Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares

Resumo

Um protocolo detalhado é fornecido para limpeza e reutilização de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar o isolamento de vesículas extracelulares adequado para experimentos proteômicos.

Resumo

Os plásticos de laboratório de uso único exacerbam a crise de poluição e contribuem para os custos de consumíveis. No isolamento de vesículas extracelulares (EV), tubos de ultracentrífuga (UC) de policarbonato são usados para suportar as altas forças centrífugas associadas. A proteômica EV é um campo avançado e faltam protocolos de reutilização validados para esses tubos. A reutilização de consumíveis para protocolos de isolamento de proteínas de baixo rendimento e proteômica downstream requer compatibilidade de reagentes com aquisições de espectroscopia de massa, como a ausência de contaminação de polímeros sintéticos derivados de tubos de centrífuga e remoção suficiente de proteínas residuais.

Este protocolo descreve e valida um método para limpeza de tubos de policarbonato UC para reutilização em experimentos de proteômica EV. O processo de limpeza envolve a submersão imediata dos tubos UC em H₂O para evitar a secagem da proteína, lavagem em detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1%, enxágue em água quente da torneira, água desmineralizada e etanol 70%. Para validar o protocolo de reutilização do tubo UC para proteômica EV a jusante, os tubos usados foram obtidos após um experimento isolando EVs do tecido cardiovascular usando UC diferencial e separação de gradiente de densidade. Os tubos foram limpos e o processo experimental foi repetido sem amostras de EV, comparando tubos UC nunca usados em branco com tubos UC limpos. Os pellets pseudo-EV obtidos dos procedimentos de isolamento foram lisados e preparados para cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem usando um kit comercial de preparação de amostras de proteínas com modificações para amostras de proteínas de baixa abundância.

Após a limpeza, o número de proteínas identificadas foi reduzido em 98% no pseudo-pellet em comparação com a amostra de isolamento EV anterior do mesmo tubo. Comparando um tubo limpo com um tubo em branco, ambas as amostras continham um número muito pequeno de proteínas (≤20) com 86% de similaridade. A ausência de picos de polímero nos cromatogramas dos tubos limpos foi confirmada. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá os custos experimentais.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas delimitadas por bicamadas lipídicas liberadas de células que carregam cargas biologicamente ativas, como proteínas, e participam de vários processos biológicos, incluindo a comunicação célula-célula e a formação de mineralização biológica¹. Essas partículas são encontradas em todos os fluidos e tecidos corporais, e suas atividades e usos biológicos são um campo de pesquisa científica em rápida evolução. O isolamento e a validação dessas nanopartículas apresentam vários desafios devido ao seu pequeno tamanho e biossimilaridade com outras partículas, como lipossomas e agregados proteicos. As diretr....

Protocolo

1. Limpeza do tubo

NOTA: O procedimento de isolamento EV usa tubos UC de policarbonato com e sem tampa (detalhados abaixo). O mesmo procedimento foi seguido para tubos tampados e não tampados. No caso de tubos tampados, as partes da tampa foram limpas individualmente e remontadas após a secagem e pré-armazenamento.

1. Após o uso inicial dos tubos de policarbonato e a remoção da amostra, mergulhe imediatamente os tubos UC em água da torneira para evitar o ressecamento da amostra na lateral do tubo.
2. Transfira e submerja os tubos em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% em água da torneira por 10 min.

Discussão

Aqui descrevemos e validamos um protocolo para limpeza de tubos de policarbonato UC para enriquecimento EV e aplicações proteômicas. Demonstramos a remoção bem-sucedida da proteína residual da amostra anterior do tubo UC em comparação com uma análise de pseudo-pellet limpo abaixo do limite de detecção deste protocolo de aquisição de espectrometria de massa e mostramos a semelhança proteômica do tubo UC nunca usado em branco em comparação com os pseudo pellets de tubo UC limpos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent