Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم توفير بروتوكول مفصل لتنظيف وإعادة استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائقة المصنوعة من البولي كربونات لإجراء عزل الحويصلة خارج الخلية المناسب لتجارب البروتينات.

Abstract

تؤدي المواد البلاستيكية المختبرية ذات الاستخدام الواحد إلى تفاقم أزمة التلوث وتساهم في التكاليف الاستهلاكية. في عزل الحويصلة خارج الخلية (EV) ، يتم استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائق من البولي كربونات (UC) لتحمل قوى الطرد المركزي العالية المرتبطة بها. تعد بروتينات المركبات الكهربائية مجالا متقدما ولا توجد بروتوكولات إعادة استخدام معتمدة لهذه الأنابيب. تتطلب إعادة استخدام المواد الاستهلاكية لبروتوكولات عزل البروتين منخفضة الإنتاجية والبروتينات النهائية توافق الكاشف مع عمليات الاستحواذ على التحليل الطيفي الكتلي ، مثل عدم وجود تلوث بوليمر اصطناعي مشتق من أنبوب الطرد المركزي ، وإزالة كافية للبروتينات المتبقية.

يصف هذا البروتوكول ويتحقق من صحة طريقة لتنظيف أنابيب UC المصنوعة من البولي كربونات لإعادة استخدامها في تجارب البروتينات EV. تتضمن عملية التنظيف الغمر الفوري لأنابيب UC في H2O لمنع تجفيف البروتين ، والغسيل في منظف كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) بنسبة 0.1٪ ، والشطف في ماء الصنبور الساخن ، والماء منزوع المعادن ، و 70٪ إيثانول. للتحقق من صحة بروتوكول إعادة استخدام أنبوب UC لبروتينات EV النهائية ، تم الحصول على الأنابيب المستخدمة بعد تجربة عزل EVs من أنسجة القلب والأوعية الدموية باستخدام UC التفاضلي وفصل تدرج الكثافة. تم تنظيف الأنابيب وتكررت العملية التجريبية بدون عينات EV التي تقارن أنابيب UC الفارغة التي لم تستخدم مطلقا بأنابيب UC التي تم تنظيفها. تم تحليل الكريات الزائفة التي تم الحصول عليها من إجراءات العزل وتحضيرها لقياس الطيف الكتلي الترادفي اللوني السائل باستخدام مجموعة تحضير عينات البروتين التجارية مع تعديلات لعينات البروتين منخفضة الوفرة.

بعد التنظيف ، تم تقليل عدد البروتينات المحددة بنسبة 98٪ في الحبيبات الزائفة مقابل عينة عزل EV السابقة من نفس الأنبوب. بمقارنة أنبوب نظيف بأنبوب فارغ ، احتوت كلتا العينتين على عدد صغير جدا من البروتينات (≤20) مع تشابه بنسبة 86٪. تم تأكيد عدم وجود قمم البوليمر في كروماتوجرام الأنابيب التي تم تنظيفها. في نهاية المطاف ، فإن التحقق من صحة بروتوكول تنظيف أنبوب UC المناسب لإثراء المركبات الكهربائية سيقلل من النفايات التي تنتجها مختبرات المركبات الكهربائية ويخفض التكاليف التجريبية.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات محددة بطبقة ثنائية الدهون يتم إطلاقها من الخلايا التي تحمل شحنات نشطة بيولوجيا ، مثل البروتين ، وتشارك في العمليات البيولوجية المختلفة ، بما في ذلك التواصل بين الخلايا والخلايا وتشكيل التمعدن البيولوجي1. توجد هذه الجسيمات في جميع سوائل وأنسجة الجسم ، وأنشطتها البيولوجية واستخداماتها هي مجال سريع التطور للبحث العلمي. يمثل عزل هذه الجسيمات النانوية والتحقق من صحتها تحديات مختلفة بسبب صغر حجمها وتشابهها الحيوي مع الجسيمات الأخرى ، مثل الجسيمات الشحمية ومجاميع البروتين. أحدث إرشادات الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية ، الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV2018) ، هي المعيار المعترف به للبحث العلمي EV2.

يجب استخدام طرق مختلفة ، غالبا جنبا إلى جنب ، لعزل المركبات الكهربائية اعتمادا على مصدر المنبع وتطبيقات المصب. اعتبارا من عام 2015 ، كانت طريقة العزل الأولية الأكثر شيوعا للمركبات الكهربائية هي الطرد المركزي التفاضلي (UC) 2. من حيث المبدأ ، يفصل جهاز الطرد المركزي الأولي منخفض السرعة المكونات غير المرغوب فيها الأكبر أو الأكثر كثافة ، مثل الخلايا وحطام الخلايا ، تاركا المركبات الكهربائية في المادة الطافية. بعد ذلك ، تستخدم UC قوة طرد مركزي عالية جدا لإخراج الحبيبات وبالتالي فصل وتنقية المركبات الكهربائية من الجسيمات الأخرى الأصغر أو الأقل كثافة ولكنها قد تحتوي أيضا على جزيئات كثيفة غير EV. غالبا ما تستخدم معظم البروتوكولات ، في خطوة أو أخرى ، UC لعزل المركبات الكهربائية عن السائل3. علاوة على ذلك ، يتم استخدام UC في طرق أخرى لعزل EV ، مثل الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة (DGUC) ، والذي يستخدم وسائط مثل OptiprepTM iodixanol وقوة الطرد المركزي لفصل المركبات الكهربائية وفقا لكثافتها الطافية4. توجد طرق أخرى لعزل المركبات الكهربائية3.

بالنظر إلى الفهم سريع التطور للعمليات البيولوجية التي تمليها المركبات الكهربائية وإمكاناتها كمؤشرات حيوية ومعلومات تتعلق بالفيزيولوجيا المرضية ، اكتسبت التحليلات القائمة على الاكتشاف مثل البروتينات قوة جذب5،6،7،8. EVs صغيرة ، واعتمادا على المصدر ، لديها عائد منخفض من البروتين (<1 ميكروغرام) بالمقارنة مع الأنسجة الكاملة أو تحلل الخلية. يتطلب عزل المركبات الكهربائية لتحليل البروتينات اعتبارات خاصة ، مثل إزالة ملوثات البروتين غير EV من السائل أو الأنسجة الأولية ، والنظر في تدهور بروتين EV أثناء عملية العزل ، واستخدام الطرق التي تخلق محاليل البروتين المتوافقة كيميائيا مع تحضير الببتيد وتحليلات قياس الطيف الكتلي.

غالبا ما تكون المواد الاستهلاكية لمختبر الأبحاث بلاستيكية ويمكن التخلص منها بطبيعتها. تساهم هذه المواد ذات الاستخدام الواحد في أزمة التلوث البلاستيكي العالمية والتكاليف الاستهلاكية. تم تصميم أنابيب UC المتخصصة من البولي كربونات والبوليسترين لتحمل قوى الطرد المركزي العالية المطلوبة لحبيبات المركبات الكهربائية في التطبيقات المختبرية. في حين أنه من الممكن تعقيم وتطهير أنابيب UC لإعادة استخدامها ، فإن التحليل البروتيني ، وخاصة تلك ذات الغلة البروتينية المنخفضة مثل EVs ، يتطلب عناية خاصة. ليس فقط الإزالة الكافية للبروتين المتبقي من الاستخدام السابق أمرا بالغ الأهمية ، بل يجب أيضا مراعاة التوافق الكيميائي مع التحليل الطيفي الكتلي وتلوث البوليمر المشتق من البلاستيك.

نقدم هنا بروتوكول تنظيف لأنابيب البولي كربونات باستخدام المنظفات المناسبة لقياس الطيف الكتلي وإجراء تجارب للتحقق من صحة إزالتها الناجحة للبروتين المتبقي دون حدود الكشف ونقص ملوثات البوليمر التي يمكن اكتشافها. للتحقق من صحة بروتوكول التنظيف للتطبيقات البروتينية EV باستخدام أغراض UC و DGUC ، حصلنا على أنابيب من عزلة EVs لأنسجة الأوعية الدموية البشرية مع بروتوكول UC و DGUC المشترك. تم تنظيف الأنابيب باستخدام البروتوكول الموصوف ، وتكررت العملية التجريبية دون عينات تقارن أنبوب UC فارغ لم يستخدم مطلقا وأنبوب UC الذي تم تنظيفه. في نهاية المطاف ، فإن التحقق من صحة بروتوكول تنظيف أنبوب UC المناسب لتخصيب المركبات الكهربائية سيقلل من النفايات التي تنتجها مختبرات المركبات الكهربائية ويخفض التكلفة المرتبطة بهذه التجارب.

Protocol

1. تنظيف الأنبوب

ملاحظة: يستخدم إجراء عزل EV كلا من أنابيب UC المصنوعة من البولي كربونات المغطاة وغير المغطاة (مفصلة أدناه). تم اتباع نفس الإجراء لكل من الأنابيب المغطاة وغير المغطاة. في حالة الأنابيب المغطاة ، تم تنظيف أجزاء الغطاء بشكل فردي وإعادة تجميعها بعد التجفيف والتخزين المسبق.

  1. بعد الاستخدام الأولي لأنابيب البولي وإزالة العينة ، قم على الفور بغمر أنابيب UC في ماء الصنبور لمنع جفاف العينة إلى جانب الأنبوب.
  2. نقل وغمر الأنابيب في 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) في ماء الصنبور لمدة 10 دقائق.
  3. أنبوب واحد في كل مرة ، صب معظم ، ولكن ليس كل ، محلول SDS من الأنبوب واستخدم قطعة قطن لمسح منطقة الأنبوب تماما حيث توجد حبيبات EV.
    ملاحظة: لا تستخدم أي شيء مع شعيرات. استخدم هذا البروتوكول مسحات قطنية عادية. ومع ذلك ، يمكن استخدام مسحات قطنية متخصصة منخفضة الوبر لتنظيف الأنابيب.
  4. شطف ما لا يقل عن 3x بماء الصنبور الساخن (~ 50 درجة مئوية). تأكد من ملء الأنبوب وصبه بالكامل.
  5. شطف 1x بالماء منزوع المعادن باستخدام زجاجة رذاذ أو زجاجة غسيل ضيقة الفم.
  6. شطف 1x مع 70 ٪ من الإيثانول باستخدام زجاجة رذاذ.
  7. اترك الأنبوب رأسا على عقب حتى يجف.
    ملاحظة: تعمل رفوف الأنبوب لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة بشكل جيد لتجفيف أنابيب UC.
  8. ضع الأنابيب المجففة تماما في وعاء نظيف ؛ هم جاهزون لإعادة الاستخدام.
    ملاحظة: حاليا ، يتم التحقق من صحة البروتوكول لإعادة الاستخدام حتى 2x.

2. تخصيب المركبات الكهربائية

ملاحظة: تم استخدام بروتوكول عزل EV والبروتينات التالي لكل من عزل EV الأصلي للأنسجة ، بالإضافة إلى "العينات الوهمية" المستخدمة للحصول على عينات الأنبوب الفارغة (غير المستخدمة مطلقا) والتنظيف. تم إعادة تعليق العينات الأصلية من المركبات الكهربائية المفخخة بالأنسجة من لويحات الشريان السباتي للمرضى الذين خضعوا لاستئصال باطنة الشريان السباتي. تم جمع العينات الجراحية من شبكة الصحة الجامعية (تورنتو ، كندا) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية. وقدم جميع المرضى موافقة مستنيرة على جمع العينات وتحليل البيانات، وفقا لإعلان هلسنكي. كانت العينات الوهمية عبارة عن كريات زائفة تم الحصول عليها من معالجة الأنابيب الفارغة والنظيفة بنفس الحلول وخطوات المعالجة مثل عينات عزل المركبات الكهربائية.

  1. تذويب عينات EV أو عينات وهمية في برنامج تلفزيوني على الجليد.
  2. اصنع المخزن المؤقت NTE (10 mM Tris-HCl ، 1 mM EDTA ، 0.137 M NaCl pH 7.4) ومرشح معقم.
  3. أدر العينات على حرارة 10000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مفتوح من البولي كربونات سعة 1 مل.
  5. جهاز طرد مركزي طاف عند 100000× جم لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت NTE المصفى المعقم مع مثبط الأنزيم البروتيني.
  7. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل وإضافة العازلة NTE للوصول إلى حجم عينة إجمالي من 1.5 مل.
  8. احتفظ بالعينات على الجليد.

3. تحضير تدرجات الكثافة وفصل تدرج الكثافة

ملاحظة: تم وصف بروتوكول عزل EV هذا مسبقا بواسطة Blaser et al.9 باختصار:

  1. قم بإعداد خمسة محاليل لمتوسط تدرج كثافة اليوديكسانول (10٪ ، 15٪ ، 20٪ ، 25٪ ، و 30٪) مع المخزن المؤقت NTE كمخفف.
  2. ضع محاليل الكثافة الخمسة بالتتابع في أنبوب (أنابيب) الطرد المركزي الفائق المغطاة بنسبة 30٪ في الأسفل و 10٪ في الأعلى.
  3. ثبت الأغطية على الأنبوب (الأنابيب) وانتقل برفق إلى وضع أفقي ثابت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد 1 ساعة ، حرك الأنبوب (الأنابيب) برفق إلى وضع عمودي على الجليد لمدة 30 دقيقة لتبريد التدرج.
  5. أضف 1.5 مل من العينة أو العينة الوهمية (المخزن المؤقت NTE) إلى الجزء العلوي من أنبوب (أنابيب) تدرج الكثافة المحضر.
  6. أنبوب (أنابيب) الطرد المركزي الفائق عند 250000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة الأجزاء العلوية من تدرج الكثافة (2.4 مل) إلى أنبوب (أنابيب) الطرد المركزي الفائق غير المغطاة. املأ حتى 9 مل باستخدام المخزن المؤقت NTE المصفى المعقم.
  8. حبيبات المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100,000 × جم لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ضع دائرة حول موقع حبيبات EV المرئية أو الموقع المتوقع بعلامة. سيسمح لك ذلك بتنظيف منطقة الحبيبات باستخدام المسحة مباشرة.
  9. نضح المادة الطافية أثناء تحريك الأنبوب إلى وضع مقلوب لمدة 3 دقائق. قم بإزالة القطرات المتبقية بقطعة قطن قبل قلب الأنبوب على الجانب الأيمن لأعلى.
  10. أعد تعليق حبيبات EV في 12 ميكرولتر من محلول التحلل في المجموعة المشار إليها.

4. إعداد الببتيد للبروتينات

ملاحظة: تم إجراء تحضير عينة البروتيوميات وفقا لبروتوكول المجموعة مع تعديلات داخلية لعينات البروتين منخفضة الوفرة. البروتوكول المعدل هو كما يلي:

  1. تحلل العينات وتشويهها وتقليلها وألكلتها عن طريق التسخين في محلول التحلل عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. هضم العينات باستخدام محلول هضم Lys-C/trypsin لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية باستخدام 10 ميكرولتر من محلول التحلل من العينة و 10 ميكرولتر من محلول الهضم.
  3. تنقية الببتيدات من خلال خرطوشة عن طريق غسل الملوثات المحبة للماء والكارهة للماء واستخلاص الببتيدات النقية باستخدام محاليل عدة.
  4. جفف الببتيدات المنقى في فراغ سريع على حرارة 45 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة أو حتى يجف.
    ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الببتيدات.
  5. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى وقت تسلسل قياس الطيف الكتلي.
  6. أضف 17 ميكرولتر من محلول تحميل LC إلى الببتيدات المجففة.
  7. اترك العينات على الجليد لمدة 1 ساعة.
  8. دوامة العينات لفترة وجيزة ثم صوتنة في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق.
  9. أجهزة الطرد المركزي عينات تحميل LC في 16000 × غرام لمدة 1 دقيقة ، نضح 15 ميكرولتر من الأعلى ، وفصلها في أنبوب جديد.

5. الكروماتوغرافيا السائلة وتسلسل قياس الطيف الكتلي الترادفي

  1. حقن 2 ميكرولتر من محلول الببتيد تحميل LC على مطياف الكتلة.
  2. تجزئة الببتيدات باستخدام إعداد ثنائي العمود.
  3. سخني العمود عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 45 درجة مئوية.
  4. قم بتشغيل التدرج التحليلي عند 300 nL / min من 5٪ إلى 21٪ Solvent B (الأسيتونيتريل / 0.1٪ حمض الفورميك) لمدة 60 دقيقة ، متبوعا ب 10 دقائق من 21٪ إلى 30٪ من المذيب B ، و 10 دقائق أخرى من غسل بانوراما 95٪ -5٪.
  5. اضبط دقة MS1 إلى 120 K (الحد الأقصى لوقت الحقن ، 25 مللي ثانية) ، وأخضع أيونات السلائف العلوية (خلال دورة 3.0 ثانية) لعرض عزل HCD 1.2 م / ض ، وتمكين الاستبعاد الديناميكي (60 ثانية) ، واضبط دقة MS2 على 60 كلفن (الحد الأقصى لوقت الحقن ، تلقائي ؛ طاقة الاصطدام الطبيعية ، 24٪ ، 26٪ ، و 28٪).
  6. اضبط نطاق اكتساب MS1 و MS2 على 400 م / ض - 1200 م / ض و 120 م / ض - 1200 م / ض ، على التوالي.

6. تحديد الببتيد / البروتين

  1. ابحث في أطياف الببتيد المكتسبة باستخدام برنامج بحث بروتيني باستخدام خوارزمية بحث تجارية مقابل قاعدة بيانات uniProt بشرية.
  2. اضبط إنزيم الهضم على التربسين واترك ما يصل إلى شقين مفقودين.
  3. اضبط تفاوت السلائف على 10 جزء في المليون ونافذة تفاوت الأجزاء على 0.02 دا.
  4. تعيين أكسدة الميثيونين وأستلة N-terminal كتعديلات متغيرة وكارباميدو ميثيل السيستين كتعديل ثابت.
  5. قم بتصفية الببتيدات بناء على عتبة معدل اكتشاف خاطئ (FDR) تبلغ 1.0٪ كما تم حسابها بواسطة خوارزمية Percolator.
  6. ضع في اعتبارك فقط الببتيدات المخصصة لمجموعة بروتين معينة ولم يتم اكتشافها في أي مجموعة بروتين أخرى على أنها فريدة من نوعها واستخدمها لمزيد من التحليلات.
  7. قم بتضمين ما لا يقل عن اثنين من الببتيدات الفريدة لكل بروتين في التحليلات.
  8. تعظيم المعرفات مع الكشف عن أيون السلائف.
  9. قم بإجراء محاذاة كروماتوغرافية مع أقصى تحول لوقت الاحتفاظ يبلغ 10 دقائق ، وتحمل الكتلة يبلغ 10 جزء في المليون ، وإشارة إلى ضوضاء بحد أدنى 5.
  10. تطبيع وفرة الببتيد بإجمالي كمية الببتيد.

النتائج

للتحقق من صحة بروتوكول التنظيف (الشكل 1) ، تم إجراء تجربتين. أولا ، تمت مقارنة بروتين "العينة الوهمية" من الأنبوب النظيف ببروتين عينة EV النسيجية من الاستخدام الأولي للأنبوب لتحديد ترحيل البروتينات المحددة. تظهر الكروماتوجرام التمثيلية انخفاضا في ذروة عدم التجانس بعد تنظيف ...

Discussion

هنا نصف ونتحقق من صحة بروتوكول لتنظيف أنابيب UC المصنوعة من البولي كربونات لتخصيب المركبات الكهربائية والتطبيقات البروتينية. لقد أظهرنا الإزالة الناجحة للبروتين المتبقي من عينة أنبوب UC السابقة مقارنة بتحليل الحبيبات الزائفة النظيفة تحت حد الكشف عن بروتوكول اكتساب قياس الطيف الكتلي هذا ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بمنحة بحثية من منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01HL147095 و R01HL141917 و R01HL136431 وشركة Kowa Ltd. وبرنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 101023041 (R. Cahalane). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.com. تم تطوير بروتوكول التنظيف الحالي عن طريق تعديل بروتوكول تنظيف الأنبوب الموصى به المقدم في يوم التعليم للجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). شكرا جزيلا للدكتورة كاثرين هاو والدكتورة سنيها راجو من شبكة الصحة الجامعية (جامعة تورنتو ، كندا) على عينات EV الأصلية للأنسجة السباتية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate TubeBeckman Coulter Life Sciences355630uncapped ultracentrifuge tube(s) 
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap AssemblyBeckman Coulter Life Sciences355603capped ultracentrifuge tube(s) 
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mmThermoFisher Scientific164946 and ES902Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton HeadVWR89031-270cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.  ThermoFisher ScientificBRE725533Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)NANAHuman database
MilliQ waterwater
PreOmics iST kit  PreOmicsP.O.00027commercial protein sample preparation kit 
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)ThermoFisher ScientificNAProteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm NANASearch algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)Boston BioProductsBM-230detergent

References

  1. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  2. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  3. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  4. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, e854347 (2018).
  5. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).
  6. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  7. Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles. Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273 (2022).
  8. van Herwijnen, M. J. C., et al. Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).
  9. Blaser, M. C., et al. Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis. Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).
  10. Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic. PLOS ONE. 10 (5), e0122419 (2015).
  11. Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter Available from: https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles (2014)
  12. Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).
  13. Schittek, B., et al. Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands. Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).
  14. Blaydon, D. C., et al. Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion. American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).
  15. Henry, J., et al. Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes. FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).
  16. Bolling, M. C., et al. Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations. The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).
  17. Jin, S., et al. DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis. Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).
  18. Gläser, R., et al. The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption. Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).
  19. Molhave, L., et al. House dust in seven Danish offices. Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).
  20. Buschow, S. I., et al. MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis. Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved