Reutilização de Tubo de Ultracentrífuga de Policarbonato em Análises Proteômicas de Vesículas Extracelulares

Resumo

Um protocolo detalhado é fornecido para limpeza e reutilização de tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar o isolamento de vesículas extracelulares adequado para experimentos proteômicos.

Resumo

Os plásticos de laboratório de uso único exacerbam a crise de poluição e contribuem para os custos de consumíveis. No isolamento de vesículas extracelulares (EV), tubos de ultracentrífuga (UC) de policarbonato são usados para suportar as altas forças centrífugas associadas. A proteômica EV é um campo avançado e faltam protocolos de reutilização validados para esses tubos. A reutilização de consumíveis para protocolos de isolamento de proteínas de baixo rendimento e proteômica downstream requer compatibilidade de reagentes com aquisições de espectroscopia de massa, como a ausência de contaminação de polímeros sintéticos derivados de tubos de centrífuga e remoção suficiente de proteínas residuais.

Este protocolo descreve e valida um método para limpeza de tubos de policarbonato UC para reutilização em experimentos de proteômica EV. O processo de limpeza envolve a submersão imediata dos tubos UC em H₂O para evitar a secagem da proteína, lavagem em detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1%, enxágue em água quente da torneira, água desmineralizada e etanol 70%. Para validar o protocolo de reutilização do tubo UC para proteômica EV a jusante, os tubos usados foram obtidos após um experimento isolando EVs do tecido cardiovascular usando UC diferencial e separação de gradiente de densidade. Os tubos foram limpos e o processo experimental foi repetido sem amostras de EV, comparando tubos UC nunca usados em branco com tubos UC limpos. Os pellets pseudo-EV obtidos dos procedimentos de isolamento foram lisados e preparados para cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem usando um kit comercial de preparação de amostras de proteínas com modificações para amostras de proteínas de baixa abundância.

Após a limpeza, o número de proteínas identificadas foi reduzido em 98% no pseudo-pellet em comparação com a amostra de isolamento EV anterior do mesmo tubo. Comparando um tubo limpo com um tubo em branco, ambas as amostras continham um número muito pequeno de proteínas (≤20) com 86% de similaridade. A ausência de picos de polímero nos cromatogramas dos tubos limpos foi confirmada. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá os custos experimentais.

Introdução

As vesículas extracelulares (EVs) são partículas delimitadas por bicamadas lipídicas liberadas de células que carregam cargas biologicamente ativas, como proteínas, e participam de vários processos biológicos, incluindo a comunicação célula-célula e a formação de mineralização biológica¹. Essas partículas são encontradas em todos os fluidos e tecidos corporais, e suas atividades e usos biológicos são um campo de pesquisa científica em rápida evolução. O isolamento e a validação dessas nanopartículas apresentam vários desafios devido ao seu pequeno tamanho e biossimilaridade com outras partículas, como lipossomas e agregados proteicos. As diretrizes mais recentes da Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares, Informações mínimas para estudos de vesículas extracelulares 2018 (MISEV2018), são o padrão reconhecido para pesquisa científica EV².

Vários métodos, geralmente em conjunto, devem ser usados para isolamento de EV, dependendo da fonte upstream e das aplicações downstream. A partir de 2015, o método de isolamento primário mais comum para EVs foi a ultracentrifugação diferencial (UC)². Em princípio, a centrifugação inicial de baixa velocidade separa componentes indesejados maiores ou mais densos, como células e detritos celulares, deixando EVs no sobrenadante. Posteriormente, a UC usa uma força centrífuga muito alta para expulsar e, assim, separar e purificar EVs de outras partículas menores ou menos densas, mas que também podem conter partículas densas não EV. A maioria dos protocolos costuma usar, em uma etapa ou outra, UC para isolar EVs de um fluido³. Além disso, o UC é usado em outros métodos de isolamento de EV, como a ultracentrifugação de gradiente de densidade (DGUC), que usa meios como Optiprep^TM iodixanol e força centrífuga para separar EVs de acordo com sua densidade flutuante⁴. Existem outros métodos de isolamento EV³.

Considerando a compreensão em rápida evolução dos processos biológicos ditados pelas EVs e seu potencial como biomarcadores e informações sobre fisiopatologia, análises baseadas em descobertas, como proteômica, ganharam força 5,6,7,8. Os EVs são pequenos e, dependendo da fonte, têm baixo rendimento de proteína (<1 μg) quando comparados ao tecido total ou lisado celular. O isolamento de EVs para análise proteômica requer considerações especiais, como a remoção de contaminantes de proteínas não EV de líquidos ou tecidos a montante, a consideração da degradação da proteína EV durante o processo de isolamento e a utilização de métodos que criam soluções proteicas quimicamente compatíveis com a preparação de peptídeos e análises de espectrometria de massa.

Os consumíveis de laboratório de pesquisa geralmente são de plástico e descartáveis por natureza. Esses materiais de uso único contribuem para a crise global de poluição plástica e custos de consumíveis. Os tubos UC especializados de policarbonato e poliestireno são projetados para suportar as altas forças centrífugas necessárias para pellets EVs em aplicações de laboratório. Embora seja possível esterilizar e desinfetar tubos de UC para reutilização, a análise proteômica, especialmente aquelas de baixo rendimento de proteína, como EVs, requer atenção especial. Não apenas a remoção suficiente de proteína residual do uso anterior é fundamental, mas também deve ser considerada a compatibilidade química com espectroscopia de massa e contaminação por polímeros derivados de plástico.

Aqui apresentamos um protocolo de limpeza de tubos de policarbonato usando detergentes adequados para espectrometria de massas e realizamos experimentos para validar sua remoção bem-sucedida de proteína residual abaixo dos limites de detecção e falta de contaminantes poliméricos detectáveis. Para validar o protocolo de limpeza para aplicações proteômicas de EV usando os propósitos de UC e DGUC, obtivemos tubos de isolamentos de EVs de tecido de vasculatura humana com um protocolo combinado de UC e DGUC. Os tubos foram limpos usando o protocolo descrito, e o processo experimental foi repetido sem amostras comparando um tubo UC nunca usado em branco e um tubo UC limpo. Em última análise, a validação de um protocolo de limpeza de tubos UC adequado para o enriquecimento de EVs reduzirá os resíduos produzidos pelos laboratórios de EV e diminuirá o custo associado a tais experimentos.

Protocolo

1. Limpeza do tubo

NOTA: O procedimento de isolamento EV usa tubos UC de policarbonato com e sem tampa (detalhados abaixo). O mesmo procedimento foi seguido para tubos tampados e não tampados. No caso de tubos tampados, as partes da tampa foram limpas individualmente e remontadas após a secagem e pré-armazenamento.

1. Após o uso inicial dos tubos de policarbonato e a remoção da amostra, mergulhe imediatamente os tubos UC em água da torneira para evitar o ressecamento da amostra na lateral do tubo.
2. Transfira e submerja os tubos em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% em água da torneira por 10 min.
3. Um tubo de cada vez, transvase a maior parte, mas não toda, da solução SDS do tubo e use um cotonete para limpar completamente a área do tubo onde o pellet EV estava localizado.
   NOTA: Não use nada com cerdas. Este protocolo usou cotonetes normais; no entanto, cotonetes especializados e de baixa emissão de fiapos podem ser usados para limpar os tubos.
4. Enxágue pelo menos 3x com água quente da torneira (~ 50 °C). Certifique-se de encher e decantar completamente o tubo.
5. Enxágüe 1x com água desmineralizada usando um borrifador ou um frasco de lavagem de boca estreita.
6. Enxágue 1x com etanol a 70% usando um borrifador.
7. Deixe o tubo de cabeça para baixo para secar.
   NOTA: Os racks de tubos para classificação de células ativadas por fluorescência funcionam bem para secar os tubos UC.
8. Coloque os tubos completamente secos em uma jarra limpa; eles estão prontos para reutilização.
   NOTA: Atualmente, o protocolo é validado para reutilização em até 2x.

2. Enriquecimento de EV

NOTA: O seguinte protocolo de isolamento EV e proteômica foi usado tanto para o isolamento EV do tecido original, quanto para as "amostras simuladas" usadas para obter as amostras de tubo em branco (nunca usadas) e limpas. As amostras originais foram EVs ressuspensas aprisionadas em tecido de placas carotídeas de pacientes submetidos a endarterectomias carotídeas. As peças cirúrgicas foram coletadas na University Health Network (Toronto, Canadá) e aprovadas pelo comitê de ética institucional. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a coleta de amostras e análise dos dados, de acordo com a Declaração de Helsinque. As amostras simuladas foram pseudo-pellets obtidos do tratamento de tubos em branco e limpos com as mesmas soluções e etapas de processamento das amostras de isolamento EV.

1. Descongele amostras EV ou amostras simuladas em PBS no gelo.
2. Faça tampão NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) e filtro estéril.
3. Centrifugar as amostras a 10 000 × g durante 10 min a 4 °C.
4. Mova o sobrenadante para um tubo de policarbonato aberto de 1 mL.
5. Centrifugar o sobrenadante a 100.000× g durante 1 h a 4 °C.
6. Ressuspenda o pellet em 150 μL de tampão NTE filtrado estéril com inibidor de protease.
7. Transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione tampão NTE para atingir um volume total de amostra de 1,5 mL.
8. Mantenha as amostras no gelo.

3. Preparação de gradientes de densidade e separação de gradientes de densidade

NOTA: Este protocolo de isolamento EV foi descrito anteriormente por Blaser et ^al.9 Em resumo:

1. Prepare cinco soluções de meio de gradiente de densidade de iodixanol (10%, 15%, 20%, 25% e 30%) com tampão NTE como diluente.
2. Colocar as soluções de cinco densidades sequencialmente no(s) tubo(s) de ultracentrífuga tampado(s) com 30% na parte inferior e 10% na parte superior.
3. Fixe as tampas no(s) tubo(s) e mova-as suavemente para uma posição horizontal estável durante 1 h à temperatura ambiente.
4. Após 1 h, mova o(s) tubo(s) suavemente para a posição vertical no gelo por 30 min para esfriar o gradiente.
5. Adicione 1,5 mL da amostra ou amostra simulada (tampão NTE) ao topo do(s) tubo(s) de gradiente de densidade preparado(s).
6. Tubo(s) de ultracentrífuga a 250.000 × g durante 40 min a 4 °C.
7. Remova as frações superiores do gradiente de densidade (2.4 mL) para o(s) tubo(s) de ultracentrífuga destampado(s). Encha até 9 mL com tampão NTE filtrado estéril.
8. Pulverizar os EVs por ultracentrifugação a 100.000 × g por 1 h a 4 °C.
   NOTA: Circule a localização do pellet EV visível ou a localização esperada com um marcador. Isso permitirá que você limpe a área do pellet diretamente com o cotonete.
9. Aspire o sobrenadante enquanto move o tubo para uma posição de cabeça para baixo por 3 min. Remova as gotículas restantes com um cotonete antes de virar o tubo para cima.
10. Ressuspenda o pellet EV em 12 μL de tampão de lise no kit referenciado.

4. Preparação de peptídeos para proteômica

NOTA: A preparação da amostra proteômica foi realizada de acordo com o protocolo do kit com modificações internas para amostras de proteína de baixa abundância. O protocolo modificado é o seguinte:

1. Lise, desnature, reduza e alquile as amostras aquecendo em tampão de lise a 95 °C por 10 min.
2. Digerir as amostras utilizando a solução de digestão de Lis-C/tripsina durante 2 h a 37 °C, utilizando 10 μl de solução de lise da amostra e 10 μl da solução de digestão.
3. Purifique os peptídeos através de um cartucho, lavando os contaminantes hidrofílicos e hidrofóbicos e eluindo os peptídeos purificados usando soluções de kit.
4. Seque os peptídeos purificados em vácuo rápido a 45 °C por 45 min ou até secar.
   NOTA: Evite o ressecamento dos peptídeos.
5. Armazenar amostras a -80 °C até ao momento da sequenciação por espectrometria de massa.
6. Adicione 17 μL de solução de carga LC aos peptídeos secos.
7. Deixe as amostras no gelo por 1 h.
8. Vortex as amostras brevemente e depois sonicar em banho-maria ultrassônico por 5 min.
9. Centrifugue as amostras de carga LC a 16.000 × g por 1 min, aspire 15 μL do topo e separe em um novo tubo.

5. Cromatografia líquida e sequenciamento por espectrometria de massa em tandem

1. Injectar 2 μL de solução de peptídeo de carga LC num espectrómetro de massas.
2. Fracione os peptídeos usando uma configuração de coluna dupla.
3. Aquecer a coluna a uma temperatura constante de 45 °C.
4. Execute o gradiente analítico a 300 nL/min de 5% a 21% de Solvente B (acetonitrila/0,1% de ácido fórmico) por 60 min, seguido por 10 min de 21% a 30% de Solvente B e outros 10 min de uma lavagem de quebra-cabeça de 95% a 5%.
5. Defina o MS1 para resolução de 120 K (tempo máximo de injeção, 25 ms), sujeite os principais íons precursores (dentro de um tempo de ciclo de 3.0 s) para largura de isolamento HCD de 1.2 m/z, exclusão dinâmica habilitada (60 s) e defina a resolução MS2 para 60 K (tempo máximo de injeção, automático; energia de colisão normalizada, 24%, 26% e 28%).
6. Defina a faixa de aquisição MS1 e MS2 para 400 m/z-1.200 m/z e 120 m/z-1.200 m/z, respectivamente.

6. Identificação de peptídeos/proteínas

1. Pesquise os espectros de peptídeos adquiridos com um software de pesquisa proteômica usando um algoritmo de pesquisa comercial em um banco de dados uniProt humano.
2. Defina a enzima de digestão para tripsina e permita até duas clivagens perdidas.
3. Defina a tolerância do precursor como 10 ppm e a janela de tolerância do fragmento como 0,02 Da.
4. Defina a oxidação da metionina e a acetilação N-terminal como modificações variáveis e a cisteína carbamidometilação como modificação fixa.
5. Filtre os peptídeos com base em um limite de taxa de descoberta falsa (FDR) de 1,0%, conforme calculado pelo algoritmo Percolator.
6. Considere apenas os peptídeos atribuídos a um determinado grupo de proteínas e não detectados em nenhum outro grupo de proteínas como únicos e use-os para análises adicionais.
7. Incluir apenas um mínimo de dois peptídeos únicos para cada proteína nas análises.
8. Maximize os IDs com a detecção de íons precursores.
9. Realize o alinhamento cromatográfico com uma mudança máxima de tempo de retenção de 10 min, tolerância de massa de 10 ppm e mínimo de 5 relação sinal-ruído.
10. Normalize a abundância de peptídeos pela quantidade total de peptídeos.

Resultados

Para validar o protocolo de limpeza (Figura 1), foram realizados dois experimentos. Primeiro, o proteoma da "amostra simulada" do tubo limpo foi comparado com o proteoma da amostra EV do tecido do uso inicial do tubo para determinar o transporte de proteínas identificadas. Os cromatogramas representativos mostram uma redução no pico de heterogeneidade após a limpeza dos tubos (Figura 2). No isolamento EV original, 806 proteínas foram identificadas com dois ...

Discussão

Aqui descrevemos e validamos um protocolo para limpeza de tubos de policarbonato UC para enriquecimento EV e aplicações proteômicas. Demonstramos a remoção bem-sucedida da proteína residual da amostra anterior do tubo UC em comparação com uma análise de pseudo-pellet limpo abaixo do limite de detecção deste protocolo de aquisição de espectrometria de massa e mostramos a semelhança proteômica do tubo UC nunca usado em branco em comparação com os pseudo pellets de tubo UC limpos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent