폴리카보네이트 초원심분리기 튜브는 세포외 소포체의 단백질체 분석에 재사용됩니다.

요약

단백질체학 실험에 적합한 세포외 소포체 분리를 수행하기 위해 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브를 세척하고 재사용하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

초록

일회용 실험실 플라스틱은 오염 위기를 악화시키고 소비 비용에 기여합니다. 세포외 소포체(EV) 분리에서는 폴리카보네이트 초원심분리기(UC) 튜브를 사용하여 관련된 높은 원심력을 견뎌냅니다. EV 단백질체학은 발전하는 분야이며 이러한 튜브에 대한 검증된 재사용 프로토콜이 부족합니다. 저수율 단백질 분리 프로토콜 및 다운스트림 단백질체학에 소모품을 재사용하려면 원심분리기 튜브 유래 합성 고분자 오염이 없고 잔류 단백질이 충분히 제거되는 등 질량 분광법 획득과의 시약 호환성이 필요합니다.

이 프로토콜은 EV 단백질체학 실험에서 재사용하기 위해 폴리카보네이트 UC 튜브를 세척하는 방법을 설명하고 검증합니다. 세척 과정에는 단백질 건조를 방지하기 위해 UC 튜브를 H₂O에 즉시 담그고, 0.1 % 도데 실 황산 나트륨 (SDS) 세제로 세척하고, 뜨거운 수돗물, 탈염수 및 70 % 에탄올로 헹구는 작업이 포함됩니다. 다운스트림 EV 단백질체학을 위한 UC 튜브 재사용 프로토콜을 검증하기 위해 차등 UC 및 밀도 구배 분리를 사용하여 심혈관 조직에서 EV를 분리하는 실험에 따라 사용된 튜브를 얻었습니다. 튜브를 세척하고 EV 샘플 없이 실험 과정을 반복하여 사용하지 않은 빈 UC 튜브와 세척된 UC 튜브를 비교했습니다. 분리 절차에서 얻은 유사 EV 펠릿을 용해하고 저농도 단백질 샘플에 대한 변형이 있는 상용 단백질 샘플 준비 키트를 사용하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법을 위해 준비했습니다.

세척 후, 동일한 튜브의 이전 EV 분리 샘플에 비해 유사 펠릿에서 식별된 단백질의 수가 98% 감소했습니다. 세척된 튜브와 빈 튜브를 비교한 결과, 두 샘플 모두 86%의 유사성을 가진 매우 적은 수의 단백질(≤20)을 함유하고 있었습니다. 세척된 튜브의 크로마토그램에 폴리머 피크가 없음이 확인되었습니다. 궁극적으로, EV의 농축에 적합한 UC 튜브 세척 프로토콜의 검증은 EV 실험실에서 발생하는 폐기물을 줄이고 실험 비용을 낮출 것입니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 단백질과 같은 생물학적 활성 화물을 운반하는 세포에서 방출되는 지질-이중층으로 구분된 입자로, 세포 간 통신 및 생물학적 광물화 형성을 포함한 다양한 생물학적 과정에 참여합니다¹. 이러한 입자는 모든 체액과 조직에서 발견되며 생물학적 활동과 용도는 과학 연구에서 빠르게 발전하는 분야입니다. 이러한 나노 입자의 분리 및 검증은 크기가 작고 리포솜 및 단백질 응집체와 같은 다른 입자와의 생물학적 유사성으로 인해 다양한 문제를 야기합니다. 가장 최근의 국제세포외소포학회(International Society of Extracellular Vesicles) 가이드라인인 2018년 세포외소포체(Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018, MISEV2018)는 전기차 과학 연구에서 인정받는 표준이다².

EV 절연을 위해 종종 동시에 다양한 방법을 사용해야 하며, 이는 업스트림 소스와 다운스트림 애플리케이션에 따라 다릅니다. 2015년 현재 EV의 가장 일반적인 1차 절연 방법은 차동 초원심분리(UC)²입니다. 원칙적으로 초기 저속 원심....

프로토콜

1. 튜브 청소

알림: EV 절연 절차는 뚜껑이 있는 폴리카보네이트 및 뚜껑이 없는 폴리카보네이트 UC 튜브를 모두 사용합니다(아래 설명 참조). 뚜껑이 있는 튜브와 뚜껑이 없는 튜브 모두에 대해 동일한 절차를 따랐습니다. 캡이 있는 튜브의 경우, 뚜껑 부품을 개별적으로 세척하고 건조 및 사전 보관 후 재조립했습니다.

1. 폴리카보네이트 튜브를 처음 사용하고 샘플을 제거한 후에는 즉시 UC 튜브를 수돗물에 담가 샘플이 튜브 측면으로 건조되는 것을 방지합니다.
2. 수돗물에 0.1% 도데실 설페이트(SDS)나트륨으로 튜브를 옮기고 담그십시오.
3. 한 번에 하나의 튜브, 전부는 아니지만 대부분의 SDS 용액을 튜브에서 디캔팅하고 면봉을 사용하여 EV 펠릿이 있는 튜브 영역을 철저히 닦습니다.
   알림: 칫솔모가 있는 것은 사용하지 마십시오. 이 프로토콜은 일반 면봉을 사용했습니다. 그러나 전문화된 보푸라기가 적은 면봉을 사용하여 튜브를 청소할 수 있습니다.
4. 뜨거운 수돗물(~50°C)로 최소 3번 헹굽니다. 튜브를 완전히 채우고 디캔팅해야 합니다.
5. 스프레이 병이나 입이 좁은 세척 병을 사용하여 탈염수로 1회 헹굽니다.
6. 스프레....

토론

여기에서는 EV 농축 및 단백질체 응용 분야를 위한 폴리카보네이트 UC 튜브를 세척하기 위한 프로토콜을 설명하고 검증합니다. 이 질량 분석 획득 프로토콜의 검출 한계 이하로 세척된 pseudo-pellet 분석과 비교하여 이전 UC 튜브 샘플에서 잔류 단백질을 성공적으로 제거했음을 입증했으며 세척된 UC 튜브 유사 펠릿과 비교하여 사용되지 않은 빈 UC 튜브의 단백질체 유사성을 보여주었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent