Un modelo de xenoinjerto de organoide derivado de pacientes con cáncer hepatocelular para investigar el impacto de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral

Resumen

Los organoides generados a partir de los tumores de los pacientes se inyectan ortotópicamente en el hígado del ratón. La resección del tejido hepático no tumoral conduce a un entorno regenerativo en el tejido hepático donde se encuentra el tumor.

Resumen

La recurrencia plantea un desafío notable después del tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC), ya que afecta a más del 70% de los pacientes que se someten a una resección quirúrgica. La recurrencia se deriva de micrometástasis no detectadas o cáncer de novo , potencialmente desencadenado por la regeneración hepática posquirúrgica. Investigaciones anteriores emplearon líneas celulares de HCC en modelos ortotópicos para estudiar el impacto de la regeneración hepática, pero su validez limitada impulsó la necesidad de un modelo más representativo. Aquí, presentamos un enfoque novedoso que utiliza organoides de CHC derivados del paciente para investigar la influencia de la regeneración hepática en el CHC.

Los tejidos tumorales de los pacientes se procesan para crear organoides tumorales, se incrustan en una matriz tridimensional de la membrana basal y se cultivan en un medio específico para el hígado. Se inyectan un millón de organoides en el lóbulo superior derecho (RSL) de ratones inmunodeficientes, lo que confirma el crecimiento macroscópico del tumor mediante ecografía. El grupo de intervención se somete a una resección del lóbulo lateral izquierdo (LLL) (30% del volumen hepático total) o, adicionalmente, del lóbulo medio (ML) (65% del volumen hepático total) para inducir la regeneración hepática dentro del sitio tumoral. El grupo de control experimenta una relaparotomía sin resección del tejido hepático. Después de 2 semanas, ambos grupos se someten a una explantación tumoral y de tejido normal.

En conclusión, este modelo de organoide de CHC derivado del paciente ofrece una plataforma sólida para investigar el impacto de la regeneración hepática después de la resección del cáncer. Su composición multicelular, su diversidad genética y su capacidad de cultivo prolongado lo convierten en una herramienta invaluable para estudiar los mecanismos de recurrencia del CHC y sus posibles intervenciones.

Introducción

La recurrencia tras el tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC) es un reto importante, que afecta a más del 70% de los pacientes sometidos a resección quirúrgica ^1,2,3. Esta recurrencia puede deberse a una micrometástasis no detectada (tumor multicéntrico) o al desarrollo de un cáncer de novo ⁴. Tanto las investigaciones clínicas como las experimentales proponen que el proceso de regeneración hepática desencadenado por la resección quirúrgica podría activar las micrometástasis latentes, contribuyendo a la recurrencia tumoral.

Se necesita más investigación para comparar la expresión génica y proteica en células hepáticas normales y malignas dentro de un entorno hepático regenerativo. Además de dilucidar los mecanismos que subyacen a la recurrencia, la identificación de vías de señalización específicas para las células cancerosas tiene el potencial de avances terapéuticos sustanciales. Este enfoque tiene como objetivo reconciliar las nociones aparentemente contradictorias de un microambiente antitumoral y las condiciones favorables para la regeneración hepática.

Los modelos anteriores han utilizado la inyección ortotópica de líneas celulares de HCC para investigar el impacto de la regeneración hepática⁵. Este modelo pionero emplea organoides de HCC derivados de pacientes, lo que ofrece varias ventajas sobre las líneas celulares tradicionales. Los organoides mantienen diversas poblaciones celulares, reflejando la estructura y función de la plantilla del modelo, a diferencia de las líneas celulares y los esferoides. Su diversidad genética aumenta la representatividad. Además, los organoides proporcionan estabilidad para el cultivo extendido, lo que permite estudios de intervención prolongados. Recomendamos la inyección de RSL debido a su potencial de regeneración superior en comparación con el lóbulo inferior derecho (RIL). El método descrito aquí proporciona una plataforma que utiliza organoides cancerosos con ventajas pronunciadas en comparación con las líneas celulares cancerosas para investigar la pregunta de investigación antes mencionada.

