간 재생이 종양 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 간세포 암 환자 유래 오가노이드 이종이식 모델

요약

환자 종양에서 생성된 오가노이드를 생쥐 간에 항소적으로 주입합니다. 종양이 없는 간 조직의 절제는 종양이 위치한 간 조직에 재생 환경을 조성합니다.

초록

간세포암종(HCC) 치료 후 재발은 눈에 띄는 문제를 야기하며, 외과적 절제를 받는 환자의 70% 이상에 영향을 미칩니다. 재발은 발견되지 않은 미세 전이 또는 새로운 암으로 인해 발생하며, 잠재적으로 수술 후 간 재생에 의해 유발될 수 있습니다. 이전 연구에서는 간 재생의 영향을 연구하기 위해 정소성 모델에 HCC 세포주를 사용했지만, 타당성이 제한적이어서 보다 대표성 있는 모델이 필요했습니다. 여기에서는 간 재생이 간세포암에 미치는 영향을 조사하기 위해 환자 유래 간암 오가노이드를 활용하는 새로운 접근법을 소개합니다.

환자의 종양 조직을 처리하여 종양 오가노이드를 생성하고, 3차원 기저막 매트릭스에 내장하고, 간 특이적 배지에서 배양합니다. 면역결핍 마우스의 우측 상엽(RSL)에 100만 개의 오가노이드를 주입하여 초음파 검사를 통해 거시적 종양 성장을 확인합니다. 중재 그룹은 좌측 측엽(LLL)(총 간 용적의 30%) 또는 추가로 중엽(ML)(총 간 용적의 65%)을 절제하여 종양 부위 내에서 간 재생을 유도합니다. 대조군은 간 조직 절제 없이 재개복술을 경험합니다. 2주 후, 두 그룹 모두 종양 및 정상 조직 이식을 받습니다.

결론적으로, 이 환자 유래 HCC 오가노이드 모델은 암 절제 후 간 재생의 영향을 조사할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다. 다세포 구성, 유전적 다양성 및 장기간의 배양 능력으로 인해 간암 재발 메커니즘 및 잠재적 중재를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

서문

간세포암종(HCC) 치료 후 재발은 외과적 절제술을 받는 환자의 70% 이상에 영향을 미치는 중요한 과제입니다 ^1,2,3. 이러한 재발은 발견되지 않은 미세전이(다중심성 종양) 또는 새로운 암의 발병으로 인해 발생할 수 있다⁴. 임상 및 실험 조사 모두 외과적 절제술에 의해 촉발된 간 재생 과정이 잠복 미세 전이를 활성화하여 종양 재발에 기여할 수 있음을 시사합니다.

재생 간 환경에서 정상 및 악성 간 세포의 유전자 및 단백질 발현을 비교하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 재발의 기전을 밝히는 것 외에도, 암세포에 특이적인 표적 가능한 신호 전달 경로를 규명하는 것은 상당한 치료 발전의 잠재력을 가지고 있습니다. 이 접근법은 항종양 미세환경과 간 재생에 유리한 조건이라는 겉보기에 모순되는 개념을 조화시키는 것을 목표로 합니다.

이전 모델에서는 간 재생의 영향을 조사하기 위해 간암 세포주에 대한 이정소 주사를 사용했다⁵. 이 선구적인 모델은 환자 유래 HCC 오가노이드를 사용하여 기존 세포주에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 오가노이드는 세포주 및 스페로이드와 달리 모델 템플릿의 구조와 기능을 반영하여 다양한 세포 집단을 유지합니다. 그들의 유전적 다양성은 대표성을 향상시킵니다. 또한 오가노이드는 확장된 배양에 안정성을 제공하여 장기간의 중재 연구를 가능하게 합니다. RSL 주입은 우측 하엽(RIL)에 비해 재생 잠재력이 우수하기 때문에 권장됩니다. 여기에 설명된 방법은 암 세포주에 비해 뚜렷한 이점이 있는 암 오가노이드를 사용하여 앞서 언급한 연구 질문을 조사하는 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

오가노이드 생성에 사용된 간 샘플은 스위스 북서부 및 중부 윤리위원회(BASEC 번호 2019-02118)의 승인에 따라 서면 동의서에 따라 바젤 대학병원(USB)에서 수술한 환자로부터 얻었습니다. 모든 마우스 실험은 스위스 Kanton Basel-Stadt의 동물 관리 위원회(3123-33896)의 지침 및 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다. 모든 마우스는 비만하지 않은 당뇨병(NOD) SCID 감마 마우스 균주였으므로 면역 억제를 위해 유전적으로 변형되었습니다. 수컷 동물만 사용되었습니다. 프로토콜에 사용된 용액, 시약, 재료 및 기기와 관련된 자세한 내용은 표 1 및 재료 표를 참조하십시오. 실험에 대한 개요는 그림 1 을 참조하십시오.

1. 쥐 사육

1. 동물 시설에서 특정 병원균이 없는 조건에서 낮 12시간 및 밤 12시간 일정으로 생쥐를 사육하고 유지 관리하며 음식과 식수를 임시 로 이용할 수 있습니다.
   참고: 오가노이드의 이식은 6-8주령에 수행됩니다.

2. 환자 및 임상 샘플

1. 시작하기 전에 12-well, 24-well 및 6-well plate를 37°C의 incubator에 놓습니다. 가능하면 1일 전에 이 작업을 수행합니다.
   1. RPMI 1640 배지에서 절제 후 1시간 이내에 조직을 수집하고 실험실로 운반하여 즉시 해리 과정을 시작합니다. 티슈를 10cm 페트리 접시(미리 데워진 접시)에 넣고 조직이 마르지 않도록 충분한 양의 멸균 식염수를 추가합니다.
2. 오가노이드 생성을 위한 간암 조직 해리
   1. 메스를 사용하여 조직을 1-2mm2의 작은 조각으로 다집니다. 절단이 어려운 경우 조직을 안정화하기 위해 추가 조직 집게를 사용하십시오.
   2. 조직 조각을 5mL의 해리 완충액(생리학적 pH)이 있는 15mL 튜브에 넣습니다. 회전 장치에 37°C(보온 캐비닛/인큐베이터)에 놓습니다.
   3. 10분마다 피펫팅으로 혼합하고 약 1-1.5시간 동안 그대로 두면서 10분마다 혼합 과정을 반복합니다.
      참고: 혼합하려면 오리피스 직경을 늘리기 위해 피펫 끝을 절단해야 할 수 있으며, 이를 통해 너무 큰 조직이 피펫 팁에 끼는 것을 방지할 수 있습니다.
   4. 2.2.3단계에서 10μL의 세포 해리 완충액 혼합물을 0.5mL 플라스틱 튜브에 모으고, 10μL의 Trypan Blue를 첨가하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 생존율 및 세포 클러스터를 평가합니다. 클러스터가 보이면 혼합 과정을 반복합니다(3.3단계). 그렇지 않으면 다음 단계를 진행합니다.
   5. 50mL 튜브를 가져다가 100μm 세포 여과기를 맨 위에 놓고 혼합물을 통과시킵니다. 5mL 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 통해 남아 있는 모든 조직 조각을 부수십시오. Ad-DF+++ 5mL로 모든 것을 세척하고 필터 바닥에서 한 방울을 모으십시오.
   6. 여과액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 300 × g에서 15분 동안 원심분리기.
   7. 펠릿을 만지지 않도록 주의하면서 상등액을 조심스럽게 흡입합니다. 적혈구 용해 완충액 5mL를 추가합니다. 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.
   8. 300 × g에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고 1mL의 고급 배지에 재현탁합니다.
3. 세포 계수 및 세포 생존율 평가
   1. 1.5mL 튜브에 10μL의 Trypan blue를 추가하고 10μL의 세포 현탁액과 혼합합니다. 10 μL의 혼합물을 계수 슬라이드에 놓고 세포를 계수합니다.
   2. 오가노이드 생성에 필요한 수의 세포를 분리하고 300 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 일반적으로 돔당 80,000개의 세포와 돔당 20μL의 기저막 매트릭스를 시딩합니다(6웰 플레이트당 웰당 10방울).
   3. 현탁액에 여분의 세포가 남아 있는 경우, 펠릿을 Cell Suspension Freezing medium(FBS의 10% DMSO)에 현탁액으로 현탁시키고 cryotube로 옮긴 다음 냉동 용기에 넣습니다. 즉시 튜브를 -80°C 냉동고로 밤새 옮깁니다. 다음날, 필요할 때까지 액체 질소로 바꾸십시오.
4. 오가노이드 생성을 위한 도금
   1. 상층액을 제거합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 기저막 매트릭스로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
   2. 인큐베이터에서 예열된 플레이트를 꺼냅니다(밤새 예열). 플레이트에 작은 방울을 만듭니다(돔당 20μL의 기저 멤브레인 매트릭스[웰당 10방울]). 플레이트를 뒤집고 플로우 캐비닛에 플레이트를 5분 동안 그대로 두십시오.
   3. 5분 후 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮기고 플레이트를 ~20분 동안 그대로 두어 매트릭스가 응고되도록 합니다. 오가노이드 배양 배지^{2 mL 6,7}을 추가합니다.
5. 오가노이드 배양 유지
   1. 2일마다 배지를 교체하십시오. 오가노이드가 기저막 매트릭스 돔에서 합류하여 팽창할 준비가 되면 그에 따라 2x 또는 3x와 같은 분할 비율을 계산합니다.
      알림: 이 정보를 기록하십시오. 다음 단계에서 필요합니다.
   2. 매트릭스 돔을 만지지 않도록 주의하면서 P1000 팁을 사용하여 웰 모서리에서 매체를 제거합니다.
   3. 돔당 100μL의 0.25% 트립신-EDTA를 추가하고, 긁어내고, 15mL 튜브에 모으고, 웰에 소량의 트립신을 다시 추가하여 모든 것을 수집합니다. ~ 10 회 피펫팅하십시오.
   4. 37°C 수조에서 3분 동안 배양하고 10회 피펫팅하여 P1000 팁으로 세포를 분리합니다. 최대 10분 동안 3분마다 이 단계를 반복합니다.
   5. 최소한 동일한 부피의 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)/10% Fetal bovine serum(FBS)/1% Penicillin-Streptomycin(Pen-Strep) 배지를 넣고 위아래로 천천히 2회 혼합합니다. DPBS로 채웁니다.
   6. 300×g에서 5 분간 원 심분리한 후 조심스럽게 상층액을 제거합니다. 오가노이드 포화도(organoid confluency)에 따라 결정된 분할 비율에 따라 재현탁(resuspending), 예를 들어, 기저막 매트릭스의 초기 양의 2배 또는 3배.
   7. 인큐베이터에서 예열된 플레이트를 꺼냅니다(밤새 예열). 플레이트에 작은 방울을 만듭니다(돔당 20μL의 기저 멤브레인 매트릭스[웰당 10방울]). 플레이트를 뒤집고 플로우 캐비닛에 플레이트를 5분 동안 그대로 두십시오.
   8. 5분 후 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮깁니다. 플레이트를 ~20분 동안 그대로 두어 매트릭스가 응고되도록 합니다. 오가노이드 배양 배지 2mL를 추가합니다.
6. 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 블록을 만들기 위한 오가노이드 제조
   1. 매트릭스 돔을 만지지 않도록 주의하면서 P1000 팁을 사용하여 웰 모서리에서 매체를 제거합니다. 200 μL의 Dispase(2 mg/mL)를 추가하고 P1000 피펫 팁으로 방울을 방해합니다. 인큐베이터에 80분 동안 그대로 두십시오.
   2. 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS) 2mL를 웰에 넣고 15mL 원뿔형 튜브에 옮긴 다음 DPBS로 채웁니다. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 4% 파라포름알데히드 1mL에 펠릿을 재현탁합니다. 최소 1시간 동안 냉장 보관하십시오.
   3. 300 ×g에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고 파라포름알데히드를 흡인하고 검체 처리 젤로 펠릿을 재현탁하여 방울을 만듭니다. 방울이 굳을 때까지 40분 동안 기다립니다. 세포가 포함된 젤 드롭을 조직학 카세트에 넣습니다. 카세트를 움직여 탈수시킨 다음 절단 및 H/E 염색을 위해 파라핀에 삽입하십시오 ^8,9.
7. 주사를 위한 오가노이드 준비
   1. 성장하는 오가노이드가 들어 있는 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 흐름 캐비닛에 넣습니다.
   2. 2.5.2에서 2.5.4까지의 단계를 따릅니다.
   3. DMEM 2mL를 넣고 섞습니다.
   4. 1.5mL 튜브에 10μL의 Trypan blue를 추가하고 10μL의 세포 현탁액과 혼합합니다.
   5. 10 μL의 혼합물을 계수 슬라이드에 놓고 세포를 계수합니다. 두 챔버의 평균 세포 수를 계산합니다. 두 챔버 간의 차이가 너무 크면 카운트를 다시 수행하는 것이 좋습니다.
   6. 10⁶ 세포에 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하고 이 부피를 1.5mL 튜브에 분주합니다. 300 ×g에서 5 분 동안 원 심분리기를 가열하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   7. 상층액을 조심스럽게 제거하고 5μL의 DMEM과 5μL의 기저막 매트릭스를 추가합니다. 공정 중에 현탁액을 차갑게 유지하면서 피펫팅으로 현탁액을 조심스럽게 혼합하십시오.
   8. 오가노이드가 들어있는 1.5mL 튜브를 마우스로 운반하는 동안 얼음 위에 놓고 주입을 진행합니다.

3. 마우스에 오가노이드 주입

1. 수술 전후 단계
   1. 실험 동물을 주 우리에서 꺼내 물이 담긴 격리된 신선한 우리에 넣습니다.
   2. 1.5%에서 2.5% Isoflurane으로 마우스를 마취합니다.
   3. 수술 시작 30분 전에 10μL의 부프레노르핀(0.3mg/mL)을 목에 피하 주사합니다.
   4. 수술 시작 직전에 동물의 눈에 카보메럼(예: Lacrinorm)을 조심스럽게 칠하여 수술 중 눈이 건조해지지 않도록 합니다. 각막의 침식을 방지하기 위해 적용하는 동안 각막을 만지지 마십시오.
   5. 동물을 깨끗하고 멸균된 표면에 놓고 새 플라스틱 장갑, 헤어네트, 쥐 시설에서만 사용되는 특수 실험실 작업복으로 다루십시오.
   6. 충분한 시야를 제공하기 위해 동물 가까이에 두 개의 발광 헤드라이트를 사용하십시오. 수술 중 저체온증에 대한 의심이나 우려가 있는 경우 다른 난방 램프나 난방 매트를 사용하십시오.
2. 개복술
   참고: 수술 절차가 시작되기 전에 마취 깊이는 발가락 꼬집음 테스트로 확인했습니다. 시술 중에는 정기적인 점검과 호흡수 모니터링을 통해 적절한 마취가 제공되었으며 적절한 증가가 있는 경우 조정되었습니다. 수술 장비는 동물 시설의 사내 지침에 따라 세척 및 소독되었습니다.
   1. 마취된 마우스를 누운 자세로 놓고 사지를 펴고 테이프로 고정합니다. 제모 크림을 바르고 털을 제거하고 물티슈를 사용하여 여분의 크림과 털을 제거합니다.
      알림: 제모는 면봉을 사용하여 크림을 결에 대고 털에 마사지하는 경우 가장 잘 작동합니다.
   2. 개복술의 표적인 linea alba를 국소화합니다. 상복부 동맥과 하복부 동맥도 확인합니다. 부상을 방지하기 위해 용기가 손상되지 않도록 주의하십시오.
   3. 집게와 미세수술 가위로 하복부에서 xiphoid 연골까지 알바 선을 따라 절개합니다.
   4. 견인기를 삽입하고 상복부의 최적 노출을 위해 견인 방향을 조정합니다(그림 2A, B).
      참고: 우리는 고정을 위해 고무 밴드가 부착된 견인기로 구부러진 종이 클립을 사용합니다.
3. 오가노이드 주입
   1. 절개 부위 바로 옆에 깨끗한 냅킨을 놓고 식염수 몇 방울을 떨어뜨립니다. 소장과 맹장을 밖으로 꺼내 젖은 냅킨에 올려 놓습니다.
   2. 주입이 가능할 때까지 우측 상엽(RSL)을 노출시킵니다.
   3. 해밀턴 주사기를 준비하고, 물로 헹구고, 주사를 위한 기준으로 팁에서 2-3mm 떨어진 곳에 표시를 합니다.
   4. 준비된 오가노이드 혼합물이 있는 주사기를 뽑고 표시가 나타날 때까지 바늘을 주입합니다. 오가노이드를 안정된 위치에 천천히 주입합니다. 이 시간 동안 바늘을 움직이지 마십시오.
   5. 혼합물의 역류를 피하기 위해 15-20초 동안 기다리십시오. 바늘을 제거하고 주사 부위에 면봉으로 약간의 압력을 가합니다. 복부에 간엽의 파열과 역류가 있는지 확인하십시오. 0.5mL의 멸균 식염수로 복부를 헹구고 재흡수성 봉합사를 사용하여 흐르는 봉합사로 복부를 닫습니다.
      참고: 수술 부위는 멸균 커튼으로 덮여 있었습니다. 시술 중에 사용된 수술 기구는 주로 거시적 잔여물을 제거하기 위해 물과 세척제로 세척했습니다. 그런 다음 기구를 멸균 용액에서 처리했습니다. 실, 장갑 또는 면봉과 같은 소모품은 위생상의 이유로 한 번만 사용되었으며 멸균 상태였습니다.

4. 경미한 절제술(간 조직의 30%)

1. 위의 3.2단계에서 설명한 대로 개복술을 수행합니다.
2. 촉촉한 면봉을 사용하고 ML을 두개골로 밀어 LLL의 수술 영역에 더 많은 공간을 만듭니다.
3. LLL을 두개골 방향으로 뒤집어 CL과 LLL 사이에 습관적으로 존재하는 미상엽(CL)과 인대를 노출시킵니다(그림 2C).
4. 인대를 완전히 절단하고 LLL 아래에 합자(흡수되지 않는 얇은 실, 예: Prolene 5-0)를 삽입합니다. 이 위치를 유지하려면 합자를 적셔 오른쪽 상부 사분면으로 이동합니다.
5. LLL을 꼬리 방향으로 뒤집습니다. 합자의 왼쪽 자유 끝을 LLL의 왼쪽 끝 주위로 안내합니다. 합자의 오른쪽 자유 끝을 LLL의 오른쪽 끝 주위로 안내합니다. 면봉으로 LLL에 꼬리 견인을 적용하고 합자의 올바른 중앙 위치를 확인합니다.
6. 더블 하프 매듭을 묶습니다. 완전히 조이지 않고 다른 방향으로 묶인 두 번째 절반 매듭으로 매듭을 고정합니다. 매듭을 약간 조이고 합자의 올바른 위치를 확인하고 좋은 위치를 보장하도록 위치를 변경합니다.
7. 끝이 뭉툭한 집게로 두개골 자유 끝을 제자리에 잡고 매듭을 완전히 조이고 다른 집게로 꼬리 자유 끝을 당깁니다(그림 2D). 반대 방향으로 묶인 두 번째 절반 매듭으로 매듭을 고정합니다.
8. 간엽을 절제합니다. 합자를 자르지 않고 합자에 가깝게 자릅니다.

5. 주요 절제술(간 조직의 65%)

1. 위에서 설명한 대로 LLL의 경미한 절제술을 수행합니다(단계 3.4.1-3.4.8).
2. ML을 동원하기 위해 falciform 인대를 절제합니다.두개골로 엽을 뒤집습니다. 로브 아래에 합자를 삽입하고 로브를 꼬리 방향으로 뒤집습니다.
3. 소엽 주위의 자유 끝을 고리 모양으로 만듭니다. 조작 중 잘못 배치된 경우 합자 배치를 반복합니다. 합자가 올바르게 배치되면 이중 반 매듭을 짓고 천천히 묶고 필요한 경우 합자의 위치를 변경합니다.
4. 후반 매듭을 반대 방향으로 묶고 완전히 조입니다. 반대 방향으로 세 번째 절반 매듭을 추가합니다.
5. 엽을 절제합니다.
6. 멸균 식염수로 복부를 씻어내고 장을 해부학적 위치에 놓습니다.

6. 복부 폐쇄

1. 집게로 피부와 복막을 잡고 절개 라인 상단 끝에 재흡수성 봉합사(예: Monocryl 5-0)로 꿰매십시오. 복막 쪽에서 빠져나와야 합니다.
2. 절개 부위에 두 번째 스티치를 수행하여 피부 쪽에서 나옵니다. 바늘이 없는 자유 끝은 짧고 바늘이 있는 끝은 길게 유지하면서 매듭을 단단히 묶습니다. 짧은 끝을 2mm 길이로 자릅니다.
3. 런닝 봉합사를 계속하고 절개 부위 아래쪽 끝에 매듭으로 마무리합니다.
4. 마우스의 복부에 남아 있는 혈액을 청소하십시오.

7. 수술 후 관리

1. 복부를 봉합한 후 부프레노르핀 10μL(0.3mg/mL)를 목에 피하로 추가로 주사합니다. 이전에 사용한 격리된 케이지에 동물을 넣고 부분적으로 가열 매트 위에 놓습니다. 케이지 바닥에 쉽게 접근할 수 있는 음식을 제공하십시오.
   알림: 동물이 의식을 되찾을 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
2. 수술 후 2시간 및 6시간에 수술 후 조절을 수행하십시오. 통증의 징후에 특별한주의를 기울여 행동을 면밀히 관찰하십시오. 필요한 경우 10μL의 부피바카인을 추가로 투여합니다.
3. 마우스가 완전히 회복되었지만 수술 후 6시간 전, 수술 후 24시간 이내에 마우스를 메인 케이지에 다시 도입합니다. 공격성이나 기타 의심스러운 행동에 대해 관련된 모든 동물의 행동을 면밀히 모니터링하십시오. 수술 후 동물의 약점이 의심되는 경우 최종 재도입 때까지 회복할 수 있도록 밤새 격리 두십시오.
4. 수술 1일 후 최종 수술 후 대조군 후 동물의 일반 체중 측정을 진행합니다.
   참고: 진통제는 수술 후 4시간 및 8시간 후에 투여되었습니다. 수술 후 12시간, 24시간 및 48시간에 추가 모니터링을 실시하고 마우스에 모든 종류의 통증이나 괴로움이 있는지 확인했습니다. 통증의 징후가 관찰되면 부프레노르핀을 한 번 더 투여했습니다.

8. 종양 성장 모니터링

1. 이소플루란 마취를 사용하여 마우스를 고정시키고 초음파 검사를 사용하여 주사 후 2주가 지나면 종양 착상을 시각화합니다¹⁰.
2. CO₂를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.

결과

우리는 전체 간 용적에 대한 단일 간엽의 기여도를 조사한 결과 LLL이 전체 간 용적의 33%를 차지한다는 것을 발견했습니다. ML은 총 간 용적의 32%, RSL은 13%, RIL은 10%, CL은 10%를 차지합니다(표 2). 상자 그림은 간엽의 상대적 기여도가 동일한 균주의 다른 마우스 간에 비슷하다는 것을 보여줍니다(그림 3B). 따라서 LLL을 절제하면 총 간 용적의...

토론

프로토콜의 중요한 단계
마우스 마취
마취의 목표는 마우스를 외과적 조작을 견딜 수 있는 상태로 안전하게 전환하는 것입니다. 동시에 마취의 효과는 심폐 정지와 그에 따른 사망을 예방하기 위해 너무 강해서는 안됩니다. 흡입제 마취는 투여가 더 쉬워 연구원이 기화기의 유속을 조작하여 투여량을 조정할 수 있습니다. 변화의 효과는 빠?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817