitrap kütle spektrometrisi (Orbitrap-MS)6 ve Fourier dönüşümü iyon siklotron kütle spektrometrisi (FT-ICR-MS)7 bulunur. FT-ICR-MS en yüksek çözünürlüğe sahiptir ancak maliyetli işletme ve bakım maliyetleri gerektirir8. Orbitrap-MS, özellikle 500 Da9'un altındaki moleküler ağırlıklarda küçük moleküler bileşiklerin tespit edilmesinde avantajlara sahiptir. Q-TOF-MS, serum farmakokimyasının kalitatif analizinde en yaygın kullanılan yöntemdir10,11. Geleneksel ağ veritabanı veya ticari veritabanı ile karşılaştırıldığında, veri işleme için kendi kendine kurulan bir veritabanı ile ortak analiz giderek daha popüler hale geldi.

Alp civanperçemi otu, bir tür Çin bitkisel ilacı olan Achillea millefolium L. (AML), esas olarak Sincan, İç Moğolistan ve Çin'in kuzeydoğu bölgelerinde yetişir12. AML'nin toprak üstü kısmı, romatalji, diş ağrısı ve mide ağrısı dahil olmak üzere iltihaplanma, gastrointestinal rahatsızlıklar ve ağrıyı tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır13. AML'den gelen 3-oksa-guayananoidler, anti-inflamatuar ilaç geliştirme için yol gösterici olarak büyük bir potansiyel sunar14. AML'deki kimyasal bileşenler üzerine yapılan güncel çalışmalar, seskiterpenler, monoterpenler, flavonoidler ve fenolik bileşiklereodaklanmaktadır 15. Bununla birlikte, AML'deki bileşiklerin tanımlanması için, diğer Çin bitkisel ilaçları için kullanılabilecek sistematik bir kalitatif indüksiyon şeması mevcut değildir. Bu çalışma, Q-TOF-MS ve kendi kendine kurulan veri tabanı analizini birleştirerek Çin bitkisel tıbbındaki kimyasal bileşenlerin standart bir şekilde tanımlanmasını sağlamayı amaçlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Numune ön işlemi

  1. Çin bitkisel tıbbı AML'nin toplanması
    1. Şubat ayında toprağa alpin civanperçemi otu, Achillea millefolium L. (AML) tohumları ekin. AML'nin yer üstü kısmını aynı yılın Temmuz ayında toplayın (Şekil 1A).
      NOT: Bu yazıda kullanılan AML, Mianyang, Sichuan, Çin'de 400 m yükseklikte dağlık bir alanda toplanmıştır.
  2. Kurutma tedavisi
    1. Tortu ve yabancı maddeleri gidermek için toplanan tüm AML'yi saf suda yıkayın. AML'yi 50 °C'de 24 saat fırında kurutun (Şekil 1B).
  3. Toz hazırlama
    1. Kuruduktan sonra, yüksek hızlı çok işlevli bir kırıcı kullanarak AML'yi kaba bir toz haline getirin. Tozu 50 gözenekli bir elekten geçirin (Şekil 1C).
  4. Solvent ekstraksiyonu
    1. 1 g doğru tartılmış AML numunesini 30 mL %75 etanol-su çözeltisi içeren konik bir şişeye yerleştirin (Şekil 2A).
    2. Karışımı 25 ° C'de 30 dakika boyunca bir ultrason banyosu sonikatöründe çıkarın (Şekil 2B).
    3. Numuneyi 14.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin (Şekil 2C).
    4. Mikro gözenekli membran filtreli (0,22 μm, yalnızca organik) bir enjeksiyon şırıngası takın ve süpernatanı 2 mL'lik bir numune şişesine süzün (Şekil 2D).

2. MS ayarı

  1. LC-MS kontrol yazılımını başlatın (Şekil 3A). MS tune modülünü açın ve 1 ng / μL lösin ensefalin (LE) çözeltisini iki kez boşaltın.
  2. LockSpray Akış Kontrol panelinde, 50 μL/dk'lık bir akış hızı ayarlayın ve LE çözeltisinin kütle spektrometresine girmesine izin vermek için Akış düğmesine tıklayın (Şekil 3B).
  3. MS ayarını pozitif modda tamamlamak için LockSpray Source Setup düğmesine tıklayın (Şekil 3C). İyon modunu değiştirmek için negatif simgeye tıklayın. MS ayarını negatif modda tamamlamak için LockSpray Source Setup düğmesine tıklayın.

3. MS edinimi

  1. Dosya adı, MS yöntemi, giriş dosyası, flakon ve hacim dahil olmak üzere bir dizi tablosu ayarlayın. Sıra tablosunu kaydetmek için Kaydet düğmesine tıklayın.
  2. Çalıştır düğmesine ve Başlat düğmesine sırayla tıklayın (Şekil 3D). Yalnızca örnek verileri al seçeneğini belirleyin. Veri toplamayı başlatmak için Tamam düğmesine tıklayın.
  3. Gerçek zamanlı toplam iyon kromatogramı (TIC) penceresini açmak için Kromatogram düğmesine tıklayın (Şekil 3E). Sırayla Görüntüle düğmesine ve TIC düğmesine tıklayın. BPI Kromatogram seçeneğini seçin, ardından temel tepe kromatogramı (BPI) penceresini görüntülemek için Tamam düğmesine tıklayın (Şekil 3F).

4. Veri işleme

  1. Veri analizi yazılımını başlatın.
  2. Alt pencereye girmek için My Work düğmesine ve MassLynx Verilerini İçe Aktar düğmesine tıklayın (Şekil 4A). Ham veri dosyalarını seçin ve örnek set adını girin, ardından MS spektrumlarının ham verilerini içe aktarmak için UNIFI Örnek Seti Oluştur düğmesine tıklayın.
    NOT: Pozitif ve negatif ham verilerin ayrı ayrı içe aktarıldığından emin olun.
  3. Veritabanı kurulumu
    1. İlk penceredeki Yönetim düğmesine tıklayın (Şekil 4B). Kitaplık öğelerini içe aktar düğmesine tıklayın. Veritabanı şablon dosyasını, tüm ayrılmış bileşik yapıları aynı klasörde .mol biçiminde olacak şekilde .xlsx biçiminde seçin.
    2. Veritabanı için bir ad girin. Tüm bileşiklerin görüntülendiğinden emin olmak için Doğrula düğmesine tıklayın. Kendi kendine kurulan bir veritabanının yapısını tamamlamak için İçe Aktar düğmesine tıklayın.
      NOT: Veritabanına alınması gereken bağımsız .mol formatındaki tüm bileşikler literatür referanslarına dayalı olarak hazırlanmıştır. Bileşik yapı dosyaları, çizim yazılımı kullanılarak kendi kendine çizilir.
  4. Bir alt pencere açmak için Analiz yöntemi oluştur düğmesine tıklayın. Bir veri işleme yöntemi oluşturmak için Yalnızca bir işlem yöntemi oluştur düğmesine tıklayın.
  5. Veri analizi
    1. Bir alt pencere açmak için Analiz oluştur düğmesine tıklayın.
    2. Mevcut verilerden analiz oluştur düğmesine tıklayın, ardından içe aktarılan verileri ve oluşturulan yöntemi seçin.
    3. Uzun bir veri hesaplaması başlatmak için İşlem düğmesine tıklayın (Şekil 4D).
    4. TIC penceresine geçmek için Araştır düğmesine tıklayın.
    5. İzlemeleri seç düğmesine tıklayın ve TOF MSE BPI'yi seçin. BPI'yi görüntülemek için Tümünü değiştir düğmesine tıklayın.
  6. Sağ tıklayın ve Sütun ekle seçeneğini seçin | bileşik adı, doğal kütle, gözlemlenen m/z, kütle hatası, gözlemlenen tutma süresi (RT), dedektör sayıları, yanıt, eklentiler, alternatif atamalar ve bulunan toplam parça sayısı dahil olmak üzere bileşik bilgileri görüntüleyin (Şekil 4E).
  7. Seçilen bileşiğin ikincil kütle spektrumu parçalarını görüntülemek için Yüksek enerjili fragmanlar seçeneğini seçin (Şekil 4F).
  8. Moleküler bölünme yollarını her bir ikincil parçaya göre manuel olarak çizin (Şekil 4G).
    NOT: Örnekler, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Temsili sonucu göstermek için model olarak Alp civanperçemi otu kullanıldı. Şekil 4G'de gösterildiği gibi, m/z = 463.08935 olan kuersetin-3'-O-glukozit, hidroliz reaksiyonu sırasında bir heksoz molekülünün kaybı yoluyla m/z = 300.02828 ile bir ara ürüne dönüşür. Başka bir yolda, flavonoid yapı iskeletindeki CC bağının kırılması, heksoz birimindeki hidroksimetil ve bitişik hidroksinin kaybolduğu m/z = 223.06232 ile bir ara madden...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, kendi kendine kurulmuş bir veri tabanı ile birleştiğinde, Çin bitkisel tıbbındaki kimyasal bileşenleri tanımlamak için sistematik bir kalitatif teknoloji sunar. Yaygın geleneksel Çin tıbbını içeren ticari bir veri tabanının aksine, literatürde bildirilen bileşikleri kullanan kendi kendine kurulmuş bir veri tabanı, nadir veya etnik tıbbın analizinde daha fazla doğruluk sağlar16. Benzer yön...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2022MD713780), TCM Bağışıklık Hastalıkları Tedavisi Kalıtım ve İnovasyon Ekibi, Chongqing Tıbbi Bilimsel Araştırma Projesi (Chongqing Sağlık Komisyonu ve Bilim ve Teknoloji Bürosu'nun ortak projesi) (2022DBXM007) ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2018jcyjAX0370) tarafından finanse edilmiştir. Chongqing Bilimsel Araştırma Enstitüsü'nün performans teşviki ve rehberliği için özel bir proje (cstc2022jxjl120005, cstc2021jxjl130021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethyl acetateChuandongChemicalCAS 141-78-6
liquid chromatographWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
MethanolChuandongChemicalCAS 67-56-1
n-butyl alcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleum etherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometryWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData analysis software

Referanslar

  1. Cai, Z., Lee, F., Wang, X., Yu, W. A capsule review of recent studies on the application of mass spectrometry in the analysis of chinese medicinal herbs. Journal of Mass Spectrometry. 37 (10), 1013-1024 (2002).
  2. Zhu, C., Li, X., Zhang, B., Lin, Z. Quantitative analysis of multi-components by single marker-a rational method for the internal quality of chinese herbal medicine. Integrative Medicine Research. 6 (1), 1-11 (2017).
  3. Huigens Iii, R. W., et al. A ring-distortion strategy to construct stereochemically complex and structurally diverse compounds from natural products. Nature Chemistry. 5 (3), 195-202 (2013).
  4. Wang, X., Zhang, A., Yan, G., Han, Y., Sun, H. Uhplc-ms for the analytical characterization of traditional chinese medicines. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 63, 180-187 (2014).
  5. Li, H., et al. Application of uhplc-esi-q-tof-ms to identify multiple constituents in processed products of the herbal medicine ligustri lucidi fructus. Molecules. 22 (5), 689(2017).
  6. Wang, X., et al. A novel and comprehensive strategy for quality control in complex chinese medicine formula using uhplc-q-orbitrap hrms and uhplc-ms/ms combined with network pharmacology analysis: Take tangshen formula as an example. Journal of Chromatography B. 1183, 122889(2021).
  7. Han, F., et al. A rapid and sensitive uhplc-ft-icr ms/ms method for identification of chemical constituents in rhodiola crenulata extract, rat plasma and rat brain after oral administration. Talanta. 160, 183-193 (2016).
  8. Destefani, C. A., et al. Europium-organic complex as luminescent marker for the visual identification of gunshot residue and characterization by electrospray ionization ft-icr mass spectrometry. Microchemical Journal. 116, 216-224 (2014).
  9. Huang, Q., et al. Affinity ultrafiltration and uplc-hr-orbitrap-ms based screening of thrombin-targeted small molecules with anticoagulation activity from poecilobdella manillensis. Journal of Chromatography B. 1178, 122822(2021).
  10. Broeckling, C. D., Heuberger, A. L., Prenni, J. E. Large scale non-targeted metabolomic profiling of serum by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (73), e50242(2013).
  11. Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms). JoVE (Journal of Visualized Experiments. (75), e50433(2013).
  12. Li, H., et al. Guaianolide sesquiterpene lactones from achillea millefolium l. Phytochemistry. 186, 112733(2021).
  13. Giorgi, A., Bononi, M., Tateo, F., Cocucci, M. Yarrow (achillea millefolium l.) growth at different altitudes in central italian alps: Biomass yield, oil content and quality. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 11 (3), 47-58 (2005).
  14. Li, H., et al. Guaianolides from achillea millefolium l. And their anti-inflammatory activity. Phytochemistry. 210, 113647(2023).
  15. Ali, S. I., Gopalakrishnan, B., Venkatesalu, V. Pharmacognosy, phytochemistry and pharmacological properties of achillea millefolium l.: A review. Phytotherapy Research. 31 (8), 1140-1161 (2017).
  16. Zhou, Q. Y. -J., Liao, X., Kuang, H. -M., Li, J. -Y., Zhang, S. -H. Lc-ms metabolite profiling and the hypoglycemic activity of morus alba l. Extracts. Molecules. 27 (17), 5360(2022).
  17. Chen, Z., et al. Rapid characterization of chemical constituents in naoling pian by lc-ms combined with data processing techniques. Journal of Separation Science. 45 (18), 3431-3442 (2022).
  18. Guo, Y., et al. A precise self-built secondary mass database for identifying red dyes and dyeing techniques with uplc-ms/ms. Journal of Mass Spectrometry. 57 (5), 4823(2022).
  19. Zhang, Y., et al. Detection and identification of leachables in vaccine from plastic packaging materials using uplc-qtof ms with self-built polymer additives library. Analytical Chemistry. 88 (13), 6749-6757 (2016).
  20. Fan, Y. -L., et al. A database-guided integrated strategy for comprehensive chemical profiling of traditional chinese medicine. Journal of Chromatography A. 1674, 463145(2022).
  21. Liu, M., et al. Structural features guided "fishing" strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data "pool" by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1124, 122-134 (2019).
  22. Zhang, F., et al. An integrated strategy for the comprehensive profiling of the chemical constituents of aspongopus chinensis using uplc-qtof-ms combined with molecular networking. Pharmaceutical Biology. 60 (1), 1349-1364 (2022).
  23. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE Journal of Visualized Experiments. (193), e65054(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Ultra Y ksek Performansl S v KromatografisiK tle SpektrometresiUPLC Q TOF MSin Bitkisel T bbKalitatif AnalizNumune n lemeVeri lemeKendi Kendine Kurulan Veri TabanAchillea MillefoliumAnti inflamatuar Bile iklerY ntem OptimizasyonuBile ik Tan mlamaKompleks Bile ikler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır