نموذج الطعم العضوي العضوي المشتق من مريض سرطان الخلايا الكبدية للتحقيق في تأثير تجديد الكبد على نمو الورم

Fabian Haak; Gabriel Fridolin Hess; Philipp Sedlaczek; Savas Deniz Soysal; Jürg Vosbeck; Salvatore Piscuoglio; Mairene Coto-Llerena; Otto Kollmar

doi:10.3791/66245

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يتم حقن العضيات الناتجة عن أورام المريض تقويم العظام في كبد الفأر. يؤدي استئصال أنسجة الكبد غير الورمية إلى بيئة متجددة في أنسجة الكبد حيث يوجد الورم.

Abstract

يشكل التكرار تحديا ملحوظا بعد علاج سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، مما يؤثر على أكثر من 70٪ من المرضى الذين يخضعون لعملية الاستئصال الجراحية. ينبع التكرار من ورم خبيث دقيق غير مكتشف أو سرطان من جديد ، والذي يحتمل أن يكون ناتجا عن تجديد الكبد بعد الجراحة. استخدمت الأبحاث السابقة خطوط خلايا سرطان الكبد في نماذج تقويم العظام لدراسة تأثير تجديد الكبد ، لكن صلاحيتها المحدودة دفعت إلى الحاجة إلى نموذج أكثر تمثيلا. هنا ، نقدم نهجا جديدا يستخدم عضيات سرطان الكبد المشتقة من المريض للتحقيق في تأثير تجديد الكبد على سرطان الكبد.

تتم معالجة أنسجة الورم للمريض لإنشاء عضيات الورم ، مدمجة في مصفوفة غشاء القاعدي ثلاثية الأبعاد ، ويتم زراعتها في وسط خاص بالكبد. يتم حقن مليون عضوية في الفص العلوي الأيمن (RSL) للفئران التي تعاني من نقص المناعة ، مما يؤكد نمو الورم العياني من خلال التصوير بالموجات فوق الصوتية. تخضع مجموعة التدخل لاستئصال الفص الجانبي الأيسر (LLL) (30٪ من إجمالي حجم الكبد) أو بالإضافة إلى الفص الأوسط (ML) (65٪ من إجمالي حجم الكبد) للحث على تجديد الكبد داخل موقع الورم. تخضع المجموعة الضابطة لإعادة شق البطن دون استئصال أنسجة الكبد. بعد أسبوعين ، تخضع كلتا المجموعتين لعملية استخلاص الورم والأنسجة الطبيعية.

في الختام ، يوفر هذا النموذج العضوي لسرطان الكبد المشتق من المريض منصة قوية للتحقيق في تأثير تجديد الكبد بعد استئصال السرطان. تكوينه متعدد الخلايا ، وتنوعه الجيني ، وقدراته الاستزراعية المطولة يجعله أداة لا تقدر بثمن لدراسة آليات تكرار سرطان الكبد والتدخلات المحتملة.

Introduction

يعد تكرار العلاج بعد علاج سرطان الخلايا الكبدية (HCC) تحديا كبيرا ، حيث يؤثر على أكثر من 70٪ من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي¹^،²^،³. قد ينتج هذا التكرار عن ورم خبيث دقيق غير مكتشف (ورم متعدد المراكز) أو تطور سرطان دي نوفو ⁴. تشير كل من التحقيقات السريرية والتجريبية إلى أن عملية تجديد الكبد الناتجة عن الاستئصال الجراحي يمكن أن تنشط النقائل الدقيقة الكامنة ، مما يساهم في تكرار الورم.

من الضروري إجراء مزيد من البحث لمقارنة التعبير الجيني والبروتيني في خلايا الكبد الطبيعية والخبيثة داخل بيئة الكبد المتجددة. بالإضافة إلى توضيح الآليات الكامنة وراء التكرار ، فإن تحديد مسارات الإشارات القابلة للاستهداف الخاصة بالخلايا السرطانية ينطوي على إمكانية تحقيق تقدم علاجي كبير. يهدف هذا النهج إلى التوفيق بين المفاهيم المتناقضة على ما يبدو لبيئة مكروية مضادة للورم والظروف المواتية لتجديد الكبد.

استخدمت النماذج السابقة الحقن التقويمي لخطوط خلايا سرطان الكبد للتحقيق في تأثير تجديد الكبد⁵. يستخدم هذا النموذج الرائد عضيات سرطان الكبد المشتقة من المريض ، مما يوفر العديد من المزايا على خطوط الخلايا التقليدية. تحافظ العضيات على مجموعات خلايا متنوعة ، مما يعكس بنية قالب النموذج ووظيفته ، على عكس خطوط الخلايا والكرويات. تنوعها الجيني يعزز التمثيل. بالإضافة إلى ذلك ، توفر العضيات الاستقرار للثقافة الممتدة ، مما يتيح دراسات التدخل المطولة. نوصي بحقن RSL نظرا لإمكانات التجديد الفائقة مقارنة بالفص السفلي الأيمن (RIL). توفر الطريقة الموضحة هنا منصة تستخدم عضيات السرطان ذات مزايا واضحة مقارنة بخطوط الخلايا السرطانية للتحقيق في سؤال البحث المذكور أعلاه.

Protocol

تم الحصول على عينات الكبد المستخدمة في توليد العضيات من المرضى الذين خضعوا لعملية جراحية في مستشفى بازل الجامعي (USB) بعد موافقة خطية مستنيرة بموافقة اللجنة الأخلاقية في شمال غرب ووسط سويسرا (رقم BASEC 2019-02118). تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة بلجنة رعاية في كانتون بازل شتات ، سويسرا (3123-33896). كانت جميع الفئران من سلالة فأر جاما SCID غير المصابة بالسكري (NOD) وبالتالي معدلة وراثيا لتكون مثبطة للمناعة. تم استخدام الذكور فقط. انظر الجدول 1 وجدول المواد للحصول على تفاصيل تتعلق بالمحاليل والكواشف والمواد والأدوات المستخدمة في البروتوكول. انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة على التجربة.

1. تربية الفئران

قم بتربية الفئران والحفاظ عليها في منشأة في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في جدول زمني مدته 12 ساعة في النهار و 12 ساعة في الليل مع الوصول المخصص إلى الغذاء ومياه الشرب.
ملاحظة: يتم إجراء زرع العضيات في سن 6-8 أسابيع.

2. عينات المرضى والسريرية

ضع 12 و 24 و 6 أطباق في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية قبل البدء. إذا أمكن ، افعل ذلك قبل يوم واحد.
1. اجمع الأنسجة في غضون ساعة واحدة بعد الاستئصال في وسط RPMI 1640 وانقلها إلى المختبر لبدء عملية التفكك على الفور. ضع المنديل في طبق بتري مقاس 10 سم (طبق مسخن مسبقا) وأضف كمية كافية من المحلول الملحي المعقم لتجنب جفاف الأنسجة.
تفكك أنسجة سرطان الكبد لتوليد العضيات
1. افرم الأنسجة إلى أجزاء صغيرة من 1-2 مم² باستخدام المشارط. استخدم ملقط إضافي للأنسجة لتثبيت الأنسجة في حالة صعوبة القطع.
2. ضع قطع الأنسجة في أنبوب سعة 15 مل مع 5 مل من المخزن المؤقت للتفكك (درجة الحموضة الفسيولوجية). ضعها عند 37 درجة مئوية (خزانة التدفئة / الحاضنة) في جهاز الدوران.
3. تخلط عن طريق سحب العينات كل 10 دقائق وتترك لمدة 1-1.5 ساعة تقريبا ، مع تكرار عملية الخلط كل 10 دقائق.
  ملاحظة: قد يتطلب الخلط قطع نهاية الماصة لزيادة قطر الفتحة ، وبالتالي منع الأنسجة كبيرة الحجم من الالتصاق في طرف الماصة.
4. اجمع 10 ميكرولتر من خليط المخزن المؤقت لتفكك الخلايا من الخطوة 2.2.3 في أنبوب بلاستيكي سعة 0.5 مل ، وأضف 10 ميكرولتر من Trypan Blue ، واستخدم عداد الخلايا الآلي لتقييم صلاحية الخلايا ومجموعات الخلايا. إذا كانت العناقيد مرئية ، كرر عملية الخلط (الخطوة 3.3) ؛ خلاف ذلك ، تابع الخطوة التالية.
5. خذ أنبوبا سعة 50 مل ، ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر في الأعلى ، ومرر المزيج من خلاله. باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل ، قم بتحطيم جميع شظايا الأنسجة المتبقية من خلال الفلتر. اغسل كل شيء ب 5 مل من Ad-DF +++ وتأكد من جمع القطرة من أسفل الفلتر.
6. انقل المرشح إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 300 × جم.
7. استنشق المادة الطافية بعناية ، مع الحرص على عدم لمس الحبيبات. أضف 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء. احتضن لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. قم بإزالة المادة الطافية وأعدها في 1 مل من الوسط المتقدم.
عد الخلايا وتقييم صلاحية الخلية
1. أضف 10 ميكرولتر من Trypan blue إلى أنبوب سعة 1.5 مل واخلطه مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية. ضع 10 ميكرولتر من المزيج على شرائح العد وعد الخلايا.
2. افصل العدد اللازم من الخلايا لتوليد العضوية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. بشكل عام ، قم بزرع 80.000 خلية لكل قبة و 20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل قبة (10 قطرات لكل بئر لكل لوحة 6 آبار).
3. إذا بقيت أي خلايا زائدة معلقة، فقم بتعليق الحبيبات في وسط تجميد تعليق الخلية (10٪ DMSO في FBS)، وانقلها إلى أنبوب تبريد، وضعها في حاوية تجميد. انقل الأنبوب على الفور إلى فريزر -80 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، انقله إلى النيتروجين السائل لحين الحاجة.
طلاء لتوليد العضوية
1. قم بإزالة المادة الطافية. ضع الأنبوب على الجليد وأعد تعليق الحبيبات بمصفوفة غشاء القاعد.
2. أخرج الطبق المسخن مسبقا من الحاضنة (مسخن مسبقا طوال الليل). قم بعمل قطرات صغيرة في اللوحة (20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل قبة [10 قطرات لكل بئر]). اقلب اللوحة واترك اللوحة لمدة 5 دقائق في خزانة التدفق.
3. بعد 5 دقائق ، انقل اللوحة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية واترك اللوحة لمدة ~ 20 دقيقة ، مما يسمح للمصفوفة بالتصلب. أضف 2 مل من وسط الثقافة العضوية ^6,7.
الحفاظ على الثقافة العضوية
1. استبدل الوسيط كل يومين. بمجرد أن تتلاقى العضيات في قبة مصفوفة الغشاء القاعدي وتكون جاهزة للتمدد ، احسب نسبة الانقسام على سبيل المثال ، 2x أو 3x وفقا لذلك.
  ملاحظة: سجل هذه المعلومات؛ ستكون هناك حاجة إليه في الخطوات التالية.
2. قم بإزالة الوسيط من زاوية البئر باستخدام طرف P1000 ، مع الحرص على عدم لمس قباب المصفوفة.
3. أضف 100 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين EDTA لكل قبة ، واكشطها ، واجمعها في أنبوب سعة 15 مل ، وأضف مرة أخرى كمية صغيرة من التربسين في البئر لجمع كل شيء. ماصة ~ 10x.
4. احتضن لمدة 3 دقائق في الحمام المائي 37 درجة مئوية والماصة 10x لفصل الخلايا بطرف P1000. كرر هذه الخطوة كل 3 دقائق لمدة أقصاها 10 دقائق.
5. أضف على الأقل نفس الحجم من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) / 1٪ بنسلين ستربتومايسين (Pen-Strep) وخلط لأعلى ولأسفل ببطء 2x. املأ مع DPBS.
6. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. قم بالتعليق وفقا لنسبة الانقسام التي تم تحديدها بناء على التقاء العضوية ، على سبيل المثال ، 2x أو 3x الكمية الأولية لمصفوفة الغشاء القاعدي.
7. أخرج الطبق المسخن مسبقا من الحاضنة (مسخن مسبقا طوال الليل). قم بعمل قطرات صغيرة في اللوحة (20 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل قبة [10 قطرات لكل بئر]). اقلب اللوحة واترك اللوحة لمدة 5 دقائق في خزانة التدفق.
8. بعد 5 دقائق ، انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. اترك اللوحة لمدة ~ 20 دقيقة ، مما يسمح للمصفوفة بالتصلب. أضف 2 مل من وسط الثقافة العضوية.
تحضير العضيات لصنع كتلة مدمجة بالبارافين (FFPE) مثبتة بالفورمالين
1. قم بإزالة الوسيط من زاوية البئر باستخدام طرف P1000 ، مع الحرص على عدم لمس قباب المصفوفة. أضف 200 ميكرولتر من Dispase (2 مجم / مل) وقم بتعطيل القطرات بطرف ماصة P1000. اتركيه في الحاضنة لمدة 80 دقيقة.
2. أضف 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco إلى البئر ، وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، واملأه ب DPBS. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 4٪ بارافورمالدهايد. برد لمدة 1 ساعة على الأقل.
3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بشفط بارافورمالدهيد ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام هلام معالجة العينات لإنشاء قطرة. انتظر لمدة 40 دقيقة حتى تصلب القطرات. ضع قطرة الجل التي تحتوي على الخلايا في شريط الأنسجة. حرك الكاسيت للتجفيف ثم قم بتضمينه بعد ذلك في البارافين للقطع وتلوين H / E⁸^،⁹.
تحضير العضيات للحقن
1. أخرج اللوحة التي تحتوي على العضوية المتنامية من الحاضنة وضعها في خزانة التدفق.
2. اتبع الخطوات من 2.5.2 إلى 2.5.4.
3. أضف 2 مل من DMEM واخلط.
4. أضف 10 ميكرولتر من Trypan blue إلى أنبوب سعة 1.5 مل واخلطه مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
5. ضع 10 ميكرولتر من المزيج على شرائح العد وعد الخلايا. احسب متوسط عدد الخلايا لكلتا الغرفتين. إذا كان الفرق كبيرا جدا بين المجلسين ، ففكر في إعادة العد.
6. احسب حجم تعليق الخلية المطلوب ل 10⁶ خلايا وقم بتوزيع هذا الحجم على أنابيب 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وضع الأنابيب على الجليد.
7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأضف 5 ميكرولتر من DMEM و 5 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي. امزج التعليق بعناية عن طريق سحب العينات مع الحفاظ على برودة التعليق أثناء العملية.
8. ضع الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على العضيات على الجليد أثناء النقل إلى الفئران واستمر في الحقن.

3. حقن العضوية في الفأر

خطوات الفترة المحيطة بالجراحة
1. أخرج التجريبي من القفص الرئيسي وضعه في قفص منعزل وطازج بالماء.
2. قم بتخدير الفأر بنسبة 1.5٪ إلى 2.5٪ من الأيزوفلوران.
3. إجراء حقنة تحت الجلد في الرقبة مع 10 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.3 مجم / مل) قبل 30 دقيقة من بدء الجراحة.
4. قبل بدء الجراحة مباشرة ، قم بطلاء عيون بعناية باستخدام Carbomerum (على سبيل المثال ، Lacrinorm) لتجنب أي جفاف في العينين أثناء الجراحة. لا تلمس القرنية أثناء التطبيق لتجنب أي تآكل للقرنية.
5. ضع على سطح نظيف ومعقم وتعامل معها بقفازات بلاستيكية جديدة وشبكة شعر وطبقة عمل مختبرية خاصة تستخدم فقط في منشأة الفأر.
6. استخدم مصباحين أماميين ينبعثان للحرارة بالقرب من لتوفير رؤية كافية. إذا كان هناك أي شك أو قلق بشأن انخفاض حرارة الجسم أثناء الجراحة ، فاستخدم مصباح تسخين آخر أو حصيرة تدفئة.
شق البطن
ملاحظة: قبل بدء العملية الجراحية ، تم فحص عمق التخدير عن طريق اختبار قرصة إصبع القدم. أثناء العملية ، تم توفير التخدير الكافي من خلال الفحوصات الروتينية ومراقبة معدل التنفس وتعديله إذا كانت هناك زيادة ذات صلة. تم تنظيف المعدات الجراحية وتطهيرها وفقا للإرشادات الداخلية لمنشأتنا للحيوانات.
1. ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف ، وقم بتمديد الأطراف الأربعة ، وقم بإصلاحها بشريط لاصق. قم بإزالة الفراء عن طريق وضع كريم مزيل الشعر واستخدام منديل مبلل لإزالة الكريم والفراء الزائد.
  ملاحظة: يعمل إزالة الشعر بشكل أفضل إذا تم استخدام قطعة قطن لتدليك الكريم في الفراء عكس اتجاه الحبوب.
2. قم بتوطين الخط ألبا ، وهو الهدف من شق البطن. تحديد الشرايين الشرسوفية العلوية والسفلية أيضا. احرص على عدم إتلاف الأوعية لتجنب الإصابات.
3. قم بعمل شق على طول الخط باستخدام ملقط ومقص جراحي مجهري من أسفل البطن إلى الغضروف الخنجري.
4. أدخل المباعدات واضبط اتجاه الجر للتعرض الأمثل لأعلى البطن (الشكل 2 أ ، ب).
  ملاحظة: نستخدم مشابك الورق المثنية كمباعدات مع أشرطة مطاطية متصلة للتثبيت.
حقن العضيات
1. ضع منديلا نظيفا بجوار الشق مباشرة وضع بعض قطرات المحلول الملحي عليه. قم بإخراج الأمعاء الدقيقة والأعصور من الخارج وضعها على منديل مبلل.
2. كشف الفص العلوي الأيمن (RSL) حتى يصبح الحقن ممكنا.
3. قم بإعداد حقنة هاميلتون ، واشطفها بالماء ، وضع علامة 2-3 مم من الحافة كمرجع للحقن.
4. ارسم المحقنة بالخليط العضوي المحضر وحقن الإبرة حتى العلامة. حقن العضيات ببطء في وضع ثابت; لا تحرك الإبرة خلال هذا الوقت.
5. انتظر لمدة 15-20 ثانية لتجنب التدفق العكسي للخليط. قم بإزالة الإبرة والضغط بقطعة قطن على موقع الحقن. افحص البطن بحثا عن تمزق في فص الكبد والتدفق العكسي. اشطف البطن ب 0.5 مل من محلول ملحي معقم وأغلق البطن بخياطة جارية باستخدام خياطة قابلة للامتصاص.
  ملاحظة: تم تغطية موقع الجراحة بستارة معقمة. تم تنظيف الأدوات الجراحية المستخدمة أثناء العملية بشكل أساسي بالماء وعوامل التنظيف لإزالة البقايا العيانية. ثم تمت معالجة الأدوات في محلول التعقيم. تم استخدام المواد الاستهلاكية مثل الخيوط أو القفازات أو مسحات القطن مرة واحدة فقط لأسباب صحية وكانت معقمة.

4. استئصال طفيف (30٪ من أنسجة الكبد)

قم بإجراء شق البطن كما هو مذكور أعلاه في الخطوة 3.2.
استخدم مسحات قطنية رطبة وادفع ML للرأس لخلق مساحة أكبر في المجال الجراحي ل LLL.
اقلب LLL في الجمجمة وكشف الفص المذنبي (CL) والرباط الموجود بشكل معتاد بين CL و LLL (الشكل 2 ج).
اقطع الرباط بالكامل وأدخل الرباط (الخيط الرفيع غير القابل للامتصاص ، على سبيل المثال Prolene 5-0) أسفل LLL. للتأكد من بقائه في هذا الوضع ، قم بترطيب الرباط وحركه نحو الربع العلوي الأيمن.
اقلب LLL بشكل ذيلي. قم بتوجيه الطرف الحر الأيسر من الرباط حول الطرف الأيسر من LLL. قم بتوجيه الطرف الحر الأيمن من الرباط حول الطرف الأيمن من LLL. ضع الجر الذيلية على LLL باستخدام قطعة قطن وتأكد من الوضع الصحيح والمركزي للرباط.
اربط نصف عقدة مزدوجة. قم بتأمين العقدة بعقدة نصف ثانية مربوطة في الاتجاه الآخر دون شدها بالكامل. شد العقد قليلا ، وتحقق من الموضع الصحيح للرباط ، وأعد وضعه لضمان وضع جيد.
شد العقدة تماما عن طريق تثبيت الطرف الحر للجمجمة في موضعه باستخدام ملقط حاد الرأس واسحب الطرف الحر الذيلي بزوج آخر من الملقط (الشكل 2 د). قم بتأمين العقدة بعقدة نصف ثانية مربوطة في الاتجاه المعاكس.
استئصال فص الكبد. قطع بالقرب من الرباط دون قطعه.

5. استئصال كبير (65٪ من أنسجة الكبد)

قم بإجراء الاستئصال البسيط ل LLL كما هو مذكور أعلاه (الخطوات 3.4.1-3.4.8).
قم بتمرير الرباط المنجلي لتحريك ML. اقلب الفص في الجمجمة. أدخل الرباط أسفل الفص واقلب الفص ذيلي.
قم بلف الأطراف الحرة حول الفصيص. كرر وضع الرباط في حالة وضع غير موضعها أثناء التلاعب. بمجرد وضع الرباط بشكل صحيح ، ضع عقدة نصف مزدوجة ، واربطها ببطء ، وأعد وضع الرباط إذا لزم الأمر.
اربط عقدة النصف الثاني في الاتجاه المعاكس وشدها تماما. أضف نصف عقدة ثالثة في الاتجاه المعاكس.
استئصال الفص.
اغسل البطن بمحلول ملحي معقم وضع الأمعاء في مكانها التشريحي.

6. إغلاق البطن

أمسك الجلد والصفاق بالملقط وقم بعمل غرزة بخيط قابل للامتصاص (على سبيل المثال ، مونوكريل 5-0) في الطرف العلوي من خط الشق. تأكد من الخروج على الجانب البريتوني.
قم بإجراء الغرزة الثانية على نظير الشق ، والخروج من جانب الجلد. اربط العقدة بإحكام مع ترك الطرف الحر بدون إبرة قصيرة والنهاية بالإبرة طويلة. قطع الطرف القصير بطول 2 مم.
استمر في خياطة الجري وانتهي بعقدة في الطرف السفلي من الشق.
نظف بطن الفأر من أي دم متبقي.

7. رعاية ما بعد الجراحة

بعد إغلاق البطن ، قم بحقن 10 ميكرولتر أخرى من البوبرينورفين (0.3 مجم / مل) تحت الجلد في الرقبة. ضع في القفص المعزول المستخدم سابقا ، ووضعه جزئيا على حصيرة تسخين. قدم بعض الطعام الذي يسهل الوصول إليه على أرضية القفص.
ملاحظة: لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه.
قم بإجراء ضوابط ما بعد الجراحة في 2 ساعة و 6 ساعات بعد الجراحة. مراقبة السلوك عن كثب مع إيلاء اهتمام خاص لأي علامة على الألم ؛ قم بإعطاء 10 ميكرولتر أخرى من بوبيفاكائين إذا لزم الأمر.
بمجرد تعافي الفأر تماما ، ولكن ليس قبل 6 ساعات بعد الجراحة وفي موعد لا يتجاوز 24 ساعة بعد الجراحة ، أعد إدخاله إلى القفص الرئيسي. راقب عن كثب سلوك جميع المتورطة فيما يتعلق بأي عدوان أو سلوك مشبوه آخر. عندما تشك في أي ضعف للحيوان بعد الجراحة ، اتركه معزولا طوال الليل للتعافي حتى إعادة الإدخال النهائي.
بعد التحكم النهائي بعد الجراحة بعد يوم واحد من الجراحة ، استمر في الوزن المنتظم للحيوانات.
ملاحظة: تم إعطاء التسكين بعد 4 و 8 ساعات من الجراحة. تم إجراء مزيد من المراقبة بعد 12 و 24 و 48 ساعة بعد الجراحة ، وتم فحص الفئران بحثا عن أي نوع من الألم أو الضيق. إذا لوحظت أي علامات للألم ، تم إعطاء جرعة أخرى من البوبرينورفين.

8. مراقبة نمو الورم

شل حركة الفئران باستخدام تخدير الأيزوفلوران واستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية لتصور زرع الورم بدءا من أسبوعين بعد الحقن¹⁰.
قتل الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂.

النتائج

نظرنا في مساهمة فصوص الكبد المفردة في إجمالي حجم الكبد ووجدنا أن LLL يمثل 33٪ من إجمالي حجم الكبد. يمثل ML 32٪ من إجمالي حجم الكبد ، و RSL 13٪ ، و RIL 10٪ ، و CL 10٪ (الجدول 2). تظهر المخططات الصندوقية أن المساهمة النسبية لفصوص الكبد قابلة للمقارنة بين الفئران المختلفة من نفس ال...

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تخدير الفأر
الهدف من التخدير هو تحويل الفأر بأمان إلى حالة يتحمل فيها التلاعب الجراحي. في الوقت نفسه ، لا ينبغي أن يكون تأثير التخدير قويا جدا ، لمنع السكتة القلبية الرئوية والموت الذي يترتب على ذلك. التخدير المستنشق أ...

Disclosures

ليس لدى جميع المؤلفين علاقات مالية أو شخصية مع أشخاص أو منظمات أخرى يمكن أن تؤثر بشكل غير لائق على عملهم. ويشمل ذلك أي تضارب محتمل في المصالح، مثل المصالح المالية أو الانتماءات أو العلاقات التي قد تؤثر على قدرتهم على تقديم البيانات أو تفسيرها بموضوعية.

Acknowledgements

نشكر كل من ساعد في هذا المشروع ، وخاصة كارولينا جوجا والدكتورة دانييلا ليبراتي ، للحفاظ على العضيات وضمان الجودة القابلة للتكرار بمرور الوقت. نشكر إيفا بروير وأنوراغ جوبتا من مختبر جراحة الكبد الصفراوية وزراعة الأعضاء في مستشفى جامعة زيورخ على دعمهما فيما يتعلق بالتخدير. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج القسم الجراحي "Personenförderung" إلى G.F.H و F.H. سانت كلارا فورشونج AG و "Stiftung zur Krebsbekämpfung" إلى G.F.H. وجامعة بازل ، باحث مبتدئ في صندوق الأبحاث (3MS1087) إلى M.C-LL.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO₂ Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817

References

Huang, J., et al. A randomized trial comparing radiofrequency ablation and surgical resection for HCC conforming to the Milan criteria. Annals of surgery. 252 (6), 903-912 (2010).
Lim, K. -. C., et al. Systematic review of outcomes of liver resection for early hepatocellular carcinoma within the Milan criteria. The British Journal of Surgery. 99 (12), 1622-1629 (2012).
Roayaie, S., Jibara, G., Taouli, B., Schwartz, M. Resection of hepatocellular carcinoma with macroscopic vascular invasion. Annals of Surgical Oncology. 20 (12), 3754-3760 (2013).
Sarpel, U., et al. Outcome for patients treated with laparoscopic versus open resection of hepatocellular carcinoma: case-matched analysis. Annals of Surgical Oncology. 16 (6), 1572-1577 (2009).
Ou, D. -. L., et al. Development of a PD-L1-expressing orthotopic liver cancer model: implications for immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Liver Cancer. 8 (3), 155-171 (2019).
Nuciforo, S., et al. Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies. Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).
Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), (2018).
Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
Bou About, G., et al. Ultrasound-guided approaches to improve orthotopic mouse xenograft models for hepatocellular carcinoma. Current Protocols in Mouse Biology. 9 (2), 62 (2019).
Janssen, B. J. A., Smits, J. F. M. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
Janssen, B. J. A., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), H1618-H1624 (2004).
Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: the art and Science. ILAR Journal/National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 62 (1-2), 238-273 (2021).
Kamali, C., et al. Extended liver resection in mice: state of the art and pitfalls-a systematic review. European Journal of Medical Research. 26 (1), 6 (2021).
Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
Iwakiri, Y., Cadelina, G., Sessa, W. C., Groszmann, R. J. Mice with targeted deletion of eNOS develop hyperdynamic circulation associated with portal hypertension. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 283 (5), G1074-G1081 (2002).
Schlegel, A., et al. ALPPS. Annals of Surgery. 260 (5), 839-847 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article