Um modelo de xenoenxerto organoide derivado de paciente com câncer hepatocelular para investigar o impacto da regeneração hepática no crescimento do tumor

Resumo

Organoides gerados a partir de tumores de pacientes são injetados ortotopicamente no fígado de camundongos. A ressecção do tecido hepático não tumoral leva a um ambiente regenerativo no tecido hepático onde o tumor está localizado.

Resumo

A recorrência representa um desafio notável após o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC), impactando mais de 70% dos pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. A recorrência decorre de micrometástase não detectada ou câncer de novo , potencialmente desencadeado pela regeneração hepática pós-cirúrgica. Pesquisas anteriores empregaram linhagens celulares de CHC em modelos ortotópicos para estudar o impacto da regeneração hepática, mas sua validade limitada levou à necessidade de um modelo mais representativo. Aqui, apresentamos uma nova abordagem utilizando organoides de CHC derivados de pacientes para investigar a influência da regeneração hepática no CHC.

Os tecidos tumorais do paciente são processados para criar organoides tumorais, incorporados em uma matriz tridimensional da membrana basal e cultivados em um meio específico do fígado. Um milhão de organoides são injetados no lobo superior direito (RSL) de camundongos imunodeficientes, confirmando o crescimento macroscópico do tumor por meio de ultrassonografia. O grupo de intervenção é submetido à ressecção do lobo lateral esquerdo (LLL) (30% do volume total do fígado) ou, adicionalmente, do lobo médio (ML) (65% do volume total do fígado) para induzir a regeneração hepática dentro do local do tumor. O grupo controle experimenta relaparotomia sem ressecção do tecido hepático. Após 2 semanas, ambos os grupos são submetidos a explante tumoral e tecidual normal.

Em conclusão, este modelo organoide de CHC derivado do paciente oferece uma plataforma robusta para investigar o impacto da regeneração hepática pós-ressecção do câncer. Sua composição multicelular, diversidade genética e capacidade de cultura prolongada o tornam uma ferramenta inestimável para estudar os mecanismos de recorrência do CHC e possíveis intervenções.

Introdução

A recorrência após o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC) é um desafio significativo, afetando mais de 70% dos pacientes submetidos à ressecção cirúrgica ^1,2,3. Essa recorrência pode resultar de micrometástase não detectada (tumor multicêntrico) ou do desenvolvimento de câncer de novo ⁴. Investigações clínicas e experimentais propõem que o processo de regeneração hepática desencadeado pela ressecção cirúrgica poderia ativar micrometástases latentes, contribuindo para a recorrência do tumor.

Mais pesquisas são necessárias para comparar a expressão gênica e proteica em células hepáticas normais e malignas em um ambiente hepático regenerativo. Além de elucidar os mecanismos subjacentes à recorrência, a identificação de vias de sinalização direcionáveis específicas para células cancerígenas tem potencial para avanços terapêuticos substanciais. Essa abordagem visa conciliar as noções aparentemente contraditórias de um microambiente antitumoral e condições favoráveis para a regeneração hepática.

Modelos anteriores usaram injeção ortotópica de linhagens celulares de CHC para investigar o impacto da regeneração hepática⁵. Este modelo pioneiro emprega organoides HCC derivados de pacientes, oferecendo várias vantagens sobre as linhagens celulares tradicionais. Os organoides mantêm diversas populações de células, espelhando a estrutura e a função do modelo de modelo, ao contrário das linhagens celulares e esferoides. Sua diversidade genética aumenta a representatividade. Além disso, os organoides fornecem estabilidade para cultura estendida, permitindo estudos de intervenção prolongados. Recomendamos a injeção de RSL devido ao seu potencial de regeneração superior em comparação com o lobo inferior direito (RIL). O método descrito aqui fornece uma plataforma usando organoides cancerígenos com vantagens pronunciadas em comparação com as linhagens de células cancerígenas para investigar a questão de pesquisa acima mencionada.

Protocolo

As amostras de fígado usadas para geração de organoides foram obtidas de pacientes operados no Hospital Universitário de Basileia (USB) após consentimento informado por escrito sob aprovação do Comitê de Ética do Noroeste e Central da Suíça (BASEC número 2019-02118). Todos os experimentos com camundongos foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê de Cuidados com Animais de Kanton Basel-Stadt, Suíça (3123-33896). Todos os camundongos eram da linhagem de camundongos gama SCID diabéticos não obesos (NOD) e, portanto, geneticamente modificados para serem imunossuprimidos; Foram utilizados apenas animais machos. Consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados às soluções, reagentes, materiais e instrumentos usados no protocolo. Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral do experimento.

