Ein von Patienten mit hepatozellulärem Krebs abgeleitetes Organoid-Xenotransplantat-Modell zur Untersuchung des Einflusses der Leberregeneration auf das Tumorwachstum

Zusammenfassung

Organoide, die aus Patiententumoren erzeugt werden, werden orthotopisch in die Leber der Maus injiziert. Die Resektion von nicht-tumorösem Lebergewebe führt zu einer regenerativen Umgebung im Lebergewebe, in dem sich der Tumor befindet.

Zusammenfassung

Das Rezidiv stellt nach der Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) eine bemerkenswerte Herausforderung dar und betrifft mehr als 70 % der Patienten, die sich einer chirurgischen Resektion unterziehen. Das Rezidiv ist auf unentdeckte Mikrometastasen oder De-novo-Krebs zurückzuführen, der möglicherweise durch eine postoperative Leberregeneration ausgelöst wird. Frühere Forschungen verwendeten HCC-Zelllinien in orthotopen Modellen, um die Auswirkungen der Leberregeneration zu untersuchen, aber ihre begrenzte Validität führte dazu, dass ein repräsentativeres Modell erforderlich wurde. Hier stellen wir einen neuartigen Ansatz vor, bei dem patienteneigene HCC-Organoide verwendet werden, um den Einfluss der Leberregeneration auf HCC zu untersuchen.

Tumorgewebe von Patienten wird zu Tumororganoiden verarbeitet, in eine dreidimensionale Basalmembranmatrix eingebettet und in einem leberspezifischen Medium kultiviert. Eine Million Organoide werden in den rechten oberen Lappen (RSL) immundefizienter Mäuse injiziert, was das makroskopische Tumorwachstum durch Sonographie bestätigt. Die Interventionsgruppe wird einer Resektion des linken lateralen Lappens (LLL) (30 % des gesamten Lebervolumens) oder zusätzlich des Mittellappens (ML) (65 % des gesamten Lebervolumens) unterzogen, um die Leberregeneration innerhalb der Tumorstelle zu induzieren. In der Kontrollgruppe kommt es zu einer erneuten Laparotomie ohne Lebergeweberesektion. Nach 2 Wochen werden beide Gruppen einer Tumor- und Normalgewebeexplantation unterzogen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses patienteneigene HCC-Organoidmodell eine robuste Plattform bietet, um die Auswirkungen der Leberregeneration nach einer Krebsresektion zu untersuchen. Seine multizelluläre Zusammensetzung, genetische Vielfalt und seine verlängerten Kulturmöglichkeiten machen es zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Untersuchung von HCC-Rezidivmechanismen und möglicher Interventionen.

Einleitung

Ein Rezidiv nach der Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) ist eine große Herausforderung, von der über 70 % der Patienten betroffen sind, die sich einer chirurgischen Resektion unterziehen ^1,2,3. Dieses Rezidiv kann auf unerkannte Mikrometastasen (multizentrischer Tumor) oder die Entwicklung von De-novo-Krebs zurückzuführen^{sein 4}. Sowohl klinische als auch experimentelle Untersuchungen deuten darauf hin, dass der durch die chirurgische Resektion ausgelöste Leberregenerationsprozess latente Mikrometastasen aktivieren und so zum Wiederauftreten des Tumors beitragen könnte.

Weitere Forschung ist notwendig, um die Gen- und Proteinexpression in normalen und bösartigen Leberzellen in einer regenerativen Leberumgebung zu vergleichen. Neben der Aufklärung der Mechanismen, die dem Rezidiv zugrunde liegen, birgt die Identifizierung zielgerichteter Signalwege, die spezifisch für Krebszellen sind, das Potenzial für erhebliche therapeutische Fortschritte. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die scheinbar widersprüchlichen Vorstellungen von einer Anti-Tumor-Mikroumgebung und günstigen Bedingungen für die Leberregeneration in Einklang zu bringen.

Frühere Modelle haben die orthotope Injektion von HCC-Zelllinien verwendet, um den Einfluss der Leberregeneration zu untersuchen⁵. Dieses bahnbrechende Modell verwendet vom Patienten stammende HCC-Organoide und bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Zelllinien. Organoide behalten vielfältige Zellpopulationen bei und spiegeln im Gegensatz zu Zelllinien und Sphäroiden die Struktur und Funktion der Modellvorlage wider. Ihre genetische Vielfalt erhöht die Repräsentativität. Darüber hinaus bieten Organoide Stabilität für längere Kulturen, was langwierige Interventionsstudien ermöglicht. Wir empfehlen die RSL-Injektion aufgrund ihres überlegenen Regenerationspotenzials im Vergleich zum rechten unteren Lappen (RIL). Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform unter Verwendung von Krebsorganoiden mit ausgeprägten Vorteilen gegenüber Krebszelllinien, um die oben genannte Forschungsfrage zu untersuchen.

Protokoll

Leberproben, die für die Organoid-Erzeugung verwendet werden, wurden von Patienten entnommen, die am Universitätsspital Basel (USB) nach schriftlicher Einverständniserklärung und Genehmigung der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz (BASEC-Nummer 2019-02118) operiert wurden. Alle Mausversuche wurden von der Tierschutzkommission des Kantons Basel-Stadt, Schweiz, (3123-33896) genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt. Alle Mäuse waren vom nicht-adipösen diabetischen (NOD) SCID-Gamma-Mausstamm und daher genetisch verändert, um immunsupprimiert zu sein; Es wurden ausschließlich männliche Tiere verwendet. In Tabelle 1 und Tabelle der Materialien finden Sie Einzelheiten zu Lösungen, Reagenzien, Materialien und Instrumenten, die im Protokoll verwendet werden. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über das Experiment.

1. Haltung von Mäusen

1. Zucht und Pflege von Mäusen in der Tieranlage unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen nach einem 12-Stunden-Tages- und 12-Stunden-Nachtplan mit ad libitum Zugang zu Futter und Trinkwasser.
   HINWEIS: Die Implantation der Organoide erfolgt im Alter von 6-8 Wochen.

2. Patienten- und klinische Proben

1. Legen Sie 12-, 24- und 6-Well-Platten bei 37 °C in den Inkubator, bevor Sie beginnen. Wenn möglich, tun Sie dies 1 Tag im Voraus.
   1. Sammeln Sie das Gewebe innerhalb von 1 h nach der Resektion in RPMI 1640 Medium und transportieren Sie es ins Labor, um den Dissoziationsprozess sofort zu starten. Legen Sie das Gewebe in eine 10 cm große Petrischale (vorgewärmte Schale) und fügen Sie eine ausreichende Menge steriler Kochsalzlösung hinzu, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden.
2. Dissoziation von Leberkrebsgewebe zur Erzeugung von Organoiden
   1. Zerkleinern Sie das Gewebe mit Hilfe von Skalpellen in kleine Fragmente von 1-2 mm² . Verwenden Sie eine zusätzliche Gewebezange, um das Gewebe zu stabilisieren, falls das Schneiden schwierig ist.
   2. Legen Sie die Gewebestücke in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 mL Dissoziationspuffer (physiologischer pH-Wert). Bei 37 °C (Wärmeschrank/Inkubator) in eine Rotationsvorrichtung stellen.
   3. Mischen Sie, indem Sie alle 10 Minuten pipettieren und ca. 1-1,5 Stunden einwirken lassen, wobei Sie den Mischvorgang alle 10 Minuten wiederholen.
      HINWEIS: Beim Mischen muss möglicherweise das Ende der Pipette abgeschnitten werden, um den Öffnungsdurchmesser zu vergrößern und so zu verhindern, dass übergroßes Gewebe in der Pipettenspitze stecken bleibt.
   4. Sammeln Sie 10 μl des Zelldissoziationspuffergemisches aus Schritt 2.2.3 in einem 0,5-ml-Kunststoffröhrchen, fügen Sie 10 μl Trypanblau hinzu und verwenden Sie den automatisierten Zellzähler, um die Zellviabilität und die Zellcluster zu beurteilen. Wenn Cluster sichtbar sind, wiederholen Sie den Mischvorgang (Schritt 3.3.); Andernfalls fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
   5. Nehmen Sie ein 50-ml-Röhrchen, legen Sie ein 100-μm-Zellsieb darauf und leiten Sie die Mischung hindurch. Zerkleinern Sie mit dem Kolben einer 5-ml-Spritze alle verbleibenden Gewebefragmente durch den Filter. Waschen Sie alles mit 5 mL Ad-DF+++ und achten Sie darauf, den Tropfen vom Boden des Filters aufzufangen.
   6. Übertragen Sie das Filtrat in ein konisches 15-ml-Röhrchen. 15 min bei 300 × g zentrifugieren.
   7. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu berühren. Fügen Sie 5 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   8. 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 1 ml fortgeschrittenem Medium.
3. Zählen von Zellen und Beurteilung der Lebensfähigkeit von Zellen
   1. Geben Sie 10 μl Trypanblau in ein 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie es mit 10 μl der Zellsuspension. Geben Sie 10 μl der Mischung auf die Zählobjektträger und zählen Sie die Zellen.
   2. Die für die Organoiderzeugung erforderliche Anzahl von Zellen trennen und 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Im Allgemeinen werden 80.000 Zellen pro Dome und 20 μl Basalmembranmatrix pro Dome ausgesät (10 Tropfen pro Well pro 6-Well-Platte).
   3. Wenn überschüssige Zellen in Suspension verbleiben, suspendieren Sie das Pellet in Zellsuspensions-Gefriermedium (10 % DMSO in FBS), überführen Sie es in ein Kryoröhrchen und legen Sie es in einen Gefrierbehälter. Stellen Sie die Tube sofort über Nacht in einen -80 °C Gefrierschrank. Am nächsten Tag bis zur Verwendung in flüssigen Stickstoff umfüllen.
4. Beschichtung für die Organoiderzeugung
   1. Entfernen Sie den Überstand. Stellen Sie das Rohr auf Eis und suspendieren Sie das Pellet mit einer Basalmembranmatrix.
   2. Nehmen Sie die vorgewärmte Platte aus dem Inkubator (über Nacht vorgewärmt). Machen Sie kleine Tropfen in die Platte (20 μl Basalmembranmatrix pro Kuppel [10 Tropfen pro Vertiefung]). Drehen Sie die Platte um und lassen Sie die Platte 5 Minuten lang im Durchflussschrank.
   3. Nach 5 Minuten stellen Sie die Platte in den 37 °C heißen Inkubator und lassen Sie die Platte ~20 Minuten lang stehen, damit sich die Matrize verfestigen kann. 2 ml Organoid-Nährmedium^{zugeben 6,7}.
5. Aufrechterhaltung der Organoidkultur
   1. Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage. Sobald die Organoide in der Basalmembran-Matrixkuppel konfluent und bereit für die Expansion sind, berechnen Sie das Spaltungsverhältnis, z. B. 2x oder 3x, entsprechend.
      HINWEIS: Notieren Sie diese Informationen; Es wird in den nächsten Schritten benötigt werden.
   2. Entfernen Sie das Medium mit einer P1000-Spitze aus der Ecke der Vertiefung und achten Sie darauf, die Matrixkuppeln nicht zu berühren.
   3. Fügen Sie 100 μl 0,25 % Trypsin-EDTA pro Dome hinzu, kratzen Sie es ab, sammeln Sie es in einem 15-ml-Röhrchen und geben Sie erneut eine kleine Menge Trypsin in die Vertiefung, um alles zu sammeln. Pipettieren Sie es ~10x.
   4. 3 min im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren und 10x pipettieren, um die Zellen mit einer P1000-Spitze zu dissoziieren. Wiederholen Sie diesen Schritt alle 3 Minuten für maximal 10 Minuten.
   5. Fügen Sie mindestens das gleiche Volumen von Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM)/10% Fetalem Rinderserum (FBS)/1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin) Medium hinzu und mischen Sie es langsam 2x auf- und ab. Füllen Sie DPBS auf.
   6. Bei 300 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Resuspendieren Sie gemäß dem Spaltungsverhältnis, das auf der Grundlage der organoiden Konfluenz festgelegt wurde, z. B. 2x oder 3x die ursprüngliche Menge der Basalmembranmatrix.
   7. Nehmen Sie die vorgewärmte Platte aus dem Inkubator (über Nacht vorgewärmt). Machen Sie kleine Tropfen in die Platte (20 μl Basalmembranmatrix pro Kuppel [10 Tropfen pro Vertiefung]). Drehen Sie die Platte um und lassen Sie die Platte 5 Minuten lang im Durchflussschrank.
   8. Nach 5 min stellen Sie die Platte in den 37 °C heißen Inkubator. Lassen Sie die Platte ~20 Minuten lang stehen, damit sich die Matrize verfestigen kann. Fügen Sie 2 ml Organoid-Nährmedium hinzu.
6. Vorbereitung von Organoiden zur Herstellung eines formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Blocks
   1. Entfernen Sie das Medium mit einer P1000-Spitze aus der Ecke der Vertiefung und achten Sie darauf, die Matrixkuppeln nicht zu berühren. Fügen Sie 200 μl Dispase (2 mg/ml) hinzu und brechen Sie die Tropfen mit einer P1000-Pipettenspitze auf. 80 Minuten im Inkubator ruhen lassen.
   2. Geben Sie 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in die Vertiefung, geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen und füllen Sie es mit DPBS. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 × g , aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL mit 4 % Paraformaldehyd. Mindestens 1 h kühl stellen.
   3. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 × g, aspirieren Sie das Paraformaldehyd und resuspendieren Sie das Pellet mit dem Probenverarbeitungsgel, um einen Tropfen zu erzeugen. Warten Sie 40 Minuten, bis sich die Tropfen verfestigt haben. Geben Sie den Geltropfen mit den Zellen in eine Histologiekassette. Bewegen Sie die Kassette zum Dehydratisieren und betten Sie sie anschließend in Paraffin ein, um sie zu schneiden und H/E-Färbung^{zu erzeugen 8,9}.
7. Vorbereitung von Organoiden für die Injektion
   1. Nehmen Sie die Platte mit dem wachsenden Organoid aus dem Inkubator und stellen Sie sie in den Durchflussschrank.
   2. Führen Sie die Schritte 2.5.2 bis 2.5.4 aus.
   3. 2 mL DMEM hinzufügen und mischen.
   4. Geben Sie 10 μl Trypanblau in ein 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie es mit 10 μl Zellsuspension.
   5. Geben Sie 10 μl der Mischung auf die Zählobjektträger und zählen Sie die Zellen. Berechnen Sie die durchschnittliche Zellzahl beider Kammern. Wenn der Unterschied zwischen den beiden Kammern zu groß ist, sollten Sie die Zählung wiederholen.
   6. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das für 10⁶ Zellen erforderlich ist, und geben Sie dieses Volumen auf 1,5 ml-Röhrchen ab. Bei 300 × g 5 min zentrifugieren und die Röhrchen auf Eis legen.
   7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie 5 μl DMEM und 5 μl Basalmembranmatrix hinzu. Mischen Sie die Suspension vorsichtig durch Pipettieren, während Sie die Suspension während des Vorgangs kalt halten.
   8. Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Organoiden während des Transports zu den Mäusen auf Eis und fahren Sie mit der Injektion fort.

3. Injektion von Organoiden in die Maus

1. Perioperative Schritte
   1. Nehmen Sie das Versuchstier aus dem Hauptkäfig und setzen Sie es in einen isolierten, frischen Käfig mit Wasser.
   2. Betäuben Sie die Maus mit 1,5 % bis 2,5 % Isofluran.
   3. Führen Sie 30 Minuten vor Beginn der Operation eine subkutane Injektion von 10 μl Buprenorphin (0,3 mg/ml) in den Hals durch.
   4. Unmittelbar vor Beginn der Operation die Augen der Tiere vorsichtig mit Carbomerum (z. B. Lacrinorm) einmalen, um ein Austrocknen der Augen während der Operation zu vermeiden. Berühren Sie die Hornhaut während der Anwendung nicht, um eine Erosion der Hornhaut zu vermeiden.
   5. Legen Sie die Tiere auf eine saubere und sterile Oberfläche und behandeln Sie sie mit frischen Plastikhandschuhen, Haarnetz und einem speziellen Laborkittel, der nur in der Mäuseanlage verwendet wird.
   6. Verwenden Sie zwei wärmeabgebende Scheinwerfer in der Nähe des Tieres, um eine ausreichende Sicht zu gewährleisten. Wenn Zweifel oder Bedenken hinsichtlich einer Unterkühlung während der Operation bestehen, verwenden Sie eine andere Heizlampe oder Heizmatte.
2. Laparotomie
   HINWEIS: Vor Beginn des chirurgischen Eingriffs wurde die Tiefe der Anästhesie durch den Zehenquetschtest überprüft. Während des Eingriffs wurde eine angemessene Anästhesie durch Routinekontrollen und Überwachung der Atemfrequenz gewährleistet und bei einem relevanten Anstieg angepasst. Die OP-Geräte wurden nach den hauseigenen Richtlinien unserer Tierhaltung gereinigt und desinfiziert.
   1. Bringen Sie die betäubte Maus in Rückenlage, strecken Sie die vier Extremitäten aus und fixieren Sie sie mit Klebeband. Entfernen Sie das Fell, indem Sie eine Enthaarungscreme auftragen, und verwenden Sie ein feuchtes Tuch, um die überschüssige Creme und das Fell zu entfernen.
      HINWEIS: Die Enthaarung funktioniert am besten, wenn die Creme mit einem Wattestäbchen gegen den Strich in das Fell einmassiert wird.
   2. Lokalisieren Sie die Linea alba, die das Ziel für die Laparotomie ist. Identifizieren Sie auch die oberen und unteren Magenarterien. Achten Sie darauf, die Gefäße nicht zu beschädigen, um Verletzungen zu vermeiden.
   3. Machen Sie mit einer Pinzette und einer mikrochirurgischen Schere einen Schnitt entlang der Linea alba vom Unterbauch bis zum Xiphoidknorpel.
   4. Setzen Sie die Retraktoren ein und stellen Sie die Zugrichtung ein, um den Oberbauch optimal freizulegen (Abbildung 2A,B).
      HINWEIS: Wir verwenden gebogene Büroklammern als Retraktoren mit angebrachten Gummibändern zur Fixierung.
3. Injektion von Organoiden
   1. Legen Sie eine saubere Serviette direkt neben den Schnitt und geben Sie einige Tropfen Kochsalzlösung darauf. Äußere den Dünndarm und den Blinddarm und lege ihn auf die nasse Serviette.
   2. Legen Sie den rechten oberen Lappen (RSL) frei, bis eine Injektion möglich ist.
   3. Bereiten Sie die Hamilton-Spritze vor, spülen Sie sie mit Wasser ab und setzen Sie eine Markierung 2-3 mm von der Spitze entfernt als Referenz für die Injektion.
   4. Ziehen Sie die Spritze mit der vorbereiteten Organoidmischung auf und injizieren Sie die Nadel bis zur Markierung. Injizieren Sie die Organoide langsam in einer stabilen Position; Bewegen Sie die Nadel während dieser Zeit nicht.
   5. Warten Sie 15-20 s, um einen Rückfluss der Mischung zu vermeiden. Entfernen Sie die Nadel und üben Sie mit einem Wattestäbchen etwas Druck auf die Injektionsstelle aus. Untersuchen Sie den Bauch auf einen Riss des Leberlappens und einen Rückfluss. Spülen Sie den Bauch mit 0,5 ml steriler Kochsalzlösung und verschließen Sie den Bauch mit einer Laufnaht mit einer resorbierbaren Naht.
      HINWEIS: Die Operationsstelle wurde mit einem sterilen Tuch abgedeckt. Die chirurgischen Instrumente, die während des Eingriffs verwendet wurden, wurden hauptsächlich mit Wasser und Reinigungsmitteln gereinigt, um makroskopische Reste zu entfernen. Anschließend wurden die Instrumente in einer Sterilisationslösung aufbereitet. Verbrauchsmaterialien wie Fäden, Handschuhe oder Wattestäbchen wurden aus hygienischen Gründen nur einmal verwendet und waren steril.

4. Kleinere Resektion (30% des Lebergewebes)

1. Führen Sie die Laparotomie wie oben in Schritt 3.2 beschrieben durch.
2. Verwenden Sie feuchte Wattestäbchen und schieben Sie das ML nach vorne, um mehr Platz im Operationsfeld des LLL zu schaffen.
3. Drehen Sie die LLL kranial um und legen Sie den Schwanzlappen (CL) und das Band frei, die üblicherweise zwischen CL und LLL vorhanden sind (Abbildung 2C).
4. Schneiden Sie das Band komplett ab und führen Sie die Ligatur (nicht resorbierbarer dünner Faden, z.B. Prolene 5-0) unterhalb des LLL ein. Um sicherzustellen, dass es in dieser Position bleibt, befeuchten Sie die Ligatur und bewegen Sie sie in Richtung des rechten oberen Quadranten.
5. Drehen Sie die LLL kaudal um. Führen Sie das linke freie Ende der Ligatur um die linke Spitze des LLL. Führen Sie das rechte freie Ende der Ligatur um die rechte Spitze des LLL. Wenden Sie mit einem Wattestäbchen eine kaudale Traktion auf das LLL an und sorgen Sie für die korrekte und zentrale Positionierung der Ligatur.
6. Binde einen doppelten halben Knoten. Sichern Sie den Knoten mit einem zweiten halben Knoten, der in die andere Richtung gebunden wird, ohne ihn vollständig festzuziehen. Ziehen Sie die Knoten etwas fest, überprüfen Sie die korrekte Platzierung der Ligatur und positionieren Sie sie neu, um eine gute Positionierung zu gewährleisten.
7. Ziehen Sie den Knoten vollständig fest, indem Sie das kraniale freie Ende mit einer stumpfen Pinzette in Position halten und mit einer weiteren Pinzette am kaudalen freien Ende ziehen (Abbildung 2D). Befestigen Sie den Knoten mit einem zweiten halben Knoten, der in die entgegengesetzte Richtung gebunden wird.
8. Sezieren Sie den Leberlappen. Schneiden Sie nahe an der Ligatur, ohne sie zu schneiden.

5. Große Resektion (65 % des Lebergewebes)

1. Führen Sie die kleinere Resektion der LLL wie oben beschrieben durch (Schritte 3.4.1-3.4.8).
2. Durchschneiden Sie das falciforme Band, um das ML zu mobilisieren. Drehen Sie den Lappen kranial um. Führen Sie die Ligatur unterhalb des Lappens ein und drehen Sie den Lappen kaudal.
3. Schlinge die freien Enden um den Läppchen. Wiederholen Sie die Platzierung der Ligatur im Falle einer Fehlplatzierung während der Manipulation. Sobald die Ligatur richtig positioniert ist, setzen Sie einen doppelten halben Knoten, binden Sie ihn langsam und positionieren Sie die Ligatur bei Bedarf neu.
4. Binde einen zweiten halben Knoten in die entgegengesetzte Richtung und ziehe ihn vollständig fest. Einen dritten halben Knoten in die entgegengesetzte Richtung anbringen.
5. Schneiden Sie den Lappen erneut.
6. Spülen Sie den Bauch mit steriler Kochsalzlösung und legen Sie den Darm an seinen anatomischen Platz.

6. Verschluss des Bauches

1. Fassen Sie die Haut und das Bauchfell mit einer Pinzette und machen Sie einen Stich mit einer resorbierbaren Naht (z. B. Monocryl 5-0) am oberen Ende der Schnittlinie. Achten Sie darauf, dass Sie auf der Peritonealseite austreten.
2. Führen Sie den zweiten Stich an der Gegenseite des Schnitts aus und treten Sie auf der Hautseite aus. Den Knoten fest binden, dabei das freie Ende ohne Nadel kurz und das Ende mit der Nadel lang lassen. Schneiden Sie das kurze Ende auf eine Länge von 2 mm ab.
3. Setzen Sie die laufende Naht fort und schließen Sie mit einem Knoten am unteren Ende des Schnitts ab.
4. Reinigen Sie den Bauch der Maus von Blutresten.

7. Postoperative Pflege

1. Nach dem Verschluss des Bauches injizieren Sie weitere 10 μl Buprenorphin (0,3 mg/ml) subkutan in den Hals. Setzen Sie die Tiere in den zuvor genutzten, isolierten Käfig, teilweise auf einer Heizmatte platziert. Stellen Sie etwas leicht zugängliches Futter auf dem Boden des Käfigs bereit.
   HINWEIS: Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder zu Bewusstsein gekommen ist.
2. Führen Sie postoperative Kontrollen 2 h und 6 h nach der Operation durch. Beobachten Sie das Verhalten genau und achten Sie besonders auf Anzeichen von Schmerzen. Bei Bedarf weitere 10 μl Bupivacain verabreichen.
3. Sobald sich die Maus vollständig erholt hat, jedoch nicht früher als 6 Stunden nach der Operation und nicht später als 24 Stunden nach der Operation, setzen Sie sie wieder in den Hauptkäfig ein. Überwachen Sie das Verhalten aller beteiligten Tiere in Bezug auf Aggressionen oder anderes verdächtiges Verhalten genau. Wenn Sie Zweifel an einer postoperativen Schwäche des Tieres haben, lassen Sie es über Nacht isoliert, damit es sich bis zur endgültigen Wiedereinführung erholen kann.
4. Nach der letzten postoperativen Kontrolle 1 Tag nach der Operation fahren Sie mit dem regelmäßigen Wiegen der Tiere fort.
   HINWEIS: Die Analgesie wurde 4 und 8 Stunden postoperativ verabreicht. Eine weitere Überwachung wurde 12, 24 und 48 Stunden postoperativ durchgeführt, und die Mäuse wurden auf jegliche Art von Schmerzen oder Beschwerden untersucht. Wenn Anzeichen von Schmerzen beobachtet wurden, wurde eine weitere Dosis Buprenorphin verabreicht.

8. Überwachung des Tumorwachstums

1. Immobilisieren Sie die Mäuse mit Isofluran-Anästhesie und verwenden Sie die Sonographie, um die Tumorimplantation ab 2 Wochen nach der Injektion sichtbar zu machen¹⁰.
2. Euthanasieren Sie die Mäuse mit CO₂.

Ergebnisse

Wir untersuchten den Beitrag der einzelnen Leberlappen zum Gesamtlebervolumen und stellten fest, dass die LLL 33% des gesamten Lebervolumens ausmacht. Der ML macht 32 % des gesamten Lebervolumens aus, der RSL 13 %, der RIL 10 % und der CL 10 % (Tabelle 2). Die Boxplots zeigen, dass der relative Beitrag der Leberlappen zwischen den verschiedenen Mäusen desselben Stammes vergleichbar ist (Abbildung 3B). Eine Resektion der LLL führt also zu e...

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll
Anästhesie bei Mäusen
Ziel der Anästhesie ist es, die Maus sicher in einen Zustand zu versetzen, in dem sie chirurgische Eingriffe toleriert. Gleichzeitig sollte die Wirkung der Anästhesie nicht zu stark sein, um einen Herz-Lungen-Stillstand und den daraus resultierenden Tod zu verhindern. Die Inhalationsanästhesie ist einfacher zu dosieren, so dass der Forscher die Dosis anpassen kann, indem er die Durchflussr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817