細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用

要約

ポリカーボネート超遠心チューブを洗浄および再利用して、プロテオミクス実験に適した細胞外小胞分離を行うための詳細なプロトコルが提供されています。

要約

使い捨ての実験用プラスチックは、汚染の危機を悪化させ、消耗品のコストの一因となります。細胞外小胞(EV)の単離では、ポリカーボネート製の超遠心分離機(UC)チューブを使用して、関連する高い遠心力に耐えます。EVプロテオミクスは進歩的な分野であり、これらのチューブの検証済みの再利用プロトコルが不足しています。低収率のタンパク質単離プロトコルやダウンストリームプロテオミクスに消耗品を再利用するには、遠心チューブ由来の合成ポリマー汚染がなく、残留タンパク質を十分に除去するなど、質量分析法による取得と試薬の適合性が必要です。

このプロトコルは、EVプロテオミクス実験で再利用するためにポリカーボネートUCチューブを洗浄する方法を記述し、検証します。洗浄プロセスでは、タンパク質の乾燥を防ぐためにUCチューブをH₂Oに直ちに浸し、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤で洗浄し、熱い水道水、脱塩水、および70%エタノールですすいでください。下流のEVプロテオミクスに対するUCチューブの再利用プロトコルを検証するために、UCと密度勾配分離の差を用いて心血管組織からEVを単離する実験を行った後、使用済みのチューブを入手しました。チューブを洗浄し、実験プロセスをEVサンプルなしで繰り返し、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較しました。単離手順から得られた疑似EVペレットを溶解し、少量のタンパク質サンプル用に修正した市販のタンパク質サンプル調製キットを使用して、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析用に調製しました。

洗浄後、疑似ペレットで同定されたタンパク質の数は、同じチューブからの以前のEV分離サンプルと比較して98%減少しました。洗浄したチューブとブランクチューブを比較したところ、両方のサンプルにごく少数のタンパク質(≤20)が含まれ、86%の類似性がありました。洗浄したチューブのクロマトグラムにポリマーのピークがないことを確認しました。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、実験コストが削減されます。

概要

細胞外小胞(EV)は、タンパク質などの生物学的に活性な貨物を運ぶ細胞から放出される脂質二重層で区切られた粒子であり、細胞間コミュニケーションや生物学的石灰化の形成など、さまざまな生物学的プロセスに関与しています¹。これらの粒子はすべての体液や組織に見られ、その生物学的活性と用途は急速に進化している科学研究分野です。これらのナノ粒子の単離と検証は、サイズが小さく、リポソームやタンパク質凝集体などの他の粒子との生物学的類似性のために、さまざまな課題を提示します。最新の国際細胞外小胞学会のガイドラインである Minimal information for studies of cellular sifles 2018 (MISEV2018) は、EV 科学研究の基準として認められています².

EVの絶縁には、アップストリームのソースとダウンストリームのアプリケーションに応じて、さまざまな方法を併用する必要があります。2015年現在、EVの最も一般的な一次分離方法は示差超遠心分離(UC)²でした。原理的には、最初の低速遠心分離では、細胞や細胞の破片など、より大きく、より密度の高い不要な成分が分離され、EVは上清に残ります。その後、UCは非常に高い遠心力を使用してEVをペレット化し、より小さいまたは密度が低いが、高密度の非EV粒子を含む可能性の....

プロトコル

1.チューブのクリーニング

注:EVの分離手順では、キャップ付きとキャップなしの両方のポリカーボネートUCチューブを使用します(詳細は以下を参照)。キャップ付きチューブとキャップなしチューブの両方で同じ手順に従いました。キャップ付きチューブの場合、蓋の部品は個別に洗浄され、乾燥および事前保管後に再組み立てされました。

1. ポリカーボネートチューブを最初に使用し、サンプルを取り除いた後、すぐにUCチューブを水道水に浸して、サンプルがチューブの側面に乾燥しないようにします。
2. チューブを0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に移し、水道水に10分間浸します。
3. 一度に1本のチューブで、チューブからSDS溶液のほとんど(すべてではない)をデカントし、綿棒を使用してEVペレットが配置されていたチューブの領域を完全に拭きます。
   注意: 毛のあるものは使用しないでください。このプロトコルでは、通常の綿棒を使用しました。ただし、チューブの洗浄には、特殊な糸くずの少ない綿棒を使用できます。
4. 熱い水道水(~50°C)で少なくとも3回すすいでください。チューブを完全に充填してデカントしてください。
5. スプレーボトルまたは狭口洗浄ボトルを使用して、脱塩水で1回すすぎます。
6. スプレーボトルを使用して、70%エタノールで1回すすぎます。
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ディスカッション

ここでは、EV濃縮およびプロテオミクスアプリケーション用のポリカーボネートUCチューブを洗浄するためのプロトコルについて説明し、検証します。この質量分析取得プロトコルの検出限界を下回る洗浄された疑似ペレット分析と比較して、以前のUCチューブサンプルからの残留タンパク質の除去に成功したことを実証し、洗浄されたUCチューブ疑似ペレットと比較して、ブランクの未使用UC.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent