폴리카보네이트 초원심분리기 튜브는 세포외 소포체의 단백질체 분석에 재사용됩니다.

요약

단백질체학 실험에 적합한 세포외 소포체 분리를 수행하기 위해 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브를 세척하고 재사용하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

초록

일회용 실험실 플라스틱은 오염 위기를 악화시키고 소비 비용에 기여합니다. 세포외 소포체(EV) 분리에서는 폴리카보네이트 초원심분리기(UC) 튜브를 사용하여 관련된 높은 원심력을 견뎌냅니다. EV 단백질체학은 발전하는 분야이며 이러한 튜브에 대한 검증된 재사용 프로토콜이 부족합니다. 저수율 단백질 분리 프로토콜 및 다운스트림 단백질체학에 소모품을 재사용하려면 원심분리기 튜브 유래 합성 고분자 오염이 없고 잔류 단백질이 충분히 제거되는 등 질량 분광법 획득과의 시약 호환성이 필요합니다.

이 프로토콜은 EV 단백질체학 실험에서 재사용하기 위해 폴리카보네이트 UC 튜브를 세척하는 방법을 설명하고 검증합니다. 세척 과정에는 단백질 건조를 방지하기 위해 UC 튜브를 H₂O에 즉시 담그고, 0.1 % 도데 실 황산 나트륨 (SDS) 세제로 세척하고, 뜨거운 수돗물, 탈염수 및 70 % 에탄올로 헹구는 작업이 포함됩니다. 다운스트림 EV 단백질체학을 위한 UC 튜브 재사용 프로토콜을 검증하기 위해 차등 UC 및 밀도 구배 분리를 사용하여 심혈관 조직에서 EV를 분리하는 실험에 따라 사용된 튜브를 얻었습니다. 튜브를 세척하고 EV 샘플 없이 실험 과정을 반복하여 사용하지 않은 빈 UC 튜브와 세척된 UC 튜브를 비교했습니다. 분리 절차에서 얻은 유사 EV 펠릿을 용해하고 저농도 단백질 샘플에 대한 변형이 있는 상용 단백질 샘플 준비 키트를 사용하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법을 위해 준비했습니다.

세척 후, 동일한 튜브의 이전 EV 분리 샘플에 비해 유사 펠릿에서 식별된 단백질의 수가 98% 감소했습니다. 세척된 튜브와 빈 튜브를 비교한 결과, 두 샘플 모두 86%의 유사성을 가진 매우 적은 수의 단백질(≤20)을 함유하고 있었습니다. 세척된 튜브의 크로마토그램에 폴리머 피크가 없음이 확인되었습니다. 궁극적으로, EV의 농축에 적합한 UC 튜브 세척 프로토콜의 검증은 EV 실험실에서 발생하는 폐기물을 줄이고 실험 비용을 낮출 것입니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 단백질과 같은 생물학적 활성 화물을 운반하는 세포에서 방출되는 지질-이중층으로 구분된 입자로, 세포 간 통신 및 생물학적 광물화 형성을 포함한 다양한 생물학적 과정에 참여합니다¹. 이러한 입자는 모든 체액과 조직에서 발견되며 생물학적 활동과 용도는 과학 연구에서 빠르게 발전하는 분야입니다. 이러한 나노 입자의 분리 및 검증은 크기가 작고 리포솜 및 단백질 응집체와 같은 다른 입자와의 생물학적 유사성으로 인해 다양한 문제를 야기합니다. 가장 최근의 국제세포외소포학회(International Society of Extracellular Vesicles) 가이드라인인 2018년 세포외소포체(Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018, MISEV2018)는 전기차 과학 연구에서 인정받는 표준이다².

EV 절연을 위해 종종 동시에 다양한 방법을 사용해야 하며, 이는 업스트림 소스와 다운스트림 애플리케이션에 따라 다릅니다. 2015년 현재 EV의 가장 일반적인 1차 절연 방법은 차동 초원심분리(UC)²입니다. 원칙적으로 초기 저속 원심분리는 세포 및 세포 파편과 같은 더 크거나 밀도가 높은 원치 않는 구성 요소를 분리하여 상층액에 EV를 남깁니다. 그 후, UC는 매우 높은 원심력을 사용하여 펠릿을 배출하여 더 작거나 밀도가 낮지만 밀도가 높은 비 EV 입자를 포함할 수 있는 다른 입자로부터 EV를 분리하고 정제합니다. 대부분의 프로토콜은 종종 한 단계 또는 다른 단계에서 UC를 사용하여 유체³에서 EV를 격리합니다. 또한, UC는 Optiprep^TM 요오드릭사놀 및 원심력과 같은 매체를 사용하여 부력^밀도에 따라 EV를 분리하는 밀도 구배 초원심분리(DGUC)와 같은 다른 EV 분리 방법에도 사용됩니다4. 다른 EV 절연 방법이 존재한다³.

EV에 의해 지시되는 생물학적 과정과 바이오마커로서의 잠재력 및 병태생리학에 관한 정보에 대한 이해가 빠르게 발전함에 따라 단백질체학(proteomics)과 같은 발견 기반 분석이 견인력을 얻고 있습니다 5,6,7,8. EV는 크기가 작으며 공급원에 따라 전체 조직 또는 세포 용해물에 비해 단백질 수율(<1μg)이 낮습니다. 단백질체학 분석을 위한 EV 분리에는 업스트림 액체 또는 조직에서 비 EV 단백질 오염 물질 제거, 분리 공정 중 EV 단백질 분해 고려, 펩타이드 준비 및 질량 분석 분석과 화학적으로 호환되는 단백질 솔루션을 만드는 방법의 활용과 같은 특별한 고려 사항이 필요합니다.

연구 실험실 소모품은 종종 플라스틱이며 본질적으로 일회용입니다. 이러한 일회용 재료는 전 세계 플라스틱 오염 위기와 소모품 비용에 기여합니다. 특수 폴리카보네이트 및 폴리스티렌 UC 튜브는 실험실 응용 분야에서 EV를 펠릿하는 데 필요한 높은 원심력을 견디도록 설계되었습니다. UC 튜브를 멸균 및 소독하여 재사용할 수 있지만, 단백질체학 분석, 특히 EV와 같이 단백질 수율이 낮은 단백질 분석에는 특별한 주의가 필요합니다. 이전 사용에서 잔류 단백질을 충분히 제거하는 것이 가장 중요할 뿐만 아니라 질량 분광법과의 화학적 호환성 및 플라스틱 유래 폴리머 오염도 고려해야 합니다.

여기에서는 질량 분석에 적합한 세제를 사용하는 폴리카보네이트 튜브의 세척 프로토콜을 제시하고 검출 한계 이하의 잔류 단백질을 성공적으로 제거하고 검출 가능한 폴리머 오염 물질이 없는지 검증하기 위한 실험을 수행합니다. UC 및 DGUC 목적을 모두 사용하여 EV 단백질체 응용 분야에 대한 세척 프로토콜을 검증하기 위해 UC 및 DGUC 프로토콜이 결합된 인간 혈관 조직 EV의 분리에서 튜브를 얻었습니다. 튜브는 설명된 프로토콜을 사용하여 세척하고, 한 번도 사용하지 않은 빈 UC 튜브와 세척된 UC 튜브를 비교하는 샘플 없이 실험 과정을 반복했습니다. 궁극적으로 EV의 농축에 적합한 UC 튜브 세척 프로토콜의 검증은 EV 실험실에서 발생하는 폐기물을 줄이고 이러한 실험과 관련된 비용을 낮출 것입니다.

프로토콜

1. 튜브 청소

알림: EV 절연 절차는 뚜껑이 있는 폴리카보네이트 및 뚜껑이 없는 폴리카보네이트 UC 튜브를 모두 사용합니다(아래 설명 참조). 뚜껑이 있는 튜브와 뚜껑이 없는 튜브 모두에 대해 동일한 절차를 따랐습니다. 캡이 있는 튜브의 경우, 뚜껑 부품을 개별적으로 세척하고 건조 및 사전 보관 후 재조립했습니다.

1. 폴리카보네이트 튜브를 처음 사용하고 샘플을 제거한 후에는 즉시 UC 튜브를 수돗물에 담가 샘플이 튜브 측면으로 건조되는 것을 방지합니다.
2. 수돗물에 0.1% 도데실 설페이트(SDS)나트륨으로 튜브를 옮기고 담그십시오.
3. 한 번에 하나의 튜브, 전부는 아니지만 대부분의 SDS 용액을 튜브에서 디캔팅하고 면봉을 사용하여 EV 펠릿이 있는 튜브 영역을 철저히 닦습니다.
   알림: 칫솔모가 있는 것은 사용하지 마십시오. 이 프로토콜은 일반 면봉을 사용했습니다. 그러나 전문화된 보푸라기가 적은 면봉을 사용하여 튜브를 청소할 수 있습니다.
4. 뜨거운 수돗물(~50°C)로 최소 3번 헹굽니다. 튜브를 완전히 채우고 디캔팅해야 합니다.
5. 스프레이 병이나 입이 좁은 세척 병을 사용하여 탈염수로 1회 헹굽니다.
6. 스프레이 병을 사용하여 1% 에탄올로 70배 헹굽니다.
7. 튜브를 거꾸로 뒤집어 말리십시오.
   참고: 형광 활성화 세포 분류를 위한 튜브 랙은 UC 튜브를 건조하는 데 적합합니다.
8. 완전히 건조된 튜브를 깨끗한 병에 넣으십시오. 재사용할 준비가 되어 있습니다.
   참고: 현재 이 프로토콜은 최대 2배까지 재사용할 수 있는 것으로 검증되었습니다.

2. 전기차 강화

참고: 다음 EV 분리 및 단백질체학 프로토콜은 원래 조직 EV 분리와 블랭크(한 번도 사용하지 않은) 및 세척된 튜브 샘플을 얻는 데 사용되는 "모의 샘플" 모두에 사용되었습니다. 원래 샘플은 경동맥 내막 절제술을 받은 환자의 경동맥 플라크에서 추출한 재현탁 조직 포획 EV였습니다. 수술 표본은 University Health Network(캐나다 토론토)에서 수집되었으며 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자는 헬싱키 선언에 따라 검체 채취 및 데이터 분석에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다. 모의 샘플은 EV 분리 샘플과 동일한 용액 및 처리 단계로 빈 튜브와 세척된 튜브를 처리하여 얻은 유사 펠릿이었습니다.

1. EV 샘플을 해동하거나 얼음 위의 PBS에서 샘플을 모의 가열합니다.
2. NTE 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.137 M NaCl pH 7.4) 및 멸균 필터를 만듭니다.
3. 10,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 샘플을 회전시킵니다.
4. 상층액을 1mL의 개방형 폴리카보네이트 튜브로 이동합니다.
5. 상층액을 100,000×g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리합니다.
6. 프로테아제 억제제가 있는 150μL의 멸균 여과된 NTE 완충액에 펠릿을 재현탁시킵니다.
7. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 NTE 완충액을 추가하여 총 시료 부피가 1.5mL에 도달합니다.
8. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

3. 밀도 구배(density gradients) 및 밀도 구배 분리(density gradient separation)의 준비

참고: 이 EV 절연 프로토콜은 이전에 Blaser et ^al.9 에 의해 설명되었습니다.

1. NTE 완충액을 희석제로 사용하여 Iodixanol Density Gradient Medium(10%, 15%, 20%, 25% 및 30%)의 5가지 용액을 준비합니다.
2. 뚜껑이 있는 초원심분리기 튜브에 5개의 밀도 용액을 순차적으로 층을 이루고 아래쪽에 30%, 위쪽에 10%를 놓습니다.
3. 튜브의 캡을 고정하고 실온에서 1시간 동안 안정적인 수평 위치로 부드럽게 이동합니다.
4. 1시간 후, 튜브를 얼음 위의 수직 위치로 부드럽게 이동하여 30분 동안 그라디언트를 식힙니다.
5. 1.5mL의 샘플 또는 모의 샘플(NTE 완충액)을 준비된 밀도 그래디언트 튜브 상단에 추가합니다.
6. 초원심분리기 튜브 250,000 × g 에서 4 °C에서 40분 동안 사용할 수 있습니다.
7. 밀도 구배(2.4mL)의 상단 부분을 뚜껑이 없는 초원심분리기 튜브로 제거합니다. 멸균 여과된 NTE 완충액으로 9mL까지 채웁니다.
8. 4°C에서 1시간 동안 100,000× g 의 초원심분리로 EV를 펠릿합니다.
   알림: 보이는 EV 펠릿의 위치 또는 예상 위치를 마커로 동그라미를 치십시오. 이렇게 하면 면봉으로 펠릿 부분을 직접 청소할 수 있습니다.
9. 튜브를 거꾸로 된 위치로 3분 동안 이동하면서 상층액을 흡입합니다. 튜브를 오른쪽으로 돌리기 전에 면봉으로 남은 물방울을 제거합니다.
10. 참조된 키트의 12μL 용해 완충액에 EV 펠릿을 재현탁시킵니다.

4. 단백질체학을 위한 펩타이드 준비

참고: 단백질체학 샘플 준비는 저농도 단백질 샘플에 대한 사내 수정과 함께 키트 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 수정된 프로토콜은 다음과 같습니다.

1. 95°C에서 10분 동안 lyse buffer를 가열하여 샘플을 용해, 변성, 환원 및 알킬화합니다.
2. 시료의 용해 용액 10μL와 분해 용액 10μL를 사용하여 37°C에서 2시간 동안 Lys-C/trypsin 분해 용액을 사용하여 시료를 분해합니다.
3. 친수성 및 소수성 오염 물질을 세척하고 키트 용액을 사용하여 정제된 펩타이드를 용출하여 카트리지를 통해 펩타이드를 정제합니다.
4. 정제된 펩타이드를 45°C의 고속 진공에서 45분 동안 또는 건조될 때까지 건조합니다.
   알림: 펩타이드의 과도한 건조를 피하십시오.
5. 질량 분석 시퀀싱 시점까지 -80 °C에서 샘플을 보관합니다.
6. 건조된 펩타이드에 17μL의 LC 부하 용액을 추가합니다.
7. 샘플을 얼음 위에 1시간 동안 그대로 두십시오.
8. 샘플을 잠시 소용돌이 치다 다음 초음파 수조에서 5 분 동안 초음파 처리합니다.
9. LC 부하 시료를 16,000× g 에서 1분 동안 원심분리하고 상단에서 15μL를 흡인한 다음 새 튜브로 분리합니다.

5. 액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량 분석 시퀀싱

1. 2μL의 LC 부하 펩타이드 용액을 질량 분석기에 주입합니다.
2. dual-column setup을 사용하여 펩타이드를 분획합니다.
3. 45°C의 일정한 온도에서 컬럼을 가열합니다.
4. 5%에서 21% 용매 B(아세토니트릴/0.1% 포름산)로 300nL/분에서 60분 동안 분석 그래디언트를 실행한 다음 21%에서 30% 용매 B를 10분 동안 실행하고 95%-5% 직소 세척을 10분 더 실행합니다.
5. MS1을 120K 분해능(최대 주입 시간, 25ms)으로 설정하고, 상단 전구체 이온(3.0초 주기 시간 이내)을 HCD 분리 폭 1.2m/z, 동적 배제 활성화(60s)로 설정하고, MS2 분해능을 60K(최대 주입 시간, 자동, 정규화된 충돌 에너지, 24%, 26% 및 28%)로 설정합니다.
6. MS1 및 MS2 획득 범위를 각각 400m/z-1,200m/z 및 120m/z-1,200m/z로 설정합니다.

6. 펩타이드/단백질 식별

1. 인간 uniProt 데이터베이스에 대해 상용 검색 알고리즘을 사용하여 단백질체 검색 소프트웨어로 획득한 펩타이드 스펙트럼을 검색합니다.
2. 소화 효소를 트립신으로 설정하고 최대 두 번의 절단을 놓칠 수 있습니다.
3. precursor tolerance를 10 ppm으로 설정하고 fragment tolerance window를 0.02 Da로 설정합니다.
4. 메티오닌 산화와 N-말단 아세틸화를 가변 변형으로, 시스테인 카르바미도메틸화를 고정 변형으로 설정합니다.
5. Percolator 알고리즘에 의해 계산된 1.0%의 FDR(false discovery rate) 임계값을 기준으로 펩타이드를 필터링합니다.
6. 주어진 단백질 그룹에 할당되고 다른 단백질 그룹에서는 검출되지 않는 펩타이드만 고유한 것으로 간주하고 추가 분석에 사용하십시오.
7. 분석에서 각 단백질에 대해 최소 2개의 고유한 펩타이드만 포함합니다.
8. 전구체 이온 검출로 ID를 최대화합니다.
9. 최대 머무름 시간 이동 10분, 질량 허용 오차 10ppm, 최소 신호 대 잡음비 5로 크로마토그래피 정렬을 수행합니다.
10. 총 펩타이드 양으로 펩타이드 풍부도를 정규화합니다.

결과

세척 프로토콜(그림 1)을 검증하기 위해 두 가지 실험을 수행했습니다. 먼저, 세척된 튜브의 "모의 샘플"의 단백질체를 튜브의 초기 사용에서 조직 EV 샘플의 단백질체와 비교하여 식별된 단백질의 캐리오버를 측정했습니다. 대표적인 크로마토그램은 튜브 세척 후 피크 이질성(peak heterogeneity)의 감소를 보여줍니다(그림 2). 원래 EV 분리에서는 806개의 단?...

토론

여기에서는 EV 농축 및 단백질체 응용 분야를 위한 폴리카보네이트 UC 튜브를 세척하기 위한 프로토콜을 설명하고 검증합니다. 이 질량 분석 획득 프로토콜의 검출 한계 이하로 세척된 pseudo-pellet 분석과 비교하여 이전 UC 튜브 샘플에서 잔류 단백질을 성공적으로 제거했음을 입증했으며 세척된 UC 튜브 유사 펠릿과 비교하여 사용되지 않은 빈 UC 튜브의 단백질체 유사성을 보여주었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent