肝臓再生が腫瘍増殖に及ぼす影響を調査するための肝細胞癌患者由来オルガノイド異種移植モデル

要約

患者の腫瘍から生成されたオルガノイドをマウスの肝臓に同所的に注入します。非腫瘍性肝組織の切除は、腫瘍が位置する肝臓組織に再生環境をもたらします。

要約

肝細胞がん(HCC)治療後の再発は顕著な課題であり、外科的切除を受ける患者の70%以上が罹患しています。再発は、未検出の微小転移または de novo 癌に起因し、術後の肝臓再生によって引き起こされる可能性があります。これまでの研究では、肝臓再生の影響を研究するために同所性モデルにHCC細胞株が使用されていましたが、その有効性が限られているため、より代表的なモデルが必要とされていました。ここでは、患者由来のHCCオルガノイドを利用して、肝臓の再生がHCCに及ぼす影響を調べる新しいアプローチを紹介します。

患者の腫瘍組織をプロセシングして腫瘍オルガノイドを作製し、三次元の基底膜マトリックスに包埋し、肝臓特有の培地で培養します。免疫不全マウスの右上葉(RSL)に100万個のオルガノイドを注入し、超音波検査により肉眼的腫瘍の増殖を確認します。介入群は、左側葉 (LLL) (総肝臓容積の 30%) またはさらに中葉 (ML) (総肝臓容積の 65%) の切除を受け、腫瘍部位内の肝臓再生を誘導します。対照群は、肝臓組織切除を伴わない再開腹術を経験します。2週間後、両方のグループが腫瘍と正常組織の摘出を受けます。

結論として、この患者由来のHCCオルガノイドモデルは、がん切除後の肝臓再生の影響を調査するための堅牢なプラットフォームを提供します。その多細胞組成、遺伝的多様性、および長期にわたる培養能力により、HCCの再発メカニズムと潜在的な介入を研究するための非常に貴重なツールとなっています。

概要

肝細胞がん(HCC)治療後の再発は重大な課題であり、外科的切除を受ける患者の70%以上が罹患しています^1,2,3。この再発は、検出されない微小転移(多中心性腫瘍)またはde novo癌⁴の発生に起因する可能性があります。臨床的研究と実験的研究の両方で、外科的切除によって引き起こされる肝臓再生プロセスが潜在性微小転移を活性化し、腫瘍の再発に寄与する可能性があることが示唆されています。

再生肝臓環境内の正常肝細胞と悪性肝細胞における遺伝子とタンパク質の発現を比較するには、さらなる研究が必要です。再発の根底にあるメカニズムを解明するだけでなく、がん細胞に特異的な標的となるシグナル伝達経路を特定することは、治療の大幅な進歩の可能性を秘めています。このアプローチは、抗腫瘍微小環境と肝臓再生に好ましい条件という一見矛盾する概念を調和させることを目的としています。

以前のモデルでは、肝細胞株の同所性注射を使用して、肝臓再生の影響を調査していました⁵。この先駆的なモデルは、患者由来のHCCオルガノイドを採用しており、従来の細胞株に比べていくつかの利点があります。オルガノイドは、細胞株やスフェロイドとは異なり、モデルテンプレートの構造と機能を反映して、多様な細胞集団を維持します。彼らの遺伝的多様性は代表性を高めます。さらに、オルガノイドは長期培養に安定性を提供し、長期にわたる介入研究を可能にします。RSL注射は、右下葉(RIL)に比べて再生能が優れているため、推奨します。ここで説明する方法は、がん細胞株と比較して顕著な利点を持つがんオルガノイドを使用して、前述の研究課題を調査するためのプラットフォームを提供します。

プロトコル

オルガノイド生成に使用した肝臓サンプルは、バーゼル大学病院(USB)で手術を受けた患者から、北西部・中央スイス倫理委員会(BASEC番号2019-02118)の承認に基づく書面によるインフォームドコンセントに基づいて採取しました。すべてのマウス実験は、スイスのカントン・バーゼル・シュタットの動物管理委員会(3123-33896)のガイドラインおよび規制によって承認され、それに従って実施されました。すべてのマウスは非肥満糖尿病(NOD)SCIDガンママウス系統であったため、免疫抑制されるように遺伝子改変されました。オスの動物のみを使用しました。プロトコールで使用される溶液、試薬、材料、および機器に関連する詳細については、 表1 および 材料表 を参照してください。実験の概要については、 図 1 を参照してください。

1.マウス飼育

1. 特定の病原体のない条件下で、昼12時間、夜間12時間のスケジュールで動物施設でマウスを繁殖および維持し、餌と飲料水に 自由 にアクセスできます。
   注:オルガノイドの移植は6〜8週齢で行われます。

2. 患者および臨床サンプル

1. 開始する前に、12ウェル、24、および6ウェルプレートをインキュベーターに37°Cで配置します。可能であれば、これを1日前に行ってください。
   1. 切除後1時間以内に組織をRPMI 1640培地に集め、研究室に輸送してすぐに解離プロセスを開始します。ティッシュを10cmのシャーレ(予熱皿)に入れ、ティッシュが乾燥しないように十分な量の滅菌生理食塩水を加えます。
2. オルガノイドの生成のための肝臓がん組織解離
   1. メスを使用して、組織を1〜2 mm² の小さな断片に細かく刻みます。切断が困難な場合に備えて、組織を安定させるために追加の組織鉗子を使用してください。
   2. 組織片を5 mLの解離バッファー(生理的pH)を入れた15 mLのチューブに入れます。37°C(加温キャビネット/インキュベーター)に回転装置に入れます。
   3. 10分ごとにピペッティングして混合し、約1〜1.5時間放置し、10分ごとに混合プロセスを繰り返します。
      注:混合するには、オリフィスの直径を大きくするためにピペットの端を切断する必要がある場合があります。これにより、特大の組織がピペットの先端に詰まるのを防ぎます。
   4. ステップ 2.2.3 の細胞解離バッファー混合物 10 μL を 0.5 mL プラスチックチューブに集め、10 μL の Trypan Blue を添加し、自動セルカウンターを使用して細胞生存率と細胞クラスターを評価します。クラスターが表示されている場合は、混合プロセスを繰り返します(手順3.3)。それ以外の場合は、次の手順に進みます。
   5. 50mLのチューブを取り、上部に100μmのセルストレーナーを置き、ミックスを通します。5mLシリンジのプランジャーで、残りの組織片をすべてフィルターで粉砕します。5mLのAd-DF+++ですべてを洗い、フィルターの底から滴を集めるようにしてください。
   6. ろ液を15mLのコニカルチューブに移します。300 × gで15分間遠心分離します。
   7. ペレットに触れないように注意しながら、上澄みを慎重に吸引します。5 mLの赤血球溶解バッファーを加えます。室温で5〜10分間インキュベートします。
   8. 300 × gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、1 mLの高度な培地に再懸濁します。.
3. 細胞のカウントと細胞生存率の評価
   1. 1.5 mLのチューブに10 μLのトリパンブルーを加え、10 μLの細胞懸濁液と混合します。10 μLの混合物を計数スライドに置き、細胞を計数します。
   2. オルガノイドの生成に必要な数の細胞を分離し、300 × gで5分間遠心分離します。一般に、ドームあたり80,000個の細胞とドームあたり20μLの基底膜マトリックスを播種します(6ウェルプレートあたりウェルあたり10滴)。
   3. 余分な細胞が懸濁液中に残っている場合は、ペレットをCell Suspension Freezing培地(FBS中の10% DMSO)に懸濁し、クライオチューブに移して凍結容器に入れます。すぐにチューブを-80°Cの冷凍庫に一晩移します。翌日、必要になるまで液体窒素に移します。
4. オルガノイド生成のためのめっき
   1. 上清を取り除きます。チューブを氷の上に置き、ペレットを基底膜マトリックスで再懸濁します。
   2. 温めたプレートをインキュベーターから取り出します(一晩温めておきます)。プレートに小さな滴を垂らします(ドームあたり20μLの基底膜マトリックス[ウェルあたり10滴])。プレートを反転させ、プレートをフローキャビネットに5分間放置します。
   3. 5分後、プレートを37°Cインキュベーターに移し、プレートを~20分間放置して、マトリックスが固化するまで待ちます。オルガノイド培地^6,7を2 mL加えます。
5. オルガノイド培養の維持
   1. 2日ごとにメディウムを交換してください。オルガノイドが基底膜マトリックスドーム内でコンフルエントになり、拡張の準備ができたら、それに応じて分裂率(2倍または3倍など)を計算します。
      注:この情報を記録します。これは、次の手順で必要になります。
   2. P1000チップを使用して、マトリックスドームに触れないように注意しながら、ウェルの角から培地を取り出します。
   3. ドームあたり100 μLの0.25%トリプシン-EDTAを加え、こすり落とし、15 mLチューブに集め、再び少量のトリプシンをウェルに加えてすべてを回収します。ピペットで~10回。
   4. 37°Cの水浴で3分間インキュベートし、10回ピペットで細胞をP1000チップで解離します。この手順を 3 分ごとに最大 10 分間繰り返します。
   5. 少なくとも同量のダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)/ 10%ウシ胎児血清(FBS)/ 1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ペン-連鎖球菌)培地を追加し、ゆっくりと2倍に混ぜます。.DPBSをいっぱいにします。
   6. 300 × g で5分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。オルガノイドのコンフルエンシーに基づいて決定された分割率(例えば、基底膜マトリックスの初期量の2倍または3倍)に従って再懸濁します。
   7. 温めたプレートをインキュベーターから取り出します(一晩温めておきます)。プレートに小さな滴を垂らします(ドームあたり20μLの基底膜マトリックス[ウェルあたり10滴])。プレートを反転させ、プレートをフローキャビネットに5分間放置します。
   8. 5分後、プレートを37°Cインキュベーターに移します。プレートを~20分間放置し、マトリックスが固化するまで待ちます。オルガノイド培地2mLを加えます。
6. ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックを作製するためのオルガノイドの調製
   1. P1000チップを使用して、マトリックスドームに触れないように注意しながら、ウェルの角から培地を取り出します。200 μLのディスパーゼ(2 mg/mL)を加え、P1000ピペットチップで滴下を中断します。インキュベーターに80分間放置します。
   2. 2 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)をウェルに加え、15 mLのコニカルチューブに移し、DPBSで満たします。300 × g で5分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを1 mLの4%パラホルムアルデヒドに再懸濁します。少なくとも1時間冷蔵します。
   3. 300 × gで5分間遠心分離し、パラホルムアルデヒドを吸引し、ペレットを試料処理ゲルで再懸濁して滴下します。液滴が固まるまで40分待ちます。細胞を含むゲル滴を組織学カセットに入れます。カセットを動かして脱水し、その後パラフィンに埋め込んでカッティングとH/E染色を行います^8,9。
7. 注射用オルガノイドの調製
   1. 成長するオルガノイドが入ったプレートをインキュベーターから取り出し、フローキャビネットに置きます。
   2. 手順 2.5.2 から 2.5.4 に従います。
   3. DMEMを2mL加えて混合します。
   4. 1.5 mLのチューブに10 μLのトリパンブルーを加え、10 μLの細胞懸濁液と混合します。
   5. 10 μLの混合物を計数スライドに置き、細胞を計数します。両方のチャンバーの平均細胞数を計算します。2 つのチャンバー間の差が大きすぎる場合は、カウントをやり直すことを検討してください。
   6. 10^{個の 6} 個の細胞に必要な細胞懸濁液の量を計算し、この量を 1.5 mL チューブに分注します。300 × g で5分間遠心分離し、チューブを氷の上に置きます。
   7. 上清を慎重に取り除き、5 μL の DMEM と 5 μL の基底膜マトリックスを加えます。プロセス中は懸濁液を冷たく保ちながら、ピペッティングで懸濁液を慎重に混合します。
   8. オルガノイドを含む1.5 mLチューブをマウスへの輸送中に氷上に置いて、注射を進めます。

3. オルガノイドのマウスへの注入

1. 周術期のステップ
   1. 実験動物をメインケージから取り出し、水を入れた隔離された新鮮なケージに入れます。
   2. マウスに1.5%から2.5%のイソフルランを麻酔します。
   3. 手術開始の30分前に、10μLのブプレノルフィン(0.3 mg / mL)を首に皮下注射します。.
   4. 手術開始直前に、動物の目をCarbomerum(Lacrinormなど)で慎重に塗装し、手術中の目の乾燥を防ぎます。角膜の侵食を避けるために、塗布中は角膜に触れないでください。.
   5. 動物を清潔で無菌の表面に置き、新鮮なプラスチック手袋、ヘアネット、およびマウス施設でのみ使用される特別な実験室用作業コートで取り扱います。
   6. 動物の近くに2つの熱放射ヘッドライトを使用して、十分な視界を確保します。手術中に低体温症に疑問や懸念がある場合は、別のヒーティングランプまたはヒーティングマットを使用してください。
2. 開腹
   注:外科的処置を開始する前に、つま先のピンチテストによって麻酔の深さを確認しました。処置中、定期的なチェックと呼吸数のモニタリングを通じて適切な麻酔が提供され、関連する増加がある場合は調整されました。手術器具は、動物施設の社内ガイドラインに従って洗浄・消毒されました。
   1. 麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、四肢を伸ばしてテープで固定します。脱毛クリームを塗って毛皮を取り除き、ウェットティッシュを使用して余分なクリームと毛皮を取り除きます。
      注:脱毛は、綿棒を使用してクリームを毛皮にマッサージし、木目に対して行うと最適に機能します。
   2. 開腹術のターゲットであるlinea albaをローカライズします。上腹部動脈と下腹部動脈も特定します。怪我をしないように、血管を傷つけないように注意してください。
   3. 鉗子と顕微手術用ハサミを使用して、下腹部から剣状軟骨まで、白線に沿って切開します。
   4. リトラクターを挿入し、上腹部の露出が最適になるように牽引方向を調整します(図2A、B)。
      注:曲げたペーパークリップをリトラクターとして使用し、固定用の輪ゴムを取り付けます。
3. オルガノイドの注入
   1. 切開部のすぐ隣にきれいなナプキンを置き、その上に生理食塩水を数滴垂らします。小腸と盲腸を外装し、濡れたナプキンの上に置きます。
   2. 注射が可能になるまで、右上葉(RSL)を露出させます。.
   3. ハミルトンシリンジを準備し、水ですすぎ、注入の基準として先端から2〜3 mmのところにマークを置きます。
   4. 調製したオルガノイド混合物でシリンジを引き上げ、マークが付くまで針を注入します。オルガノイドをゆっくりと一定の位置に注入します。この間、針を動かさないでください。
   5. 混合物の逆流を避けるために、15〜20秒待ちます。針を取り外し、綿棒で注射部位に圧力をかけます。腹部に肝葉の破裂と逆流がないか確認します。0.5mLの滅菌生理食塩水で腹部をすすぎ、再吸収性縫合糸を使用してランニング縫合糸で腹部を閉じます。
      注:手術部位は滅菌ドレープで覆われていました。手術中に使用された手術器具は、主に水と洗浄剤で洗浄され、巨視的な残留物が除去されました。その後、器具を滅菌溶液で処理しました。糸、手袋、綿棒などの消耗品は、衛生上の理由から一度だけ使用され、滅菌されていました。

4. 軽微切除(肝臓組織30%)

1. 上記のステップ3.2で説明したように開腹術を行います。
2. 湿った綿棒を使用し、MLを頭蓋骨に押して、LLLの手術野により多くのスペースを作ります。
3. LLLを頭蓋骨にひっくり返し、CLとLLLの間に常に存在する尾状葉(CL)と靭帯を露出させます(図2C)。
4. 靭帯を完全に切断し、結紮糸(再吸収性のない細い糸、Prolene 5-0など)をLLLの下に挿入します。この位置に留まるようにするには、結紮糸を湿らせて右上象限に向かって動かします。
5. LLLを尾側に反転させます。合字の左自由端をLLLの左端にガイドします。リガチャーの右自由端をLLLの右先端にガイドします。綿棒でLLLに尾側牽引を施し、結紮糸の正しい中央位置を確認します。
6. ダブルハーフノットを結びます。後半の結び目を反対方向に結び、完全に締めずに結び目を固定します。結び目を少し締め、合字の正しい配置を確認し、良好な位置決めを保証するために再配置します。
7. 頭蓋の自由端を鈍い先端の鉗子で所定の位置に保持して結び目を完全に締め、尾側の自由端を別の鉗子で引っ張ります(図2D)。後半の結び目を反対方向に結んで結び目を固定します。
8. 肝葉を切除します。結紮糸を切らずに、結紮糸の近くで切ります。

5. 大切除術(肝臓組織の65%)

1. 上記のようにLLLの軽微な切除を行います(手順3.4.1-3.4.8)。
2. 鎌状靭帯を切断してMLを動員し、葉を頭蓋骨にひっくり返します。結紮糸をローブの下に挿入し、ローブを尾側に反転させます。
3. 小葉の周りに自由端をループします。操作中に誤って配置された場合に備えて、結紮糸の配置を繰り返します。結紮糸が正しく配置されたら、ダブルハーフノットを配置し、ゆっくりと結び、必要に応じて結紮糸の位置を変えます。
4. 後半の結び目を反対方向に結び、完全に締めます。反対方向に3番目の半結び目を追加します。
5. 葉を切除します。
6. 腹部を滅菌生理食塩水で洗い流し、腸を解剖学的場所に置きます。

6. 腹部の閉鎖

1. 鉗子で皮膚と腹膜をつかみ、切開線の上端に吸収性縫合糸(Monocryl 5-0など)で縫い目を作ります。必ず腹膜側から出てください。
2. 切開部の対応部分で2番目のステッチを行い、皮膚側から出ます。針のない自由端を短くし、針のある端を長くしながら、結び目をしっかりと結びます。短い方の端を2mmの長さに切ります。
3. ランニング縫合を続け、切開部の下端に結び目をつけて仕上げます。
4. マウスの腹部に残っている血液をきれいにします。

7. 術後ケア

1. 腹部を閉鎖した後、さらに10μLのブプレノルフィン(0.3 mg / mL)を首に皮下注射します。.動物を以前に使用した隔離ケージに入れ、一部を加熱マットの上に置きます。ケージの床に簡単にアクセスできる食べ物を用意してください。
   注意: 動物が意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
2. 手術後2時間後と6時間後に術後コントロールを実施します。痛みの兆候に特に注意を払って行動を注意深く観察してください。必要に応じて、さらに10μLのブピバカインを投与します。
3. マウスが完全に回復したら、手術後6時間前ではなく、手術後24時間以内に、マウスをメインケージに再導入します。攻撃性やその他の疑わしい行動に関して、関係するすべての動物の行動を注意深く監視します。動物の術後の弱点が疑われる場合は、最終的な再導入まで回復するために一晩隔離しておきます。
4. 手術の1日後に最終的な術後管理を行った後、動物の定期的な体重測定を進めます。
   注: 鎮痛剤は術後 4 時間と 8 時間で投与されました。術後12時間、24時間、48時間後にさらなるモニタリングを行い、マウスに何らかの痛みや苦痛がないかチェックしました。痛みの兆候が観察された場合は、ブプレノルフィンの追加投与が行われました。

8. 腫瘍増殖のモニタリング

1. イソフルラン麻酔を使用してマウスを固定し、超音波検査を使用して、注射の 2 週間後に始まる腫瘍の移植を視覚化します¹⁰.
2. CO₂を使用してマウスを安楽死させます。

結果

総肝臓体積に対する単一肝葉の寄与を調べたところ、LLLが総肝臓体積の33%を占めていることがわかりました。MLは総肝臓量の32%、RSLは13%、RILは10%、CLは10%に相当します(表2)。箱ひげ図は、肝臓葉の相対的な寄与が同じ系統の異なるマウス間で同等であることを示しています(図3B)。したがって、LLLの切除は総肝臓容積の35%の切除をも?...

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
マウス麻酔
麻酔の目標は、マウスを外科的操作に耐えられる状態に安全に変換することです。同時に、心肺停止とそれに続く死を防ぐために、麻酔の効果が強すぎてはいけません。吸入麻酔は投与が容易で、研究者は気化器の流量を操作して投与量を調整することができます。変更の効果は迅速です。こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817