Réutilisation du tube ultracentrifuge en polycarbonate dans les analyses protéomiques de vésicules extracellulaires

Résumé

Un protocole détaillé est fourni pour le nettoyage et la réutilisation des tubes à ultracentrifuger en polycarbonate afin d’effectuer l’isolement des vésicules extracellulaires adapté aux expériences de protéomique.

Résumé

Les plastiques de laboratoire à usage unique exacerbent la crise de la pollution et contribuent aux coûts des consommables. Dans l’isolement des vésicules extracellulaires (VE), des tubes d’ultracentrifugation (UC) en polycarbonate sont utilisés pour supporter les forces centrifuges élevées associées. La protéomique des VE est un domaine en plein essor et il n’existe pas de protocoles de réutilisation validés pour ces tubes. La réutilisation des consommables pour les protocoles d’isolement de protéines à faible rendement et la protéomique en aval nécessite une compatibilité des réactifs avec les acquisitions par spectroscopie de masse, telles que l’absence de contamination par des polymères synthétiques dérivés du tube de centrifugation et l’élimination suffisante des protéines résiduelles.

Ce protocole décrit et valide une méthode de nettoyage des tubes UC en polycarbonate pour les réutiliser dans des expériences de protéomique EV. Le processus de nettoyage implique l’immersion immédiate des tubes UC dans_H2O pour éviter le dessèchement des protéines, le lavage avec un détergent à 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), le rinçage à l’eau chaude du robinet, à l’eau déminéralisée et à 70 % d’éthanol. Pour valider le protocole de réutilisation des tubes UC pour la protéomique des VE en aval, des tubes usagés ont été obtenus à la suite d’une expérience isolant les VE du tissu cardiovasculaire en utilisant la CU différentielle et la séparation par gradient de densité. Les tubes ont été nettoyés et le processus expérimental a été répété sans échantillons EV, comparant des tubes UC vierges jamais utilisés à des tubes UC nettoyés. Les pastilles de pseudo-EV obtenues par les procédures d’isolement ont été lysées et préparées pour la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à l’aide d’un kit commercial de préparation d’échantillons de protéines avec des modifications pour les échantillons de protéines de faible abondance.

Après le nettoyage, le nombre de protéines identifiées a été réduit de 98 % dans la pseudo-pastille par rapport à l’échantillon d’isolement EV précédent du même tube. En comparant un tube nettoyé à un tube vierge, les deux échantillons contenaient un très petit nombre de protéines (≤20) avec une similitude de 86%. L’absence de pics de polymères dans les chromatogrammes des tubes nettoyés a été confirmée. À terme, la validation d’un protocole de nettoyage des tubes UC adapté à l’enrichissement des VE permettra de réduire les déchets produits par les laboratoires de VE et de diminuer les coûts expérimentaux.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules délimitées par des bicouches lipidiques libérées par des cellules qui transportent des marchandises biologiquement actives, telles que des protéines, et participent à divers processus biologiques, y compris la communication cellule-cellule et la formation de minéralisation biologique¹. Ces particules se trouvent dans tous les fluides et tissus corporels, et leurs activités et utilisations biologiques constituent un domaine de recherche scientifique en évolution rapide. L’isolement et la validation de ces nanoparticules présentent divers défis en raison de leur petite taille et de leur biosimilarité avec d’autres particules, telles que les liposomes et les agrégats de protéines. Les directives les plus récentes de l’International Society of Extracellular Vescles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), sont la norme reconnue pour la recherche scientifique sur les^VE2.

Différentes méthodes, souvent en tandem, doivent être utilisées pour l’isolation des véhicules électriques en fonction de la source en amont et des applications en aval. En 2015, la méthode d’isolement primaire la plus courante pour les VE était l’ultracentrifugation ^{différentielle} (UC)2. En principe, la centrifugation initiale à basse vitesse sépare les composants indésirables plus gros ou plus denses, tels que les cellules et les débris cellulaires, laissant les VE dans le surnageant. Par la suite, la CU utilise une force centrifuge très élevée pour extraire les granulés et ainsi séparer et purifier les VE des autres particules plus petites ou moins denses mais qui peuvent également contenir des particules denses non VE. La plupart des protocoles utilisent souvent, à une étape ou à une autre, la CU pour isoler les VE d’un fluide³. De plus, l’UC est utilisé dans d’autres méthodes d’isolation des VE, telles que l’ultracentrifugation à gradient de densité (DGUC), qui utilise des milieux tels que l’iodixanol Optiprep^TM et la force centrifuge pour séparer les VE en fonction de leur densité flottante⁴. Il existe d’autres méthodes d’isolation des véhicules électriques³.

Compte tenu de l’évolution rapide de la compréhension des processus biologiques dictés par les VE et de leur potentiel en tant que biomarqueurs et informations concernant la physiopathologie, les analyses basées sur la découverte telles que la protéomique ont gagné du terrain 5,6,7,8. Les VE sont petites et, selon la source, ont un faible rendement en protéines (<1 μg) par rapport au lysat de tissu entier ou de cellule. L’isolement des VE pour l’analyse protéomique nécessite des considérations particulières, telles que l’élimination des contaminants protéiques non VE des liquides ou des tissus en amont, la prise en compte de la dégradation des protéines VE pendant le processus d’isolement et l’utilisation de méthodes qui créent des solutions protéiques chimiquement compatibles avec la préparation de peptides et les analyses par spectrométrie de masse.

Les consommables de laboratoire de recherche sont souvent en plastique et jetables par nature. Ces matériaux à usage unique contribuent à la crise mondiale de la pollution plastique et aux coûts des consommables. Les tubes UC spécialisés en polycarbonate et en polystyrène sont conçus pour résister aux forces centrifuges élevées requises pour granuler les VE dans les applications de laboratoire. Bien qu’il soit possible de stériliser et de désinfecter les tubes UC pour les réutiliser, l’analyse protéomique, en particulier celles à faible rendement en protéines telles que les VE, nécessite une attention particulière. Non seulement l’élimination suffisante des protéines résiduelles de l’utilisation précédente est primordiale, mais la compatibilité chimique avec la spectroscopie de masse et la contamination par des polymères dérivés du plastique doit également être prise en compte.

Nous présentons ici un protocole de nettoyage de tubes en polycarbonate à l’aide de détergents adaptés à la spectrométrie de masse et effectuons des expériences pour valider son élimination réussie des protéines résiduelles en dessous des limites de détection et de l’absence de contaminants polymères détectables. Pour valider le protocole de nettoyage pour les applications protéomiques des VE à l’aide des objectifs UC et DGUC, nous avons obtenu des tubes à partir d’isolements de VE de tissus vasculaires humains avec un protocole combiné UC et DGUC. Les tubes ont été nettoyés à l’aide du protocole décrit, et le processus expérimental a été répété sans que des échantillons ne comparent un tube UC vierge jamais utilisé et un tube UC nettoyé. À terme, la validation d’un protocole de nettoyage des tubes UC adapté à l’enrichissement des VE permettra de réduire les déchets produits par les laboratoires de VE et de diminuer le coût associé à de telles expériences.

Protocole

1. Nettoyage des tubes

REMARQUE : La procédure d’isolation EV utilise des tubes UC en polycarbonate coiffés et non bouchés (détaillés ci-dessous). La même procédure a été suivie pour les tubes bouchés et non bouchés. Dans le cas des tubes bouchés, les pièces du couvercle ont été nettoyées individuellement et remontées après le séchage et le pré-stockage.

1. Après la première utilisation des tubes en polycarbonate et le retrait de l’échantillon, immergez immédiatement les tubes UC dans l’eau du robinet pour éviter le dessèchement de l’échantillon sur le côté du tube.
2. Transvaser et immerger les tubes dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 % dans l’eau du robinet pendant 10 min.
3. Un tube à la fois, décantez la plupart, mais pas la totalité, de la solution SDS du tube et utilisez un coton-tige pour essuyer soigneusement la zone du tube où se trouvait la pastille EV.
   REMARQUE : N’utilisez rien avec des poils. Ce protocole utilisait des cotons-tiges normaux ; Cependant, des cotons-tiges spécialisés à faible peluche peuvent être utilisés pour nettoyer les tubes.
4. Rincez au moins 3 fois à l’eau chaude du robinet (~50 °C). Assurez-vous de remplir et de décanter complètement le tube.
5. Rincer 1x à l’eau déminéralisée à l’aide d’un flacon pulvérisateur ou d’un flacon de lavage à col étroit.
6. Rincer 1 fois avec de l’éthanol à 70% à l’aide d’un flacon pulvérisateur.
7. Laissez sécher le tube à l’envers.
   REMARQUE : Les portoirs de tubes pour le tri des cellules activées par fluorescence fonctionnent bien pour le séchage des tubes UC.
8. Placez les tubes complètement séchés dans un bocal propre ; Ils sont prêts à être réutilisés.
   REMARQUE : Actuellement, le protocole est validé pour une réutilisation jusqu’à 2 fois.

2. Enrichissement des VE

REMARQUE : Le protocole d’isolement et de protéomique EV suivant a été utilisé pour l’isolement tissulaire original de l’EV, ainsi que pour les « échantillons fictifs » utilisés pour obtenir les échantillons vierges (jamais utilisés) et les échantillons en tube nettoyés. Les échantillons originaux étaient des VE piégés dans les tissus en suspension à partir de plaques carotidiennes de patients ayant subi des endartériectomies carotidiennes. Les échantillons chirurgicaux ont été prélevés auprès du Réseau universitaire de santé (Toronto, Canada) et ont été approuvés par le comité d’éthique de l’établissement. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé pour la collecte d’échantillons et l’analyse des données, conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les échantillons fictifs étaient des pseudo-pastilles obtenues en traitant des tubes vierges et nettoyés avec les mêmes solutions et étapes de traitement que les échantillons d’isolement EV.

1. Dégivrer des échantillons EV ou des échantillons simulés dans PBS sur glace.
2. Préparez un tampon NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) et un filtre stérile.
3. Faites tourner les échantillons à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
4. Placez le surnageant dans un tube en polycarbonate ouvert de 1 ml.
5. Centrifuger le surnageant à 100 000× g pendant 1 h à 4 °C.
6. Remettre la pastille en suspension dans 150 μL de tampon NTE stérile filtré avec inhibiteur de protéase.
7. Transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et ajouter un tampon NTE pour atteindre un volume total d’échantillon de 1,5 mL.
8. Conservez les échantillons sur de la glace.

3. Préparation des gradients de densité et de la séparation des gradients de densité

REMARQUE : Ce protocole d’isolement des VE a déjà été décrit par Blaser et ^al.9 En bref :

1. Préparez cinq solutions de milieu à gradient de densité d’iodixanol (10 %, 15 %, 20 %, 25 % et 30 %) avec un tampon NTE comme diluant.
2. Superposez les solutions à cinq densités séquentiellement dans un ou plusieurs tubes d’ultracentrifugation bouchés avec 30 % en bas et 10 % en haut.
3. Fixez les capuchons sur le(s) tube(s) et déplacez-vous doucement vers une position horizontale stable pendant 1 h à température ambiante.
4. Après 1 h, déplacez doucement le(s) tube(s) en position verticale sur la glace pendant 30 min pour refroidir la pente.
5. Ajouter 1,5 mL de l’échantillon ou de l’échantillon fictif (tampon NTE) dans le haut du ou des tubes à gradient de densité préparés.
6. Tube(s) ultracentrifuge(s) à 250 000 × g pendant 40 min à 4 °C.
7. Retirer les fractions supérieures du gradient de densité (2,4 mL) dans le(s) tube(s) d’ultracentrifugation non bouché(s). Remplir à 9 mL avec un tampon NTE filtré stérilement.
8. Granuler les VE par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C.
   REMARQUE : Encerclez l’emplacement de la pastille EV visible ou l’emplacement prévu avec un marqueur. Cela vous permettra de nettoyer directement la zone du granulé avec l’écouvillon.
9. Aspirer le surnageant tout en déplaçant le tube à l’envers pendant 3 min. Retirez les gouttelettes restantes à l’aide d’un coton-tige avant de retourner le tube à l’endroit.
10. Remettre en suspension la pastille EV dans 12 μL de tampon de lyse dans le kit référencé.

4. Préparation peptidique pour la protéomique

REMARQUE : La préparation des échantillons de protéomique a été effectuée selon le protocole du kit avec des modifications internes pour les échantillons de protéines de faible abondance. Le protocole modifié est le suivant :

1. Lyser, dénaturer, réduire et alkyler les échantillons en les chauffant dans un tampon de lyse à 95 °C pendant 10 min.
2. Digérer les échantillons à l’aide de la solution de digestion de Lys-C/trypsine pendant 2 h à 37 °C en utilisant 10 μL de solution de lyse de l’échantillon et 10 μL de solution de digestion.
3. Purifiez les peptides à l’aide d’une cartouche en éliminant les contaminants hydrophiles et hydrophobes et en éluant les peptides purifiés à l’aide de solutions de kit.
4. Faites sécher les peptides purifiés dans un vide rapide à 45 °C pendant 45 min ou jusqu’à ce qu’ils soient secs.
   REMARQUE : Évitez le séchage excessif des peptides.
5. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’au moment du séquençage par spectrométrie de masse.
6. Ajouter 17 μL de solution de charge LC aux peptides séchés.
7. Laissez les échantillons sur de la glace pendant 1 h.
8. Agitez brièvement les échantillons, puis sonifiez-les dans un bain d’eau à ultrasons pendant 5 min.
9. Centrifuger les échantillons à charge LC à 16 000 × g pendant 1 min, aspirer 15 μL par le haut et les séparer dans un nouveau tube.

5. Chromatographie liquide et séquençage par spectrométrie de masse en tandem

1. Injecter 2 μL de solution peptidique à charge LC dans un spectromètre de masse.
2. Fractionnez les peptides à l’aide d’une configuration à deux colonnes.
3. Chauffez la colonne à une température constante de 45 °C.
4. Exécutez le gradient analytique à 300 nL/min de 5 % à 21 % de solvant B (acétonitrile/acide formique à 0,1 %) pendant 60 min, suivi de 10 min de solvant B à 21 % à 30 % et de 10 min supplémentaires d’un lavage à la scie sauteuse à 95 % à 5 %.
5. Réglez le MS1 sur une résolution de 120 K (temps d’injection maximum, 25 ms), soumettez les ions précurseurs supérieurs (dans un temps de cycle de 3,0 s) à une largeur d’isolement HCD de 1,2 m/z, exclusion dynamique activée (60 s), et réglez la résolution MS2 sur 60 K (temps d’injection maximum, automatique ; énergie de collision normalisée, 24 %, 26 % et 28 %).
6. Réglez les plages d’acquisition MS1 et MS2 sur 400 m/z-1 200 m/z et 120 m/z-1 200 m/z, respectivement.

6. Identification des peptides/protéines

1. Rechercher les spectres peptidiques acquis à l’aide d’un logiciel de recherche protéomique à l’aide d’un algorithme de recherche commerciale dans une base de données uniProt humaine.
2. Réglez l’enzyme de digestion sur la trypsine et laissez jusqu’à deux clivages manqués.
3. Définissez la tolérance du précurseur sur 10 ppm et la fenêtre de tolérance du fragment sur 0,02 Da.
4. Définir l’oxydation de la méthionine et l’acétylation N-terminale comme des modifications variables et la carbamidométhylation de la cystéine comme modification fixe.
5. Filtrez les peptides en fonction d’un seuil de taux de fausses découvertes (FDR) de 1,0 %, tel que calculé par l’algorithme Percolator.
6. Ne considérez comme uniques que les peptides attribués à un groupe de protéines donné et qui n’ont été détectés dans aucun autre groupe de protéines et utilisez-les pour des analyses plus approfondies.
7. N’incluez qu’un minimum de deux peptides uniques pour chaque protéine dans les analyses.
8. Maximisez les ID grâce à la détection des ions précurseurs.
9. Effectuez un alignement chromatographique avec un décalage maximal du temps de rétention de 10 min, une tolérance de masse de 10 ppm et un minimum signal/bruit de 5.
10. Normalisez l’abondance des peptides par la quantité totale de peptides.

Résultats

Pour valider le protocole de nettoyage (Figure 1), deux expériences ont été réalisées. Tout d’abord, le protéome de l’échantillon fictif du tube nettoyé a été comparé au protéome de l’échantillon tissulaire EV de l’utilisation initiale du tube afin de déterminer le transfert des protéines identifiées. Les chromatogrammes représentatifs montrent une réduction de l’hétérogénéité des pics après nettoyage des tubes (Figure 2). Dans ...

Discussion

Ici, nous décrivons et validons un protocole de nettoyage des tubes UC en polycarbonate pour les applications d’enrichissement et de protéomique des VE. Nous avons démontré l’élimination réussie de la protéine résiduelle de l’échantillon de tube UC précédent par rapport à une analyse de pseudo-pastilles nettoyées en dessous de la limite de détection de ce protocole d’acquisition par spectrométrie de masse et montré la similitude protéomique d’un tube UC vierge jamais utilisé par rapport aux ps...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent