Повторное использование поликарбонатной ультрацентрифужной пробирки в протеомном анализе внеклеточных везикул

Резюме

Предоставляется подробный протокол очистки и повторного использования поликарбонатных ультрацентрифужных пробирок для проведения внеклеточной изоляции везикул, подходящей для экспериментов по протеомике.

Аннотация

Одноразовый лабораторный пластик усугубляет кризис загрязнения и увеличивает расходы на расходные материалы. При выделении внеклеточных везикул (EV) используются поликарбонатные ультрацентрифужные (UC) трубки, выдерживающие связанные с этим высокие центробежные силы. Протеомика электромобилей является развивающейся областью, и проверенные протоколы повторного использования для этих трубок отсутствуют. Повторное использование расходных материалов для протоколов выделения белков с низким выходом и последующей протеомики требует совместимости реагентов с масс-спектроскопией, например, отсутствия загрязнения синтетическим полимером, полученным из центрифужных пробирок, и достаточного удаления остаточных белков.

Этот протокол описывает и проверяет метод очистки поликарбонатных трубок UC для повторного использования в экспериментах по протеомике EV. Процесс очистки включает в себя немедленное погружение трубок UC в_H2Oдля предотвращения высыхания белка, промывку в моющем средстве с 0,1% додецилсульфатом натрия (SDS), промывку в горячей водопроводной воде, деминерализованной воде и 70% этаноле. Для валидации протокола повторного использования пробирок UC для последующей протеомики EV были получены использованные пробирки после эксперимента по выделению EV из сердечно-сосудистой ткани с использованием дифференциального разделения UC и градиента плотности. Трубки были очищены, и экспериментальный процесс был повторен без образцов EV, сравнивая пустые, никогда не использовавшиеся трубки UC с очищенными трубками UC. Гранулы псевдо-EV, полученные в результате процедур выделения, лизировали и подготавливали для жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии с использованием коммерческого набора для пробоподготовки белков с модификациями для образцов белков с низкой численностью.

После очистки количество идентифицированных белков в псевдогрануле было уменьшено на 98% по сравнению с предыдущим образцом выделения EV из той же пробирки. Сравнивая очищенную пробирку с пустой пробиркой, оба образца содержали очень небольшое количество белков (≤20) со сходством 86%. Подтверждено отсутствие полимерных пиков в хроматограммах очищенных пробирок. В конечном счете, валидация протокола очистки трубок UC, подходящего для обогащения электромобилей, сократит количество отходов, производимых лабораториями электромобилей, и снизит затраты на эксперименты.

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой частицы, ограниченные липидами-бислой, высвобождаемые из клеток, которые несут биологически активный груз, такой как белок, и участвуют в различных биологических процессах, включая межклеточную коммуникацию и образование биологической^{минерализации.} Эти частицы содержатся во всех жидкостях и тканях организма, а их биологическая активность и использование являются быстро развивающейся областью научных исследований. Выделение и валидация этих наночастиц сопряжены с различными проблемами из-за их небольшого размера и биосходства с другими частицами, такими как липосомы и белковые агрегаты. Самые последние рекомендации Международного общества внеклеточных везикул «Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул 2018» (MISEV2018) являются признанным стандартом^{научных исследований} ВВ.

Для изоляции электромобилей необходимо использовать различные методы, часто в тандеме, в зависимости от восходящего источника и последующих приложений. По состоянию на 2015 год наиболее распространенным методом первичной изоляции электромобилей было дифференциальное ультрацентрифугирование (UC)². В принципе, начальное центрифугирование на более низкой скорости отделяет более крупные или более плотные нежелательные компоненты, такие как клетки и клеточный мусор, оставляя EV в надосадочной жидкости. Впоследствии UC использует очень высокую центробежную силу для удаления и, таким образом, отделения и очистки EV от других частиц, которые меньше или менее плотные, но которые также могут содержать плотные частицы, не относящиеся к EV. Большинство протоколов часто используют, на том или ином этапе, UC, чтобы изолировать электромобили от жидкости³. Кроме того, UC используется в других методах изоляции EV, таких как ультрацентрифугирование с градиентом плотности (DGUC), в котором используются такие среды, как йодиксанол Optiprep^TM и центробежная сила, для разделения EV в соответствии с их плавучей плотностью⁴. Существуют и другие методы изоляции ВВ³.

Учитывая быстро развивающееся понимание биологических процессов, продиктованных ВВ, и их потенциала в качестве биомаркеров и информации о патофизиологии, анализы, основанные на открытиях, такие как протеомика, набирают обороты 5,6,7,8. ВВ имеют небольшие размеры и, в зависимости от источника, имеют низкий выход белка (<1 мкг) по сравнению с лизатом цельной ткани или клетки. Выделение ВВ для протеомного анализа требует особых соображений, таких как удаление загрязняющих белков, не относящихся к ВВ, из предшествующей жидкости или ткани, рассмотрение деградации белка ВВ в процессе выделения и использование методов, которые создают белковые растворы, химически совместимые с пептидным препаратом и масс-спектрометрическим анализом.

Расходные материалы для исследовательских лабораторий часто являются пластиковыми и одноразовыми по своей природе. Эти одноразовые материалы способствуют глобальному кризису загрязнения пластиком и расходным материалам. Специализированные трубки из поликарбоната и полистирола UC предназначены для того, чтобы выдерживать высокие центробежные силы, необходимые для гранулирования электромобилей в лабораторных условиях. Хотя можно стерилизовать и дезинфицировать пробирки с ЯК для повторного использования, протеомный анализ, особенно с низким выходом белка, такой как EV, требует особого внимания. Мало того, что достаточное удаление остаточного белка из предыдущего использования имеет первостепенное значение, также необходимо учитывать химическую совместимость с масс-спектроскопией и загрязнение полимерами, полученными из пластика.

Здесь мы представляем протокол очистки поликарбонатных трубок с использованием моющих средств, подходящих для масс-спектрометрии, и проводим эксперименты для подтверждения успешного удаления остаточного белка ниже пределов обнаружения и отсутствия обнаруживаемых полимерных загрязнителей. Для валидации протокола очистки для протеомных применений EV с использованием как UC, так и DGUC мы получили пробирки из изоляций EV сосудистой ткани человека с комбинированным протоколом UC и DGUC. Пробирки очищали с использованием описанного протокола, и экспериментальный процесс повторяли без образцов, сравнивая пустую, никогда не использовавшуюся пробирку с ЯК и очищенную пробирку ЯК. В конечном счете, валидация протокола очистки трубок UC, подходящего для обогащения электромобилей, сократит отходы, производимые лабораториями электромобилей, и снизит затраты, связанные с такими экспериментами.

протокол

1. Чистка трубок

ПРИМЕЧАНИЕ: В процедуре изоляции EV используются как закрытые, так и незакрытые поликарбонатные трубки UC (подробнее ниже). Одна и та же процедура применялась как для закрытых, так и для незакрытых пробирок. В случае закрытых пробирок части крышки очищались по отдельности и собирались после сушки и предварительного хранения.

1. После первоначального использования поликарбонатных трубок и извлечения образца немедленно погрузите пробирки UC в водопроводную воду, чтобы предотвратить высыхание образца сбоку от пробирки.
2. Перенести и погрузить трубки в 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) в водопроводную воду на 10 мин.
3. По одной пробирке за раз сцедите большинство, но не весь раствор SDS из пробирки и с помощью ватного тампона тщательно протрите область пробирки, где находилась гранула EV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте ничего со щетиной. В этом протоколе использовались обычные ватные палочки; однако для очистки трубок можно использовать специальные ватные палочки с низким ворсом.
4. Смойте не менее 3 раз горячей водой из-под крана (~50 °C). Обязательно полностью наполните и сцедите тюбик.
5. Промойте 1x деминерализованной водой с помощью пульверизатора или бутылки для мытья с узким горлышком.
6. Промойте 1x 70% этанолом с помощью пульверизатора.
7. Оставьте тюбик вверх дном для высыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штативы для пробирок для сортировки флуоресцентно-активированных клеток хорошо подходят для сушки пробирок UC.
8. Поместите полностью высохшие тюбики в чистую банку; Они готовы к повторному использованию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время протокол проверен для повторного использования до 2 раз.

2. Обогащение электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол выделения ВВ и протеомики был использован как для выделения исходной тканевой ВВ, так и для «фиктивных образцов», используемых для получения пустых (никогда не использовавшихся) и очищенных образцов пробирок. Исходные образцы представляли собой ресуспендированные тканевые ВВ из каротидных бляшек пациентов, перенесших каротидную эндартерэктомию. Хирургические образцы были собраны в Университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада) и одобрены институциональным комитетом по этике. Все пациенты дали информированное согласие на сбор образцов и анализ данных в соответствии с Хельсинкской декларацией. Фиктивные образцы представляли собой псевдогранулы, полученные при обработке пустых и очищенных пробирок теми же растворами и стадиями обработки, что и изоляционные образцы EV.

1. Размораживание образцов EV или имитация образцов в PBS на льду.
2. Сделайте NTE-буфер (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, 0,137 М NaCl pH 7,4) и стерильный фильтр.
3. Прокрутите образцы при 10 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
4. Поместите надосадочную жидкость в поликарбонатную трубку с открытым верхом объемом 1 мл.
5. Центрифугировать надосадочную жидкость при 100 000× г в течение 1 ч при 4°С.
6. Ресуспендировать гранулу в 150 мкл стерильно отфильтрованного NTE-буфера с ингибитором протеазы.
7. Переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте буфер NTE, чтобы общий объем образца составил 1,5 мл.
8. Держите образцы на льду.

3. Подготовка градиентов плотности и разделение градиентов плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол изоляции электромобиля ранее был описан Blaser et ^al.9 Вкратце:

1. Приготовьте пять растворов йодиксаноловой градиентной среды плотности (10%, 15%, 20%, 25% и 30%) с NTE-буфером в качестве разбавителя.
2. Последовательно выложите пять растворов плотности в пробирку (пробирки) ультрацентрифуги с крышкой, 30% внизу и 10% сверху.
3. Закрепите крышки на тюбике (пробирках) и осторожно переместите в устойчивое горизонтальное положение на 1 ч при комнатной температуре.
4. Через 1 час осторожно переместите трубку (трубки) в вертикальное положение на льду на 30 минут, чтобы охладить градиент.
5. Добавьте 1,5 мл образца или макета образца (буфера NTE) в верхнюю часть подготовленной пробирки (пробирок) с градиентом плотности.
6. Ультрацентрифужная пробирка (пробирки) при 250 000 × г в течение 40 мин при 4 °C.
7. Удалите верхние фракции градиента плотности (2,4 мл) в незакрытую ультрацентрифужную пробирку (пробирки). Наполните до 9 мл стерильно отфильтрованным NTE-буфером.
8. Гранулируйте электромобили ультрацентрифугированием при 100 000 × г в течение 1 ч при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обведите маркером местоположение видимой гранулы EV или ожидаемое местоположение. Это позволит очистить область гранулы непосредственно тампоном.
9. Аспирируйте надосадочную жидкость, перемещая трубку в перевернутое положение в течение 3 минут. Удалите оставшиеся капли ватным тампоном, а затем переверните трубку лицевой стороной вверх.
10. Ресуспендируйте гранулу EV в 12 мкл лизисного буфера в указанном наборе.

4. Пептидный препарат для протеомики

ПРИМЕЧАНИЕ: Протеомная пробоподготовка проводилась по протоколу набора с собственными модификациями для образцов белков с низкой численностью. Измененный протокол выглядит следующим образом:

1. Лизировать, денатурировать, восстанавливать и алкилировать образцы путем нагревания в лизисовом буфере при 95 °C в течение 10 мин.
2. Расщепляют образцы с использованием раствора для расщепления Lys-C/трипсина в течение 2 ч при 37 °C, используя 10 мкл раствора лизиса из образца и 10 мкл раствора для расщепления.
3. Очищайте пептиды через картридж, вымывая гидрофильные и гидрофобные загрязнители и элюируя очищенные пептиды с помощью растворов наборов.
4. Очищенные пептиды высушить в скоростном вакууме при 45 °C в течение 45 мин или до полного высыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пересушивания пептидов.
5. Храните образцы при температуре -80 °C до момента масс-спектрометрического секвенирования.
6. К высушенным пептидам добавить 17 μл раствора LC-нагрузки.
7. Оставьте образцы на льду на 1 час.
8. Кратковременно обработайте образцы вихрем, а затем произведите ультразвуковую обработку на ультразвуковой водяной бане в течение 5 минут.
9. Центрифугируйте образцы с нагрузкой LC при 16 000 × г в течение 1 мин, отаскайте 15 μл сверху и отделите в новую пробирку.

5. Жидкостная хроматография и тандемное масс-спектрометрическое секвенирование

1. Введите 2 мкл раствора пептида с нагрузкой LC на масс-спектрометр.
2. Фракционируйте пептиды с помощью двухколоночной установки.
3. Нагрейте колонну при постоянной температуре 45 °C.
4. Запустите аналитический градиент при 300 нл/мин от 5% до 21% растворителя B (ацетонитрил/0,1% муравьиной кислоты) в течение 60 мин, затем 10 мин 21%-30% растворителя B и еще 10 мин промывки лобзика 95%-5%.
5. Установите разрешение MS1 на 120 K (максимальное время инжекции 25 мс), поместите верхние ионы-предшественники (в течение цикла 3,0 с) на ширину изоляции HCD 1,2 м/z, динамическое исключение включено (60 с) и установите разрешение MS2 на 60 K (максимальное время впрыска, автоматически; нормализованная энергия столкновения, 24%, 26% и 28%).
6. Установите диапазон сбора данных MS1 и MS2 на 400 м/з-1 200 м/з и 120 м/з-1 200 м/з соответственно.

6. Идентификация пептидов/белков

1. Поиск полученных пептидных спектров с помощью протеомного поискового программного обеспечения с использованием коммерческого алгоритма поиска по базе данных uniProt человека.
2. Установите фермент пищеварения на трипсин и допустите до двух пропущенных расщеплений.
3. Установите допуск прекурсора на 10 ppm, а окно допуска фрагментов на 0,02 Да.
4. Установить окисление метионина и N-концевое ацетилирование как вариабельные модификации, а цистеина карбамидметилирование как фиксированную модификацию.
5. Фильтруйте пептиды на основе порогового значения частоты ложных обнаружений (FDR), равного 1,0%, рассчитанного алгоритмом Percolator.
6. Рассматривайте только пептиды, отнесенные к одной данной группе белков и не обнаруженные ни в одной другой группе белков, как уникальные, и используйте их для дальнейшего анализа.
7. Включайте в анализы как минимум два уникальных пептида для каждого белка.
8. Максимальное использование идентификаторов с помощью обнаружения ионов-прекурсоров.
9. Выполняйте хроматографическое выравнивание с максимальным сдвигом времени удержания 10 мин, допуском по массе 10 ppm и минимальным соотношением сигнал/шум 5.
10. Нормализуйте содержание пептидов по общему количеству пептидов.

Результаты

Для проверки протокола очистки (рис. 1) было проведено два эксперимента. Во-первых, протеом «фиктивного образца» из очищенной пробирки сравнивали с протеомом тканевого образца EV при первоначальном использовании пробирки, чтобы определить перенос идентифицированных бе?...

Обсуждение

Здесь мы описываем и проверяем протокол очистки поликарбонатных трубок UC для обогащения электромобилей и протеомных приложений. Мы продемонстрировали успешное удаление остаточного белка из предыдущего образца пробирки с ЯК по сравнению с анализом очищенных псевдогранул ниже предел...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent