Réutilisation du tube ultracentrifuge en polycarbonate dans les analyses protéomiques de vésicules extracellulaires

Résumé

Un protocole détaillé est fourni pour le nettoyage et la réutilisation des tubes à ultracentrifuger en polycarbonate afin d’effectuer l’isolement des vésicules extracellulaires adapté aux expériences de protéomique.

Résumé

Les plastiques de laboratoire à usage unique exacerbent la crise de la pollution et contribuent aux coûts des consommables. Dans l’isolement des vésicules extracellulaires (VE), des tubes d’ultracentrifugation (UC) en polycarbonate sont utilisés pour supporter les forces centrifuges élevées associées. La protéomique des VE est un domaine en plein essor et il n’existe pas de protocoles de réutilisation validés pour ces tubes. La réutilisation des consommables pour les protocoles d’isolement de protéines à faible rendement et la protéomique en aval nécessite une compatibilité des réactifs avec les acquisitions par spectroscopie de masse, telles que l’absence de contamination par des polymères synthétiques dérivés du tube de centrifugation et l’élimination suffisante des protéines résiduelles.

Ce protocole décrit et valide une méthode de nettoyage des tubes UC en polycarbonate pour les réutiliser dans des expériences de protéomique EV. Le processus de nettoyage implique l’immersion immédiate des tubes UC dans_H2O pour éviter le dessèchement des protéines, le lavage avec un détergent à 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), le rinçage à l’eau chaude du robinet, à l’eau déminéralisée et à 70 % d’éthanol. Pour valider le protocole de réutilisation des tubes UC pour la protéomique des VE en aval, des tubes usagés ont été obtenus à la suite d’une expérience isolant les VE du tissu cardiovasculaire en utilisant la CU différentielle et la séparation par gradient de densité. Les tubes ont été nettoyés et le processus expérimental a été répété sans échantillons EV, comparant des tubes UC vierges jamais utilisés à des tubes UC nettoyés. Les pastilles de pseudo-EV obtenues par les procédures d’isolement ont été lysées et préparées pour la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à l’aide d’un kit commercial de préparation d’échantillons de protéines avec des modifications pour les échantillons de protéines de faible abondance.

Après le nettoyage, le nombre de protéines identifiées a été réduit de 98 % dans la pseudo-pastille par rapport à l’échantillon d’isolement EV précédent du même tube. En comparant un tube nettoyé à un tube vierge, les deux échantillons contenaient un très petit nombre de protéines (≤20) avec une similitude de 86%. L’absence de pics de polymères dans les chromatogrammes des tubes nettoyés a été confirmée. À terme, la validation d’un protocole de nettoyage des tubes UC adapté à l’enrichissement des VE permettra de réduire les déchets produits par les laboratoires de VE et de diminuer les coûts expérimentaux.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules délimitées par des bicouches lipidiques libérées par des cellules qui transportent des marchandises biologiquement actives, telles que des protéines, et participent à divers processus biologiques, y compris la communication cellule-cellule et la formation de minéralisation biologique¹. Ces particules se trouvent dans tous les fluides et tissus corporels, et leurs activités et utilisations biologiques constituent un domaine de recherche scientifique en évolution rapide. L’isolement et la validation de ces nanoparticules présentent divers défis en raison de leur petite taille et de leur bios....

Protocole

1. Nettoyage des tubes

REMARQUE : La procédure d’isolation EV utilise des tubes UC en polycarbonate coiffés et non bouchés (détaillés ci-dessous). La même procédure a été suivie pour les tubes bouchés et non bouchés. Dans le cas des tubes bouchés, les pièces du couvercle ont été nettoyées individuellement et remontées après le séchage et le pré-stockage.

1. Après la première utilisation des tubes en polycarbonate et le retrait de l’échantillon, immergez immédiatement les tubes UC dans l’eau du robinet pour éviter le dessèchement de l’échantillon sur le côté du tube.
2. Transvaser et immerger les tubes dans du ....

Discussion

Ici, nous décrivons et validons un protocole de nettoyage des tubes UC en polycarbonate pour les applications d’enrichissement et de protéomique des VE. Nous avons démontré l’élimination réussie de la protéine résiduelle de l’échantillon de tube UC précédent par rapport à une analyse de pseudo-pastilles nettoyées en dessous de la limite de détection de ce protocole d’acquisition par spectrométrie de masse et montré la similitude protéomique d’un tube UC vierge jamais utilisé par rapport aux ps.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent