肝细胞癌患者来源的类器官异种移植模型，用于研究肝脏再生对肿瘤生长的影响

摘要

将患者肿瘤产生的类器官原位注射到小鼠肝脏中。非肿瘤肝组织的切除导致肿瘤所在的肝组织出现再生环境。

摘要

肝细胞癌 （HCC） 治疗后复发是一个显著的挑战，影响了超过 70% 的手术切除患者。复发源于未被发现的微转移或 新发 癌症，可能由术后肝脏再生触发。先前的研究在原位模型中采用 HCC 细胞系来研究肝脏再生的影响，但它们的有效性有限，因此需要更具代表性的模型。在这里，我们介绍了一种利用患者来源的 HCC 类器官的新方法来研究肝脏再生对 HCC 的影响。

对患者肿瘤组织进行加工以产生肿瘤类器官，包埋在三维基底膜基质中，并在肝脏特异性培养基中培养。将 100 万个类器官注射到免疫缺陷小鼠的右上叶 （RSL） 中，通过超声检查确认肉眼可见的肿瘤生长。干预组切除左肺叶 （LLL） （占肝脏总体积的 30%） 或另外切除中叶 （ML） （占肝脏总体积的 65%），以诱导肿瘤部位内的肝脏再生。对照组进行再剖腹手术，未切除肝组织。2 周后，两组均进行肿瘤和正常组织移植。

总之，这种患者来源的 HCC 类器官模型为研究癌症切除后肝脏再生的影响提供了一个强大的平台。它的多细胞组成、遗传多样性和延长培养能力使其成为研究 HCC 复发机制和潜在干预措施的宝贵工具。

引言

肝细胞癌 （HCC） 治疗后的复发是一项重大挑战，影响了超过 70% 的接受手术切除的患者 ^1,2,3。这种复发可能是由于未被发现的微转移（多中心肿瘤）或新发癌症的发展引起的⁴。临床和实验研究表明，手术切除触发的肝脏再生过程可以激活潜在的微转移，导致肿瘤复发。

需要进一步的研究来比较再生肝脏环境中正常和恶性肝细胞中的基因和蛋白质表达。除了阐明复发的机制外，确定癌细胞特异性的靶向信号通路还具有取得重大治疗进展的潜力。这种方法旨在调和抗肿瘤微环境和肝脏再生的有利条件的看似矛盾的概念。

以前的模型使用 HCC 细胞系的原位注射来研究肝脏再生的影响⁵。这种开创性的模型采用患者来源的 HCC 类器官，与传统细胞系相比具有多项优势。与细胞系和球状体不同，类器官保持多样化的细胞群，反映了模型模板的结构和功能。它们的遗传多样性增强了代表性。此外，类器官为扩展培养提供了稳定性，从而能够进行长时间的干预研究。我们推荐 RSL 注射，因为与右下叶 （RIL） 相比，RSL 的再生潜力更强。此处描述的方法提供了一个使用癌症类器官的平台，与癌细胞系相比具有显着优势，以研究上述研究问题。

研究方案

用于生成类器官的肝脏样本是在瑞士西北部和中部伦理委员会（BASEC 编号 2019-02118）批准下获得书面知情同意书后，从巴塞尔大学医院 （USB） 手术的患者那里获得的。所有小鼠实验均经瑞士巴塞尔城市州动物护理委员会 （3123-33896） 的批准并按照其指导方针和规定进行。所有小鼠均为非肥胖糖尿病 （NOD） SCID γ 小鼠品系，因此经过基因改造以受到免疫抑制;仅使用雄性动物。有关方案中使用的溶液、试剂、材料和仪器的详细信息，请参见 表 1 和 材料表 。有关实验的概述，请参见 图 1 。

1. 老鼠饲养

1. 在无特定病原体的条件下，以 12 小时白天和 12 小时夜间时间表在动物设施中繁殖和维持小鼠，并 随意 获取食物和饮用水。
   注意:类器官的植入在 6-8 周龄时进行。

2. 患者和临床样本

1. 开始前，将 12、24 和 6 孔板置于 37 °C 的培养箱中。如果可能，请提前 1 天执行此作。
   1. 在 RPMI 1640 培养基中切除后 1 小时内收集组织，并将其运输到实验室以立即开始解离过程。将组织放入 10 厘米培养皿（预热培养皿）中，并加入足量的无菌盐水以避免组织干燥。
2. 肝癌组织解离产生类器官
   1. 用手术刀将组织切成 1-2 mm² 的小碎片。使用额外的组织镊子来稳定组织，以防切割困难。
   2. 将组织块放入含有 5 mL 解离缓冲液（生理 pH 值）的 15 mL 试管中。置于 37 °C（加热柜/培养箱）的旋转装置中。
   3. 每 10 分钟移液混合，放置约 1-1.5 小时，每 10 分钟重复一次混合过程。
      注:混合可能需要切割移液器的末端以增加孔口直径，从而防止超大组织卡在移液器吸头中。
   4. 在 0.5 mL 塑料管中收集步骤 2.2.3 中的 10 μL 细胞解离缓冲液混合物，加入 10 μL 台盼蓝，并使用自动细胞计数器评估细胞活力和细胞簇。如果可以看到簇，请重复混合过程（步骤 3.3）。否则，请继续执行下一步。
   5. 取一根 50 mL 试管，在顶部放置一个 100 μm 细胞过滤器，然后将混合物通过它。用 5 mL 注射器的柱塞，将所有剩余的组织碎片通过过滤器粉碎。用 5 mL Ad-DF+++ 洗涤所有液体，并确保从过滤器底部收集液滴。
   6. 将滤液转移至 15 mL 锥形管中。以 300 × g 离心 15 分钟。
   7. 小心吸出上清液，注意不要接触沉淀。加入 5 mL 红细胞裂解缓冲液。在室温下孵育 5-10 分钟。
   8. 以 300 × g 离心 5 分钟。去除上清液并重悬于 1 mL 高级培养基中。
3. 细胞计数和评估细胞活力
   1. 向 1.5 mL 试管中加入 10 μL 台盼蓝，并与 10 μL 细胞悬液混合。将 10 μL 混合物放在计数玻片上并计数细胞。
   2. 分离产生类器官所需的细胞数量，并以 300 × g 离心 5 分钟。通常，每个圆顶接种 80,000 个细胞，每个圆顶接种 20 μL 基底膜基质（每个 6 孔板每孔 10 滴）。
   3. 如果悬浮液中残留任何多余的细胞，将沉淀悬浮在细胞悬液冻存培养基（10% DMSO 的 FBS 溶液）中，将其转移到冻存管中，然后放入冻存容器中。立即将试管转移到 -80 °C 冰箱中过夜。第二天，转移到液氮中，直到需要。
4. 用于类器官生成的电镀
   1. 去除上清液。将试管放在冰上，并用基底膜基质重悬沉淀。
   2. 将预热的板从培养箱中取出（预热过夜）。在板中滴出小滴（每个圆顶 20 μL 基底膜基质 [每孔 10 滴]）。倒置板并将板在流动柜中放置 5 分钟。
   3. 5 分钟后，将板转移到 37 °C 培养箱中，将板放置 ~20 分钟，让基质凝固。加入 2 mL 类器官培养基 ^6,7。
5. 类器官培养的维持
   1. 每 2 天更换一次培养基。一旦类器官在基底膜基质圆顶中汇合并准备好扩增，相应地计算分裂比，例如 2 倍或 3 倍。
      注意:记录此信息;下一步将需要它。
   2. 使用 P1000 吸头从孔的角落去除培养基，注意不要接触基质圆顶。
   3. 每个圆顶加入 100 μL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，刮擦，收集到 15 mL 试管中，然后再次向孔中加入少量胰蛋白酶以收集所有物质。移液 ~10 次。
   4. 在 37 °C 水浴中孵育 3 分钟，并移液 10 次以用 P1000 吸头解离细胞。每 3 分钟重复此步骤，最多 10 分钟。
   5. 加入至少相同体积的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）/10% 胎牛血清 （FBS）/1% 青霉素-链霉素 （Pen-Strep） 培养基，并缓慢上下混合 2 次。填满 DPBS。
   6. 以 300 × g 离心 5 分钟，然后小心去除上清液。根据基于类器官汇合度确定的分裂比率重悬，例如，基底膜基质初始量的 2 倍或 3 倍。
   7. 将预热的板从培养箱中取出（预热过夜）。在板中滴出小滴（每个圆顶 20 μL 基底膜基质 [每孔 10 滴]）。倒置板并将板在流动柜中放置 5 分钟。
   8. 5 分钟后，将板转移到 37 °C 培养箱中。将板放置 ~20 分钟，让基质凝固。加入 2 mL 类器官培养基。
6. 制备用于制备福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 块的类器官
   1. 使用 P1000 吸头从孔的角落去除培养基，注意不要接触基质圆顶。加入 200 μL 分散酶 （2 mg/mL） 并用 P1000 移液器吸头破坏液滴。在培养箱中放置 80 分钟。
   2. 向孔中加入 2 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），将其转移到 15 mL 锥形管中，然后用 DPBS 填充。以 300 × g 离心 5 分钟，吸出上清液，然后将沉淀重悬于 1 mL 4% 多聚甲醛中。冷藏至少 1 小时。
   3. 以 300 × g 离心 5 分钟，吸出多聚甲醛，然后用样品处理凝胶重悬沉淀以形成液滴。等待 40 分钟，让液滴凝固。将含有细胞的凝胶滴放入组织学盒中。移动包埋盒脱水，然后将其包埋在石蜡中进行切割和 H/E 染色 ^8,9。
7. 注射用类器官的制备
   1. 从培养箱中取出含有生长类器官的板，并将其放入流动柜中。
   2. 按照步骤 2.5.2 到 2.5.4 进行作。
   3. 加入 2 mL DMEM 并混合。
   4. 向 1.5 mL 试管中加入 10 μL 台盼蓝，并与 10 μL 细胞悬液混合。
   5. 将 10 μL 混合物放在计数玻片上并计数细胞。计算两个腔室的平均细胞计数。如果两个腔室之间的差异太大，请考虑重新进行计数。
   6. 计算 10⁶ 个细胞所需的细胞悬液体积，并将该体积分配到 1.5 mL 试管中。以 300 × g 离心 5 分钟，然后将试管置于冰上。
   7. 小心去除上清液，加入 5 μL DMEM 和 5 μL 基底膜基质。通过移液小心混合悬浮液，同时在此过程中保持悬浮液低温。
   8. 在运输给小鼠的过程中，将含有类器官的 1.5 mL 试管放在冰上并继续注射。

3. 将类器官注射到小鼠体内

1. 围手术期步骤
   1. 将实验动物从主笼中取出，放入一个孤立的、有水的新鲜笼子里。
   2. 用 1.5% 至 2.5% 异氟醚麻醉小鼠。
   3. 手术开始前 30 分钟用 10 μL 丁丙诺啡 （0.3 mg/mL） 皮下注射到颈部。
   4. 在手术开始前，用 Carbomerum（例如 Lacrinorm）小心地涂抹动物的眼睛，以避免手术过程中眼睛干燥。使用过程中不要触摸角膜，以免腐蚀角膜。
   5. 将动物放在干净无菌的表面上，并用新鲜的塑料手套、发网和仅在小鼠设施中使用的特殊实验室工作服处理它们。
   6. 在靠近动物的地方使用两个发热大灯，以提供足够的视野。如果对手术过程中的体温过低有任何疑问或担忧，请使用其他加热灯或加热垫。
2. 剖腹术
   注意:在外科手术开始之前，通过脚趾捏试验检查麻醉深度。在手术过程中，通过常规检查和呼吸频率监测提供足够的麻醉，并在出现相关增加时进行调整。手术设备根据我们动物设施的内部指南进行了清洁和消毒。
   1. 将麻醉的小鼠置于仰卧位，伸展四肢，并用胶带固定。涂抹脱毛膏去除毛皮，并使用湿纸巾去除多余的乳霜和毛皮。
      注意:如果使用棉签将乳霜按摩到毛皮中，则脱毛效果最好。
   2. 定位白线，这是剖腹手术的目标。同时识别上腹上动脉和下腹部动脉。注意不要损坏血管，以免受伤。
   3. 用镊子和显微外科剪刀沿着白线从下腹部到剑突软骨做一个切口。
   4. 插入牵开器并调整牵引方向，以实现上腹部的最佳暴露（图 2A、B）。
      注意:我们使用弯曲的回形针作为牵开器，并附有橡皮筋进行固定。
3. 类器官注射
   1. 在切口旁边放一张干净的餐巾纸，然后滴几滴生理盐水。将小肠和盲肠外出，放在湿餐巾纸上。
   2. 暴露右上叶 （RSL），直到可以注射。
   3. 准备 Hamilton 注射器，用水冲洗，并在距离尖端 2-3 毫米处做一个标记作为注射的参考。
   4. 用准备好的类器官混合物抽出注射器，然后注射针头直到标记。将类器官缓慢注射到稳定的位置;在此期间不要移动针头。
   5. 等待 15-20 秒以避免混合物回流。取下针头，用棉签在注射部位按压。检查腹部是否有肝叶破裂和回流。用 0.5 mL 无菌盐水冲洗腹部，并使用可吸收缝合线用连续缝合线闭合腹部。
      注意:手术部位被无菌窗帘覆盖。手术过程中使用的手术器械主要用水和清洁剂清洁，以去除肉眼可见的残留物。然后在灭菌溶液中处理器械。出于卫生原因，线、手套或棉签等消耗品只使用过一次，并且是无菌的。

4. 小切除术（肝组织的 30%）

1. 如上所述在步骤 3.2 中进行剖腹手术。
2. 使用湿棉签并向颅骨推动 ML，以在 LLL 的手术区域内创造更多空间。
3. 向颅侧翻转 LLL 并露出尾状叶 （CL） 和韧带，它通常存在于 CL 和 LLL 之间（图 2C）。
4. 完全切断韧带并将结扎线（不可吸收的细线，例如 Prolene 5-0）插入 LLL 下方。为确保它保持在该位置，请弄湿结扎线并将其向右上象限移动。
5. 向尾部翻转 LLL。将连字的左自由端引导到 LLL 的左尖端。将结扎线的右自由端引导到 LLL 的右尖端。用棉签在 LLL 上施加尾部牵引，并确保结扎线的正确和中心定位。
6. 打一个双半结。用向另一个方向打的第二半结固定结，不要完全拧紧。稍微收紧打结，检查结扎线的正确位置，然后重新定位以确保良好的定位。
7. 用钝头镊子将颅自由端固定到位，然后用另一对镊子拉动尾部自由端，完全收紧结（图 2D）。用向相反方向打的后半个结固定结。
8. 切除肝叶。靠近结扎线切割而不切割它。

5. 大切除术（65% 的肝组织）

1. 如上所述对 LLL 进行小切除术（步骤 3.4.1-3.4.8）。
2. 横切镰状韧带以动员 ML。向颅骨翻转肺叶。将结扎线插入肺叶下方，然后向尾部翻转肺叶。
3. 将自由端环绕小叶。在作过程中放错位置的情况下，重复放置结扎线。正确定位结扎后，打一个双半结，慢慢打结，然后根据需要重新定位结扎。
4. 向相反方向打第二个半结并完全拧紧。在相反的方向上添加第三个半结。
5. 切除叶。
6. 用无菌盐水冲洗腹部，然后将肠道置于解剖位置。

6. 腹部闭合

1. 用镊子抓住皮肤和腹膜，并在切口线的顶端用可吸收缝合线（例如，Monocryl 5-0）缝合。确保从腹膜侧退出。
2. 在切口的对应部分进行第二次缝合，从皮肤侧退出。打紧结，同时留出没有针的自由端短，带针的一端长。将短端剪成 2 毫米的长度。
3. 继续进行缝合，并在切口的底端打一个结。
4. 清洁小鼠腹部的任何残留血液。

7. 术后护理

1. 腹部闭合后，再皮下注射 10 μL 丁丙诺啡 （0.3 mg/mL） 到颈部。将动物放在以前使用的隔离笼子中，部分放在加热垫上。在笼子的地板上提供一些容易获得的食物。
   注意: 在动物恢复意识之前，不要让动物无人看管。
2. 在手术后 2 小时和 6 小时进行术后控制。仔细观察行为，特别注意任何疼痛迹象;如果需要，再服用 10 μL 布比卡因。
3. 一旦小鼠完全恢复，但不迟于手术后 6 小时且不迟于手术后 24 小时，将其重新引入主笼。密切监控所有相关动物的行为，了解任何攻击性或其他可疑行为。当怀疑动物的任何术后虚弱时，将其隔离过夜以恢复，直到最终重新引入。
4. 手术后 1 天进行最后一次术后控制后，继续对动物进行定期称重。
   注意:术后 4 小时和 8 小时给予镇痛。在术后 12 、 24 和 48 小时进行进一步监测，并检查小鼠是否有任何形式的疼痛或痛苦。如果观察到任何疼痛迹象，则给予另一剂丁丙诺啡。

8. 监测肿瘤生长

1. 使用异氟醚麻醉固定小鼠，并在注射后 2 周开始使用超声检查来观察肿瘤植入¹⁰。
2. 使用 CO₂ 对小鼠实施安乐死。

结果

我们研究了单个肝叶对肝脏总体积的贡献，发现 LLL 占肝脏总体积的 33%。ML 占肝脏总体积的 32%，RSL 占 13%，RIL 占 10%，CL 占 10%（表 2）。箱线图显示，同一品系的不同小鼠之间肝叶的相对贡献是可比的（图 3B）。因此，切除 LLL 可切除 35% 的总肝脏体积，切除 LLL 和 ML 可切除 66% 的总肝脏体积。由于在死后切除独立肝叶以测量体重对肝脏?...

讨论

协议中的关键步骤
小鼠麻醉
麻醉的目标是将小鼠安全地转化为可以耐受手术作的状态。同时，麻醉的作用不宜太强，以防止心肺骤停和随后的死亡。吸入麻醉更容易给药，允许研究人员通过纵蒸发器的流速来调整剂量。这种变化的效果是迅速的。一旦研究人员识别出 III_{期 3}（麻醉的抑郁阶段）的症状/体征，这有助于防止小鼠移动?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817