1. Criação de ratos

1. Crie e mantenha camundongos no biotério sob condições específicas livres de patógenos em um horário de 12 horas de dia e 12 horas de noite, com acesso ad libitum a alimentos e água potável.
   NOTA: A implantação dos organoides é realizada com uma idade de 6 a 8 semanas.

2. Amostras clínicas e de pacientes

1. Coloque placas de 12, 24 e 6 poços na incubadora a 37 °C antes de iniciar. Se possível, faça isso com 1 dia de antecedência.
   1. Colete o tecido dentro de 1 h após a ressecção em meio RPMI 1640 e transporte-o para o laboratório para iniciar o processo de dissociação imediatamente. Coloque o tecido em uma placa de Petri de 10 cm (placa pré-aquecida) e adicione uma quantidade suficiente de solução salina estéril para evitar que o tecido seque.
2. Dissociação tecidual do câncer de fígado para a geração de organoides
   1. Pique o tecido em pequenos fragmentos de 1-2 mm² usando bisturis. Use uma pinça de tecido adicional para estabilizar o tecido caso o corte seja difícil.
   2. Coloque os pedaços de tecido em um tubo de 15 mL com 5 mL de tampão de dissociação (pH fisiológico). Colocar a 37 °C (armário/incubadora de aquecimento) num dispositivo de rotação.
   3. Misture pipetando a cada 10 min e deixe por aproximadamente 1-1,5 h, repetindo o processo de mistura a cada 10 min.
      NOTA: A mistura pode exigir o corte da extremidade da pipeta para aumentar o diâmetro do orifício, evitando assim que o tecido de grandes dimensões fique preso na ponta da pipeta.
   4. Colete 10 μL de mistura de tampão de dissociação celular da etapa 2.2.3 em um tubo plástico de 0,5 mL, adicione 10 μL de Trypan Blue e use o contador de células automatizado para avaliar a viabilidade celular e os aglomerados de células. Se os cachos estiverem visíveis, repita o processo de mistura (etapa 3.3.); caso contrário, prossiga para a próxima etapa.
   5. Pegue um tubo de 50 mL, coloque um filtro de células de 100 μm na parte superior e passe a mistura por ele. Com o êmbolo de uma seringa de 5 mL, esmague todos os fragmentos de tecido restantes através do filtro. Lave tudo com 5 mL de Ad-DF+++ e certifique-se de coletar a gota do fundo do filtro.
   6. Transferir o filtrado para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugue por 15 min a 300 × g.
   7. Aspire o sobrenadante com cuidado, tomando cuidado para não tocar no pellet. Adicione 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incube por 5-10 min em temperatura ambiente.
   8. Centrifugue por 5 min a 300 × g. Remova o sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de meio avançado.
3. Contagem de células e avaliação da viabilidade celular
   1. Adicione 10 μL de azul de tripano a um tubo de 1,5 mL e misture com 10 μL da suspensão celular. Coloque 10 μL da mistura nas lâminas de contagem e conte as células.
   2. Separe o número necessário de células para a geração do organoide e centrifugue por 5 min a 300 × g. Geralmente, semeie 80.000 células por cúpula e 20 μL de matriz de membrana basal por cúpula (10 gotas por poço por placa de 6 poços).
   3. Se houver excesso de células em suspensão, suspenda o pellet em meio de congelamento de suspensão celular (10% de DMSO em FBS), transfira-o para um criotubo e coloque-o em um recipiente de congelamento. Transfira imediatamente o tubo para um freezer a -80 °C durante a noite. No dia seguinte, transfira para nitrogênio líquido até que seja necessário.
4. Revestimento para geração de organoides
   1. Remova o sobrenadante. Coloque o tubo no gelo e ressuspenda o pellet com uma matriz de membrana basal.
   2. Retire a placa pré-aquecida da incubadora (pré-aquecida durante a noite). Faça pequenas gotas na placa (20 μL de matriz de membrana basal por cúpula [10 gotas por poço]). Inverta a placa e deixe-a por 5 min no gabinete de fluxo.
   3. Após 5 min, transfira a placa para a incubadora a 37 °C e deixe a placa por ~20 min, permitindo que a matriz solidifique. Adicionar 2 ml de meio de cultura organoide ^6,7.
5. Manutenção da cultura organoide
   1. Substitua o meio a cada 2 dias. Uma vez que os organoides estejam confluentes na cúpula da matriz da membrana basal e prontos para expansão, calcule a taxa de divisão, por exemplo, 2x ou 3x de acordo.
      NOTA: Registre essas informações; será necessário nas próximas etapas.
   2. Remova o meio do canto do poço usando uma ponta P1000, tomando cuidado para não tocar nas cúpulas da matriz.
   3. Adicione 100 μL de tripsina-EDTA a 0,25% por cúpula, raspe, colete-o em um tubo de 15 mL e adicione novamente uma pequena quantidade de tripsina no poço para coletar tudo. Pipete ~10x.
   4. Incubar durante 3 min em banho-maria a 37 °C e pipetar 10x para dissociar as células com uma ponta P1000. Repita esta etapa a cada 3 minutos por no máximo 10 minutos.
   5. Adicione pelo menos o mesmo volume de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / 10% de soro fetal bovino (FBS) / 1% de meio Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep) e misture para cima e para baixo lentamente 2x. Encha com DPBS.
   6. Centrifugue a 300 × g durante 5 min e retire cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda de acordo com a taxa de divisão decidida com base na confluência do organoide, por exemplo, 2x ou 3x a quantidade inicial da matriz da membrana basal.
   7. Retire a placa pré-aquecida da incubadora (pré-aquecida durante a noite). Faça pequenas gotas na placa (20 μL de matriz de membrana basal por cúpula [10 gotas por poço]). Inverta a placa e deixe-a por 5 min no gabinete de fluxo.
   8. Após 5 min, transfira a placa para a incubadora a 37 °C. Deixe a placa por ~20 min, permitindo que a matriz solidifique. Adicione 2 mL de meio de cultura organoide.
6. Preparação de organoides para a confecção de um bloco embebido em parafina fixada em formalina (FFPE)
   1. Remova o meio do canto do poço usando uma ponta P1000, tomando cuidado para não tocar nas cúpulas da matriz. Adicione 200 μL de Dispase (2 mg / mL) e interrompa as gotas com uma ponta de pipeta P1000. Deixe na incubadora por 80 min.
   2. Adicione 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) ao poço, transfira-o para um tubo cônico de 15 mL e encha-o com DPBS. Centrifugue a 300 × g por 5 min, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de paraformaldeído a 4%. Leve à geladeira por pelo menos 1 h.
   3. Centrifugue a 300 × g por 5 min, aspire o paraformaldeído e ressuspenda o pellet com o gel de processamento de amostras para criar uma gota. Aguarde 40 min para que as gotas solidifiquem. Coloque a gota de gel contendo as células em um de histologia. Mova o para desidratar e depois embeba-o em parafina para corte e coloração H / E ^8,9.
7. Preparação de organoides para injeção
   1. Retire a placa que contém o organoide em crescimento da incubadora e coloque-a no gabinete de fluxo.
   2. Siga as etapas 2.5.2 a 2.5.4.
   3. Adicione 2 mL de DMEM e misture.
   4. Adicione 10 μL de azul de tripano a um tubo de 1,5 mL e misture com 10 μL de suspensão celular.
   5. Coloque 10 μL da mistura nas lâminas de contagem e conte as células. Calcule a contagem média de células de ambas as câmaras. Se a diferença for muito grande entre as duas câmaras, considere refazer a contagem.
   6. Calcule o volume de suspensão celular necessário para 10⁶ células e dispense esse volume em tubos de 1,5 mL. Centrifugue a 300 × g por 5 min e coloque os tubos no gelo.
   7. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 5 μL de DMEM e 5 μL de matriz da membrana basal. Misture cuidadosamente a suspensão pipetando, mantendo a suspensão fria durante o processo.
   8. Coloque os tubos de 1,5 ml contendo os organoides no gelo durante o transporte para os ratinhos e proceda à injeção.

3. Injeção de organoide no camundongo

1. Etapas perioperatórias
   1. Remova o animal experimental da gaiola principal e coloque-o em uma gaiola isolada e fresca com água.
   2. Anestesiar o mouse com 1,5% a 2,5% de isoflurano.
   3. Realize uma injeção subcutânea no pescoço com 10 μL de buprenorfina (0,3 mg/mL) 30 minutos antes do início da cirurgia.
   4. Imediatamente antes do início da cirurgia, pinte cuidadosamente os olhos dos animais com Carbomerum (por exemplo, Lacrinorm) para evitar qualquer ressecamento dos olhos durante a cirurgia. Não toque na córnea durante a aplicação para evitar qualquer erosão da córnea.
   5. Coloque os animais em uma superfície limpa e estéril e manuseie-os com luvas de plástico novas, rede de cabelo e um jaleco especial de trabalho de laboratório usado apenas nas instalações de ratos.
   6. Use dois faróis emissores de calor próximos ao animal para fornecer uma visão suficiente. Se houver alguma dúvida ou preocupação com a hipotermia durante a cirurgia, use outra lâmpada de aquecimento ou tapete de aquecimento.
2. Laparotomia
   NOTA: Antes do início do procedimento cirúrgico, a profundidade da anestesia foi verificada pelo teste de pinça do dedo do pé. Durante o procedimento, a anestesia adequada foi fornecida por meio de verificações de rotina e monitoramento da frequência respiratória e ajustada se houvesse um aumento relevante. O equipamento cirúrgico foi limpo e desinfetado de acordo com as diretrizes internas de nossa bioteconomia.
   1. Coloque o mouse anestesiado em decúbito dorsal, estenda as quatro extremidades e fixe-as com fita adesiva. Remova o pelo aplicando um creme depilatório e use um lenço úmido para remover o excesso de creme e pelo.
      NOTA: A depilação funciona melhor se um cotonete for usado para massagear o creme no pelo contra o grão.
   2. Localize a linha alba, que é o alvo da laparotomia. Identifique também as artérias epigástricas superior e inferior. Tome cuidado para não danificar os vasos para evitar ferimentos.
   3. Faça uma incisão ao longo da linha alba com pinça e tesoura microcirúrgica do abdômen inferior até a cartilagem xifóide.
   4. Insira os retratores e ajuste a direção de tração para uma exposição ideal do abdômen superior (Figura 2A,B).
      NOTA: Usamos clipes de papel dobrados como retratores com elásticos anexados para fixação.
3. Injeção de organoides
   1. Coloque um guardanapo limpo ao lado da incisão e coloque algumas gotas de soro fisiológico nele. Exteriorize o intestino delgado e o ceco e coloque-o sobre o guardanapo úmido.
   2. Exponha o lobo superior direito (RSL) até que uma injeção seja possível.
   3. Prepare a seringa Hamilton, lave-a com água e coloque uma marca a 2-3 mm da ponta como referência para a injeção.
   4. Retire a seringa com a mistura organoide preparada e injete a agulha até a marca. Injete lentamente os organoides em uma posição estável; Não mova a agulha durante este tempo.
   5. Aguarde 15-20 s para evitar o refluxo da mistura. Remova a agulha e coloque um pouco de pressão com um cotonete no local da injeção. Verifique o abdômen quanto a uma ruptura do lobo hepático e refluxo. Enxágue o abdômen com 0,5 mL de solução salina estéril e feche o abdômen com uma sutura contínua usando uma sutura reabsorvível.
      NOTA: O local cirúrgico foi coberto por um campo estéril. Os instrumentos cirúrgicos utilizados durante o procedimento foram limpos principalmente com água e agentes de limpeza para remoção de remanescentes macroscópicos. Os instrumentos foram então processados em uma solução de esterilização. Consumíveis como fios, luvas ou cotonetes eram usados apenas uma vez por razões higiênicas e eram estéreis.

4. Ressecção menor (30% do tecido hepático)

1. Realize a laparotomia conforme indicado acima na etapa 3.2.
2. Use cotonetes úmidos e empurre o ML cranialmente para criar mais espaço no campo cirúrgico do MIE.
3. Vire o MIE cranialmente e exponha o lobo caudado (LC) e o ligamento, que está habitualmente presente entre o LC e o LLL (Figura 2C).
4. Corte o ligamento completamente e insira a ligadura (fio fino não reabsorvível, por exemplo, Prolene 5-0) abaixo do LLL. Para garantir que ele permaneça nesta posição, umedeça a ligadura e mova-a em direção ao quadrante superior direito.
5. Vire o LLL caudalmente. Guie a extremidade livre esquerda da ligadura ao redor da ponta esquerda do LLL. Guie a extremidade livre direita da ligadura ao redor da ponta direita do MIE. Aplique tração caudal no MIE com um cotonete e garanta o posicionamento correto e central da ligadura.
6. Dê um meio nó duplo. Prenda o nó com um segundo nó amarrado na outra direção sem apertá-lo totalmente. Aperte um pouco os nós, verifique o posicionamento correto da ligadura e reposicione-a para garantir um bom posicionamento.
7. Aperte o nó completamente segurando a extremidade livre do crânio na posição com uma pinça de ponta romba e puxe a extremidade livre caudal com outro par de pinças (Figura 2D). Prenda o nó com um segundo nó amarrado na direção oposta.
8. Ressecção o lobo do fígado. Corte rente à ligadura sem cortá-la.

5. Ressecção maior (65% do tecido hepático)

1. Realize a pequena ressecção do LLL conforme indicado acima (etapas 3.4.1-3.4.8).
2. Passe o ligamento falciforme para mobilizar o ML. Vire o lobo cranialmente. Insira a ligadura abaixo do lóbulo e vire o lóbulo caudalmente.
3. Enrole as extremidades livres ao redor do lóbulo. Repita a colocação da ligadura em caso de extravio durante a manipulação. Assim que a ligadura estiver posicionada corretamente, coloque um meio nó duplo, amarre-o lentamente e reposicione a ligadura, se necessário.
4. Dê um nó na segunda metade na direção oposta e aperte-o completamente. Adicione um terceiro meio nó na direção oposta.
5. Ressece o lóbulo.
6. Lave o abdômen com solução salina estéril e coloque os intestinos em seu lugar anatômico.

6. Fechamento do abdômen

1. Pegue a pele e o peritônio com uma pinça e faça um ponto com uma sutura reabsorvível (por exemplo, Monocryl 5-0) na extremidade superior da linha de incisão. Certifique-se de sair pelo lado peritoneal.
2. Faça o segundo ponto na contraparte da incisão, saindo pelo lado da pele. Amarre bem o nó, deixando a extremidade livre sem a agulha curta e a ponta com a agulha longa. Corte a extremidade curta em um comprimento de 2 mm.
3. Continue a sutura contínua e termine com um nó na extremidade inferior da incisão.
4. Limpe o abdômen do camundongo de qualquer sangue restante.

7. Cuidados pós-operatórios

1. Após o fechamento do abdômen, injete mais 10 μL de buprenorfina (0,3 mg / mL) por via subcutânea no pescoço. Coloque os animais na gaiola isolada usada anteriormente, parcialmente colocada em uma esteira de aquecimento. Forneça um pouco de comida facilmente acessível no chão da gaiola.
   NOTA: Não deixe o animal sozinho até que ele recupere a consciência.
2. Realizar controles pós-operatórios 2 h e 6 h após a cirurgia. Observe atentamente o comportamento com atenção especial a qualquer sinal de dor; administre mais 10 μL de Bupivacaína, se necessário.
3. Assim que o camundongo estiver totalmente recuperado, mas não antes de 6 h após a cirurgia e não depois de 24 h após a cirurgia, reintroduza-o na gaiola principal. Monitore de perto o comportamento de todos os animais envolvidos em relação a qualquer agressão ou outro comportamento suspeito. Em caso de dúvida de qualquer fraqueza pós-operatória do animal, deixe-o isolado durante a noite para se recuperar até a reintrodução final.
4. Após o controle pós-operatório final 1 dia após a cirurgia, proceder à pesagem regular dos animais.
   NOTA: A analgesia foi administrada 4 e 8 horas de pós-operatório. O monitoramento adicional foi realizado em 12, 24 e 48 horas de pós-operatório, e os camundongos foram verificados quanto a qualquer tipo de dor ou angústia. Se algum sinal de dor fosse observado, outra dose de buprenorfina era administrada.

8. Monitoramento do crescimento do tumor

1. Imobilize os camundongos usando anestesia com isoflurano e use a ultrassonografia para visualizar a implantação do tumor começando 2 semanas após a injeção¹⁰.
2. Eutanasiar os camundongos usando CO₂.

Resultados

Analisamos a contribuição dos lobos hepáticos individuais para o volume total do fígado e descobrimos que o LLL representa 33% do volume total do fígado. A LM representa 32% do volume hepático total, a RSL 13%, a RIL 10% e a CL 10% (Tabela 2). Os boxplots mostram que a contribuição relativa dos lobos do fígado é comparável entre os diferentes camundongos da mesma cepa (Figura 3B). Assim, uma ressecção do LLL resulta em uma resse...

Discussão

Etapas críticas no protocolo
Anestesia em camundongos
O objetivo da anestesia é converter o camundongo com segurança em um estado em que ele tolere a manipulação cirúrgica. Ao mesmo tempo, o efeito da anestesia não deve ser muito forte, para evitar parada cardiorrespiratória e consequente morte. A anestesia inalante é mais fácil de dosar, permitindo que o pesquisador ajuste a dose manipulando a taxa de fluxo do vaporizador. O efeito da m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817