Protocolo

Las muestras de hígado utilizadas para la generación de organoides se obtuvieron de pacientes operados en el Hospital Universitario de Basilea (USB) tras el consentimiento informado por escrito y con la aprobación del Comité de Ética de Suiza del Noroeste y Central (número BASEC 2019-02118). Todos los experimentos con ratones fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices y regulaciones del Comité de Cuidado de Animales de Kanton Basel-Stadt, Suiza (3123-33896). Todos los ratones pertenecían a la cepa de ratón SCID gamma diabéticos no obesos (NOD) y, por lo tanto, modificados genéticamente para ser inmunosuprimidos; Solo se utilizaron animales machos. Consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales para obtener detalles relacionados con las soluciones, los reactivos, los materiales y los instrumentos utilizados en el protocolo. Consulte la figura 1 para obtener una descripción general del experimento.

1. Cría de ratones

1. Cría y mantiene ratones en la instalación de animales en condiciones específicas libres de patógenos en un horario de 12 horas de día y 12 horas de noche con acceso ad libitum a alimentos y agua potable.
   NOTA: La implantación de los organoides se realiza a una edad de 6-8 semanas.

2. Muestras clínicas y de pacientes

1. Coloque placas de 12, 24 y 6 pocillos en la incubadora a 37 °C antes de comenzar. Si es posible, hágalo con 1 día de anticipación.
   1. Recoja el tejido dentro de 1 h después de la resección en medio RPMI 1640 y transpórtelo al laboratorio para iniciar el proceso de disociación de inmediato. Coloque el pañuelo en una placa de Petri de 10 cm (placa precalentada) y agregue una cantidad suficiente de solución salina estéril para evitar que el tejido se seque.
2. Disociación del tejido del cáncer de hígado para la generación de organoides
   1. Picar el tejido en pequeños fragmentos de 1-2^mm2 con bisturíes. Use pinzas de tejido adicionales para estabilizar el tejido en caso de que el corte sea difícil.
   2. Colocar los trozos de tejido en un tubo de 15 mL con 5 mL de tampón de disociación (pH fisiológico). Colocar a 37 °C (armario de calentamiento/incubadora) en un dispositivo de rotación.
   3. Mezclar pipeteando cada 10 min y dejar actuar durante aproximadamente 1-1,5 h, repitiendo el proceso de mezcla cada 10 min.
      NOTA: La mezcla puede requerir cortar el extremo de la pipeta para aumentar el diámetro del orificio, evitando así que el tejido de gran tamaño se atasque en la punta de la pipeta.
   4. Recoja 10 μL de mezcla de tampón de disociación celular del paso 2.2.3 en un tubo de plástico de 0,5 mL, agregue 10 μL de Trypan Blue y use el contador de células automatizado para evaluar la viabilidad celular y los grupos de células. Si los racimos son visibles, repita el proceso de mezcla (paso 3.3.); de lo contrario, continúe con el siguiente paso.
   5. Tome un tubo de 50 ml, coloque un filtro de células de 100 μm en la parte superior y pase la mezcla a través de él. Con el émbolo de una jeringa de 5 ml, aplaste todos los fragmentos de tejido restantes a través del filtro. Lave todo con 5 ml de Ad-DF+++ y asegúrese de recoger la gota de la parte inferior del filtro.
   6. Transfiera el filtrado a un tubo cónico de 15 mL. Centrífuga durante 15 min a 300 × g.
   7. Aspire el sobrenadante con cuidado, teniendo cuidado de no tocar el pellet. Agregue 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
   8. Centrifugar durante 5 min a 300 × g. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en 1 mL de medio avanzado.
3. Recuento de células y evaluación de la viabilidad celular
   1. Añadir 10 μL de azul de tripano a un tubo de 1,5 mL y mezclar con 10 μL de la suspensión celular. Coloque 10 μL de la mezcla en los portaobjetos de conteo y cuente las celdas.
   2. Separar el número necesario de células para la generación de organoides y centrifugar durante 5 min a 300 × g. Generalmente, siembre 80.000 células por cúpula y 20 μL de matriz de membrana basal por cúpula (10 gotas por pocillo por placa de 6 pocillos).
   3. Si queda algún exceso de células en suspensión, suspenda el pellet en un medio de congelación de suspensión celular (10% de DMSO en FBS), transfiéralo a un tubo criogénico y colóquelo en un recipiente de congelación. Transfiera inmediatamente el tubo a un congelador de -80 °C durante la noche. Al día siguiente, transfiéralo a nitrógeno líquido hasta que lo necesite.
4. Recubrimiento para la generación de organoides
   1. Retire el sobrenadante. Coloque el tubo sobre hielo y vuelva a suspender el pellet con una matriz de membrana basal.
   2. Saque la placa precalentada de la incubadora (precalentada durante la noche). Hacer pequeñas gotas en la placa (20 μL de matriz de membrana basal por cúpula [10 gotas por pocillo]). Invierta la placa y déjela durante 5 minutos en la cabina de flujo.
   3. Después de 5 minutos, transfiera la placa a la incubadora a 37 °C y deje la placa durante ~20 minutos, permitiendo que la matriz se solidifique. Añadir 2 mL de medio de cultivo de organoides ^6,7.
5. Mantenimiento del cultivo de organoides
   1. Reemplace el medio cada 2 días. Una vez que los organoides confluyan en la cúpula de la matriz de la membrana basal y estén listos para la expansión, calcule la relación de división, por ejemplo, 2x o 3x según corresponda.
      NOTA: Registre esta información; Será necesario en los próximos pasos.
   2. Retire el medio de la esquina del pozo con una punta P1000, teniendo cuidado de no tocar las cúpulas de la matriz.
   3. Agregue 100 μL de tripsina-EDTA al 0,25% por domo, raspe, recójalo en un tubo de 15 mL y agregue nuevamente una pequeña cantidad de tripsina en el pozo para recolectar todo. Pipetea ~10x.
   4. Incubar durante 3 min en el baño de agua a 37 °C y pipetear 10x para disociar las células con una punta P1000. Repita este paso cada 3 minutos durante un máximo de 10 minutos.
   5. Agregue al menos el mismo volumen del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/10% de suero fetal bovino (FBS)/1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) y mezcle hacia arriba y hacia abajo lentamente 2 veces. Llene con DPBS.
   6. Centrifugar a 300 × g durante 5 min y retirar con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender de acuerdo con la relación de división decidida en función de la confluencia del organoide, por ejemplo, 2 o 3 veces la cantidad inicial de matriz de membrana basal.
   7. Saque la placa precalentada de la incubadora (precalentada durante la noche). Hacer pequeñas gotas en la placa (20 μL de matriz de membrana basal por cúpula [10 gotas por pocillo]). Invierta la placa y déjela durante 5 minutos en la cabina de flujo.
   8. Después de 5 minutos, transfiera la placa a la incubadora a 37 °C. Deje la placa durante ~ 20 minutos, permitiendo que la matriz se solidifique. Añadir 2 mL de medio de cultivo de organoides.
6. Preparación de organoides para la fabricación de un bloque embebido en parafina fijado en formol (FFPE)
   1. Retire el medio de la esquina del pozo con una punta P1000, teniendo cuidado de no tocar las cúpulas de la matriz. Añadir 200 μL de Dispasa (2 mg/mL) y cortar las gotas con una punta de pipeta P1000. Dejar en la incubadora durante 80 min.
   2. Agregue 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco al pocillo, transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL y llénelo con DPBS. Centrifugar a 300 × g durante 5 min, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de paraformaldehído al 4%. Refrigere durante al menos 1 h.
   3. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos, aspirar el paraformaldehído y volver a suspender el pellet con el gel de procesamiento de muestras para crear una gota. Espere 40 minutos para que las gotas se solidifiquen. Coloque la gota de gel que contiene las células en un casete de histología. Mueva el casete para deshidratarlo y luego insértelo en parafina para cortar y teñir H/E ^8,9.
7. Preparación de organoides para inyección
   1. Saque la placa que contiene el organoide en crecimiento de la incubadora y colóquela en el gabinete de flujo.
   2. Siga los pasos 2.5.2 a 2.5.4.
   3. Añadir 2 mL de DMEM y mezclar.
   4. Añadir 10 μL de azul de tripano a un tubo de 1,5 mL y mezclar con 10 μL de suspensión celular.
   5. Coloque 10 μL de la mezcla en los portaobjetos de conteo y cuente las celdas. Calcule el recuento promedio de células de ambas cámaras. Si la diferencia es demasiado grande entre las dos cámaras, considere rehacer el conteo.
   6. Calcule el volumen de suspensión celular requerido para 10⁶ celdas y dispense este volumen a tubos de 1,5 mL. Centrifugar a 300 × g durante 5 min y colocar los tubos en hielo.
   7. Retire con cuidado el sobrenadante y agregue 5 μL de DMEM y 5 μL de matriz de membrana basal. Mezcle cuidadosamente la suspensión pipeteando mientras mantiene la suspensión fría durante el proceso.
   8. Coloque los tubos de 1,5 ml que contienen los organoides en hielo durante el transporte a los ratones y proceda a la inyección.

3. Inyección de organoide en ratón

1. Pasos perioperatorios
   1. Retire al animal de experimentación de la jaula principal y colóquelo en una jaula fresca y aislada con agua.
   2. Anestesiar al ratón con 1,5% a 2,5% de isoflurano.
   3. Realizar una inyección subcutánea en el cuello con 10 μL de Buprenorfina (0,3 mg/mL) 30 min antes del inicio de la cirugía.
   4. Inmediatamente antes del inicio de la cirugía, pinte cuidadosamente los ojos de los animales con carbómero (por ejemplo, Lacrinorm) para evitar cualquier sequedad de los ojos durante la cirugía. No toque la córnea durante la aplicación para evitar cualquier erosión de la córnea.
   5. Coloque a los animales sobre una superficie limpia y estéril y manéjelos con guantes de plástico nuevos, redecilla para el cabello y una bata de trabajo de laboratorio especial que se usa solo en las instalaciones de ratones.
   6. Utilice dos faros emisores de calor cerca del animal para proporcionar una vista suficiente. Si hay alguna duda o preocupación sobre la hipotermia durante la cirugía, use otra lámpara calefactora o estera calefactora.
2. Laparotomía
   NOTA: Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, se verificó la profundidad de la anestesia mediante la prueba de pinzamiento del dedo del pie. Durante el procedimiento, se proporcionó anestesia adecuada a través de controles de rutina y monitoreo de la frecuencia respiratoria y se ajustó si había un aumento relevante. El equipo quirúrgico se limpió y desinfectó de acuerdo con las pautas internas de nuestro parque de animales.
   1. Coloque el ratón anestesiado en posición supina, extienda las cuatro extremidades y fíjelas con cinta adhesiva. Retira el pelaje aplicando una crema depilatoria y utiliza un pañuelo húmedo para eliminar el exceso de crema y pelaje.
      NOTA: La depilación funciona mejor si se usa un hisopo de algodón para masajear la crema en el pelaje a contrapelo.
   2. Localizar la línea alba, que es el objetivo de la laparotomía. Identifica también las arterias epigástricas superior e inferior. Tenga cuidado de no dañar los vasos para evitar lesiones.
   3. Hacer una incisión a lo largo de la línea alba con pinzas y tijeras microquirúrgicas desde la parte inferior del abdomen hasta el cartílago xifoides.
   4. