Un modello di xenotrapianto di organoidi derivato da pazienti con carcinoma epatocellulare per studiare l'impatto della rigenerazione epatica sulla crescita del tumore

Riepilogo

Gli organoidi generati dai tumori dei pazienti vengono iniettati ortotopicamente nel fegato del topo. La resezione del tessuto epatico non tumorale porta a un ambiente rigenerativo nel tessuto epatico in cui si trova il tumore.

Abstract

La recidiva rappresenta una sfida notevole dopo il trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC), con un impatto su oltre il 70% dei pazienti sottoposti a resezione chirurgica. La recidiva deriva da micrometastasi non rilevate o da un cancro de novo , potenzialmente innescato dalla rigenerazione epatica post-chirurgica. Ricerche precedenti hanno impiegato linee cellulari di HCC in modelli ortotopici per studiare l'impatto della rigenerazione epatica, ma la loro validità limitata ha spinto la necessità di un modello più rappresentativo. Qui, introduciamo un nuovo approccio che utilizza organoidi HCC derivati da pazienti per studiare l'influenza della rigenerazione epatica sull'HCC.

I tessuti tumorali dei pazienti vengono lavorati per creare organoidi tumorali, incorporati in una matrice tridimensionale di membrana basale e coltivati in un terreno specifico per il fegato. Un milione di organoidi vengono iniettati nel lobo superiore destro (RSL) di topi immunodeficienti, confermando la crescita macroscopica del tumore attraverso l'ecografia. Il gruppo di intervento viene sottoposto a resezione del lobo laterale sinistro (LLL) (30% del volume totale del fegato) o in aggiunta del lobo medio (ML) (65% del volume totale del fegato) per indurre la rigenerazione del fegato all'interno del sito del tumore. Il gruppo di controllo sperimenta la rilaparotomia senza resezione del tessuto epatico. Dopo 2 settimane, entrambi i gruppi subiscono l'espiantazione del tumore e del tessuto normale.

In conclusione, questo modello di organoide HCC derivato da pazienti offre una solida piattaforma per studiare l'impatto della rigenerazione epatica dopo la resezione del cancro. La sua composizione multicellulare, la diversità genetica e le capacità di coltura prolungate lo rendono uno strumento inestimabile per studiare i meccanismi di recidiva dell'HCC e i potenziali interventi.

Introduzione

La recidiva dopo il trattamento del carcinoma epatocellulare (HCC) è una sfida significativa, che colpisce oltre il 70% dei pazienti sottoposti a resezione chirurgica ^1,2,3. Questa recidiva può derivare da micrometastasi non rilevate (tumore multicentrico) o dallo sviluppo di cancro de novo ⁴. Sia le indagini cliniche che quelle sperimentali suggeriscono che il processo di rigenerazione epatica innescato dalla resezione chirurgica possa attivare micrometastasi latenti, contribuendo alla recidiva del tumore.

Sono necessarie ulteriori ricerche per confrontare l'espressione genica e proteica nelle cellule epatiche normali e maligne all'interno di un ambiente epatico rigenerativo. Oltre a chiarire i meccanismi alla base della recidiva, l'identificazione di vie di segnalazione bersagliabili specifiche per le cellule tumorali ha il potenziale per sostanziali progressi terapeutici. Questo approccio mira a conciliare le nozioni apparentemente contraddittorie di un microambiente antitumorale e le condizioni favorevoli per la rigenerazione epatica.

I modelli precedenti hanno utilizzato l'iniezione ortotopica di linee cellulari di HCC per studiare l'impatto della rigenerazione epatica⁵. Questo modello pionieristico impiega organoidi HCC derivati da pazienti, offrendo diversi vantaggi rispetto alle linee cellulari tradizionali. Gli organoidi mantengono diverse popolazioni cellulari, rispecchiando la struttura e la funzione del modello modello, a differenza delle linee cellulari e degli sferoidi. La loro diversità genetica migliora la rappresentatività. Inoltre, gli organoidi forniscono stabilità per colture estese, consentendo studi di intervento prolungati. Raccomandiamo l'iniezione di RSL per il suo potenziale di rigenerazione superiore rispetto al lobo inferiore destro (RIL). Il metodo qui descritto fornisce una piattaforma che utilizza organoidi tumorali con notevoli vantaggi rispetto alle linee cellulari tumorali per indagare la suddetta domanda di ricerca.

Protocollo

I campioni di fegato utilizzati per la generazione di organoidi sono stati prelevati da pazienti operati presso l'Ospedale universitario di Basilea (USB) a seguito di un consenso informato scritto e approvato dal Comitato etico della Svizzera nordoccidentale e centrale (numero BASEC 2019-02118). Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato per la cura degli animali di Kanton Basel-Stadt, Svizzera (3123-33896). Tutti i topi erano del ceppo di topo gamma SCID diabetico non obeso (NOD) e quindi geneticamente modificati per essere immunosoppressi; Venivano utilizzati solo animali maschi. Vedere la Tabella 1 e la Tabella dei materiali per i dettagli relativi alle soluzioni, ai reagenti, ai materiali e agli strumenti utilizzati nel protocollo. Vedere la Figura 1 per una panoramica dell'esperimento.

1. Allevamento di topi

1. Allevare e mantenere i topi nella struttura per animali in condizioni specifiche prive di agenti patogeni con un programma di 12 ore di giorno e 12 ore di notte con accesso ad libitum a cibo e acqua potabile.
   NOTA: L'impianto degli organoidi viene eseguito all'età di 6-8 settimane.

2. Campioni clinici e del paziente

1. Posizionare le piastre a 12, 24 e 6 pozzetti nell'incubatore a 37 °C prima di iniziare. Se possibile, fallo con 1 giorno di anticipo.
   1. Raccogliere il tessuto entro 1 ora dalla resezione in terreno RPMI 1640 e trasportarlo in laboratorio per avviare immediatamente il processo di dissociazione. Posizionare il fazzoletto in una capsula di Petri da 10 cm (piatto preriscaldato) e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione fisiologica sterile per evitare che il tessuto si secchi.
2. Dissociazione tissutale del cancro del fegato per la generazione di organoidi
   1. Tritare il tessuto in piccoli frammenti di 1-2 mm² utilizzando bisturi. Utilizzare una pinza per tessuti aggiuntiva per stabilizzare il tessuto nel caso in cui il taglio sia difficile.
   2. Mettere i pezzi di tessuto in una provetta da 15 mL con 5 mL di tampone di dissociazione (pH fisiologico). Collocare a 37 °C (armadio riscaldante/incubatrice) in un dispositivo di rotazione.
   3. Miscelare pipettando ogni 10 minuti e lasciare agire per circa 1-1,5 ore, ripetendo il processo di miscelazione ogni 10 minuti.
      NOTA: La miscelazione può richiedere il taglio dell'estremità della pipetta per aumentare il diametro dell'orifizio, evitando così che il tessuto di grandi dimensioni rimanga incastrato nella punta della pipetta.
   4. Raccogliere 10 μl di miscela di tampone di dissociazione cellulare dal passaggio 2.2.3 in una provetta di plastica da 0,5 mL, aggiungere 10 μl di Trypan Blue e utilizzare il contatore cellulare automatizzato per valutare la vitalità cellulare e i cluster cellulari. Se sono visibili dei grappoli, ripetere il processo di miscelazione (passaggio 3.3.); In caso contrario, procedere con il passaggio successivo.
   5. Prendi una provetta da 50 mL, posiziona sopra un colino cellulare da 100 μm e passa la miscela attraverso di essa. Con lo stantuffo di una siringa da 5 ml, frantumare tutti i frammenti di tessuto rimanenti attraverso il filtro. Lavare il tutto con 5 ml di Ad-DF+++ e assicurarsi di raccogliere la goccia dal fondo del filtro.
   6. Trasferire il filtrato in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare per 15 min a 300 × g.
   7. Aspirare il surnatante con cura, facendo attenzione a non toccare il pellet. Aggiungere 5 mL di tampone per lisi dei globuli rossi. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
   8. Centrifugare per 5 min a 300 × g. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 mL di terreno avanzato.
3. Conteggio delle cellule e valutazione della vitalità cellulare
   1. Aggiungere 10 μl di blu di tripano in una provetta da 1,5 mL e mescolare con 10 μl di sospensione cellulare. Posizionare 10 μl di miscela sui vetrini di conteggio e contare le cellule.
   2. Separare il numero necessario di cellule per la generazione dell'organoide e centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Generalmente, seminare 80.000 cellule per cupola e 20 μL di matrice della membrana basale per cupola (10 gocce per pozzetto per piastra a 6 pozzetti).
   3. Se le cellule in eccesso rimangono in sospensione, sospendere il pellet nel mezzo di congelamento in sospensione cellulare (10% DMSO in FBS), trasferirlo in una crioprovetta e metterlo in un contenitore di congelamento. Trasferire immediatamente il tubo in un congelatore a -80 °C per una notte. Il giorno successivo, trasferire in azoto liquido fino al momento del bisogno.
4. Placcatura per la generazione di organoidi
   1. Rimuovere il surnatante. Posizionare il tubo sul ghiaccio e risospendere il pellet con una matrice a membrana basamentale.
   2. Estrarre la piastra preriscaldata dall'incubatrice (preriscaldata durante la notte). Praticare piccole gocce nella piastra (20 μl di matrice della membrana basale per cupola [10 gocce per pozzetto]). Capovolgere la piastra e lasciarla per 5 minuti nella cabina di flusso.
   3. Dopo 5 minuti, trasferire la piastra nell'incubatore a 37 °C e lasciare la piastra per ~20 minuti, lasciando solidificare la matrice. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura organoidico ^6,7.
5. Mantenimento della coltura di organoidi
   1. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni. Una volta che gli organoidi sono confluenti nella cupola della matrice della membrana basale e pronti per l'espansione, calcolare il rapporto di scissione, ad esempio 2x o 3x di conseguenza.
      NOTA: Registrare queste informazioni; Sarà necessario nei prossimi passaggi.
   2. Rimuovere il fluido dall'angolo del pozzetto utilizzando una punta P1000, facendo attenzione a non toccare le cupole della matrice.
   3. Aggiungere 100 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% per cupola, raschiarla, raccoglierla in una provetta da 15 mL e aggiungere di nuovo una piccola quantità di tripsina nel pozzetto per raccogliere tutto. Pipettalo ~10x.
   4. Incubare per 3 minuti in bagnomaria a 37 °C e pipettare 10 volte per dissociare le cellule con una punta P1000. Ripetere questo passaggio ogni 3 minuti per un massimo di 10 minuti.
   5. Aggiungere almeno lo stesso volume di terreno Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM)/10% siero fetale bovino (FBS)/1% terreno penicillina-streptomicina (Pen-Streptomyc) e mescolare su e giù lentamente 2 volte. Fai il pieno di DPBS.
   6. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti e rimuovere con cura il surnatante. Risospendere in base al rapporto di scissione deciso in base alla confluenza dell'organoide, ad esempio 2 o 3 volte la quantità iniziale di matrice della membrana basale.
   7. Estrarre la piastra preriscaldata dall'incubatrice (preriscaldata durante la notte). Praticare piccole gocce nella piastra (20 μl di matrice della membrana basale per cupola [10 gocce per pozzetto]). Capovolgere la piastra e lasciarla per 5 minuti nella cabina di flusso.
   8. Dopo 5 minuti, trasferire la piastra nell'incubatore a 37 °C. Lasciare la piastra per ~20 minuti, lasciando solidificare la matrice. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura organoidico.
6. Preparazione di organoidi per la realizzazione di un blocco FFPE (FFPE) fissato in formalina
   1. Rimuovere il fluido dall'angolo del pozzetto utilizzando una punta P1000, facendo attenzione a non toccare le cupole della matrice. Aggiungere 200 μL di Dispasi (2 mg/mL) e disinnescare le gocce con un puntale per pipetta P1000. Lasciare in incubatrice per 80 min.
   2. Aggiungere 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbco al pozzetto, trasferirlo in una provetta conica da 15 mL e riempirlo con DPBS. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di paraformaldeide al 4%. Conservare in frigorifero per almeno 1 ora.
   3. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti, aspirare la paraformaldeide e risospendere il pellet con il gel per la lavorazione dei campioni per creare una goccia. Attendi 40 minuti affinché le gocce si solidifichino. Posizionare la goccia di gel contenente le cellule in una cassetta istologica. Spostare la cassetta per disidratarla e successivamente incorporarla nella paraffina per il taglio e la colorazione H/E ^8,9.
7. Preparazione di organoidi per iniezione
   1. Estrarre la piastra contenente l'organoide in crescita dall'incubatore e posizionarla nella cappa di flusso.
   2. Seguire i passaggi da 2.5.2 a 2.5.4.
   3. Aggiungere 2 mL di DMEM e mescolare.
   4. Aggiungere 10 μl di blu di tripano in una provetta da 1,5 mL e miscelare con 10 μl di sospensione cellulare.
   5. Posizionare 10 μl di miscela sui vetrini di conteggio e contare le cellule. Calcolare il numero medio di cellule di entrambe le camere. Se la differenza è troppo grande tra le due camere, considera di ripetere il conteggio.
   6. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per 10-6 cellule ed erogare questo volume in provette da 1,5 mL. Centrifugare a 300 × g per 5 min e mettere le provette sul ghiaccio.
   7. Rimuovere con cautela il surnatante e aggiungere 5 μl di DMEM e 5 μl di matrice della membrana basale. Miscelare accuratamente la sospensione mediante pipettaggio, mantenendo la sospensione fredda durante il processo.
   8. Posizionare le provette da 1,5 mL contenenti gli organoidi sul ghiaccio durante il trasporto ai topi e procedere con l'iniezione.

3. Iniezione di organoidi nel topo

1. Fasi perioperatorie
   1. Togliete l'animale da esperimento dalla gabbia principale e mettetelo in una gabbia isolata e fresca con acqua.
   2. Anestetizzare il topo con isoflurano dall'1,5% al 2,5%.
   3. Eseguire un'iniezione sottocutanea nel collo con 10 μL di Buprenorfina (0,3 mg/mL) 30 minuti prima dell'inizio dell'intervento.
   4. Immediatamente prima dell'inizio dell'intervento, dipingere accuratamente gli occhi degli animali con Carbomerum (ad es. Lacrinorm) per evitare qualsiasi secchezza degli occhi durante l'intervento. Non toccare la cornea durante l'applicazione per evitare qualsiasi erosione della cornea.
   5. Posiziona gli animali su una superficie pulita e sterile e maneggiali con guanti di plastica freschi, retina per capelli e uno speciale camice da laboratorio utilizzato solo nella struttura dei topi.
   6. Utilizzare due fari che emettono calore vicino all'animale per fornire una visuale sufficiente. In caso di dubbi o preoccupazioni sull'ipotermia durante l'intervento chirurgico, utilizzare un'altra lampada riscaldante o un tappetino riscaldante.
2. Laparotomia
   NOTA: Prima dell'inizio della procedura chirurgica, la profondità dell'anestesia è stata controllata mediante il test di pizzicamento delle dita. Durante la procedura, è stata fornita un'adeguata anestesia attraverso controlli di routine e monitoraggio della frequenza respiratoria e regolata se c'era un aumento rilevante. L'attrezzatura chirurgica è stata pulita e disinfettata secondo le linee guida interne della nostra struttura per animali.
   1. Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina, estendere le quattro estremità e fissarle con del nastro adesivo. Rimuovere il pelo applicando una crema depilatoria e utilizzare un fazzoletto umido per rimuovere la crema e il pelo in eccesso.
      NOTA: La depilazione funziona meglio se si utilizza un batuffolo di cotone per massaggiare la crema sul pelo contro il fiore.
   2. Localizzare la linea alba, che è l'obiettivo per la laparotomia. Identificare anche le arterie epigastriche superiori e inferiori. Fare attenzione a non danneggiare i recipienti per evitare lesioni.
   3. Praticare un'incisione lungo la linea alba con pinze e forbici microchirurgiche dal basso ventre alla cartilagine xifoidea.
   4. Inserire i divaricatori e regolare la direzione di trazione per un'esposizione ottimale della parte superiore dell'addome (Figura 2A, B).
      NOTA: Utilizziamo graffette piegate come divaricatori con elastici attaccati per il fissaggio.
3. Iniezione di organoidi
   1. Posiziona un tovagliolo pulito proprio accanto all'incisione e mettici sopra alcune gocce di soluzione salina. Esteriorizzare l'intestino tenue e il cieco e posizionarlo sul tovagliolo bagnato.
   2. Esporre il lobo superiore destro (RSL) fino a quando non è possibile un'iniezione.
   3. Preparare la siringa di Hamilton, sciacquarla con acqua e lasciare un segno a 2-3 mm dalla punta come riferimento per l'iniezione.
   4. Aspirare la siringa con la miscela di organoidi preparata e iniettare l'ago fino al segno. Iniettare lentamente gli organoidi in una posizione stabile; Non muovere l'ago durante questo periodo.
   5. Attendere 15-20 s per evitare il riflusso della miscela. Rimuova l'ago e faccia una certa pressione con un batuffolo di cotone sul sito di iniezione. Controllare l'addome per una rottura del lobo del fegato e il riflusso. Sciacquare l'addome con 0,5 ml di soluzione fisiologica sterile e chiudere l'addome con una sutura in esecuzione utilizzando una sutura riassorbibile.
      NOTA: Il sito chirurgico è stato coperto da un telo sterile. Gli strumenti chirurgici utilizzati durante la procedura sono stati puliti principalmente con acqua e detergenti per rimuovere i residui macroscopici. Gli strumenti sono stati poi lavorati in una soluzione di sterilizzazione. I materiali di consumo come fili, guanti o batuffoli di cotone sono stati utilizzati una sola volta per motivi igienici ed erano sterili.

4. Resezione minore (30% del tessuto epatico)

1. Eseguire la laparotomia come indicato sopra al punto 3.2.
2. Utilizzare tamponi di cotone umidi e spingere il ML cranialmente per creare più spazio nel campo chirurgico del LLL.
3. Capovolgere il LLL cranialmente ed esporre il lobo caudato (CL) e il legamento, che è abitualmente presente tra il CL e il LLL (Figura 2C).
4. Tagliare completamente il legamento e inserire la legatura (filo sottile non riassorbibile, ad es. Prolene 5-0) sotto il LLL. Per fare in modo che rimanga in questa posizione, inumidire la legatura e spostarla verso il quadrante superiore destro.
5. Capovolgere il LLL caudalmente. Guidare l'estremità libera sinistra della legatura attorno alla punta sinistra del LLL. Guida l'estremità libera destra della legatura attorno alla punta destra del LLL. Applicare la trazione caudale sulla LLL con un batuffolo di cotone e garantire il corretto e centrale posizionamento della legatura.
6. Fare un doppio mezzo nodo. Fissare il nodo con un secondo mezzo nodo legato nell'altra direzione senza stringerlo completamente. Stringere un po' i nodi, controllare il corretto posizionamento della legatura e riposizionarla per garantire un buon posizionamento.
7. Stringere completamente il nodo tenendo l'estremità libera del cranio in posizione con una pinza a punta smussata e tirare l'estremità libera caudale con un altro paio di pinze (Figura 2D). Fissare il nodo con un secondo mezzo nodo legato nella direzione opposta.
8. Resecare il lobo del fegato. Tagliare vicino alla legatura senza tagliarla.

5. Resezione maggiore (65% del tessuto epatico)

1. Eseguire la resezione minore della LLL come indicato sopra (passaggi 3.4.1-3.4.8).
2. Sezionare il legamento falciforme per mobilizzare il ML. Capovolgere il lobo cranialmente. Inserire la legatura sotto il lobo e capovolgere il lobo caudalmente.
3. Avvolgi le estremità libere attorno al lobolo. Posizionamento ripetuto della legatura in caso di posizionamento errato durante la manipolazione. Una volta posizionata correttamente la legatura, posizionare un doppio mezzo nodo, legarlo lentamente e riposizionare la legatura se necessario.
4. Fare un secondo mezzo nodo nella direzione opposta e stringerlo completamente. Aggiungere un terzo mezzo nodo nella direzione opposta.
5. Resecare il lobo.
6. Sciacquare l'addome con una soluzione salina sterile e posizionare l'intestino nella loro posizione anatomica.

6. Chiusura dell'addome

1. Afferrare la pelle e il peritoneo con una pinza e fare un punto con una sutura riassorbibile (ad es. Monocryl 5-0) sull'estremità superiore della linea di incisione. Assicurati di uscire dal lato peritoneale.
2. Eseguire il secondo punto sulla controparte dell'incisione, uscendo dal lato della pelle. Legare bene il nodo lasciando l'estremità libera senza l'ago corta e l'estremità con l'ago lunga. Tagliare l'estremità corta a una lunghezza di 2 mm.
3. Continuare la sutura in esecuzione e terminare con un nodo all'estremità inferiore dell'incisione.
4. Pulisci l'addome del topo dal sangue residuo.

7. Cure postoperatorie

1. Dopo la chiusura dell'addome, iniettare altri 10 μL di Buprenorfina (0,3 mg/mL) per via sottocutanea nel collo. Posizionare gli animali nella gabbia isolata precedentemente utilizzata, parzialmente posizionata su un tappetino riscaldante. Fornisci del cibo facilmente accessibile sul pavimento della gabbia.
   NOTA: Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza.
2. Effettuare i controlli postoperatori a 2 ore e 6 ore dopo l'intervento. Osservare attentamente il comportamento con particolare attenzione a qualsiasi segno di dolore; somministrare altri 10 μL di Bupivacaina, se necessario.
3. Una volta che il topo si è completamente ripreso, ma non prima di 6 ore dopo l'intervento chirurgico e non oltre 24 ore dopo l'intervento, reintrodurlo nella gabbia principale. Monitorare attentamente il comportamento di tutti gli animali coinvolti in merito a qualsiasi aggressione o altro comportamento sospetto. In caso di dubbi su qualsiasi debolezza postoperatoria dell'animale, lasciarlo isolato durante la notte per riprendersi fino alla reintroduzione finale.
4. Dopo il controllo postoperatorio finale 1 giorno dopo l'intervento, procedere con la pesatura periodica degli animali.
   NOTA: L'analgesia è stata somministrata 4 e 8 ore dopo l'intervento. Un ulteriore monitoraggio è stato eseguito a 12, 24 e 48 ore dopo l'intervento e i topi sono stati controllati per qualsiasi tipo di dolore o angoscia. Se sono stati osservati segni di dolore, è stata somministrata un'altra dose di Buprenorfina.

8. Monitoraggio della crescita tumorale

1. Immobilizzare i topi utilizzando l'anestesia con isoflurano e utilizzare l'ecografia per visualizzare l'impianto del tumore a partire da 2 settimane dopo l'iniezione¹⁰.
2. Eutanasia dei topi con CO₂.

Risultati

Abbiamo esaminato il contributo dei singoli lobi epatici al volume totale del fegato e abbiamo scoperto che la LLL rappresenta il 33% del volume totale del fegato. Il ML rappresenta il 32% del volume totale del fegato, l'RSL il 13%, il RIL il 10% e il CL il 10% (Tabella 2). I boxplot mostrano che il contributo relativo dei lobi del fegato è paragonabile tra i diversi topi dello stesso ceppo (Figura 3B). Quindi, una resezione della LLL compo...

Discussione

Passaggi critici nel protocollo
Anestesia del topo
L'obiettivo dell'anestesia è convertire il topo in modo sicuro in uno stato in cui tollererà la manipolazione chirurgica. Allo stesso tempo, l'effetto dell'anestesia non dovrebbe essere troppo forte, per prevenire l'arresto cardiopolmonare e la conseguente morte. L'anestesia inalante è più facile da dosare, consentendo al ricercatore di regolare la dose manipolando la velocità di flusso del v...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817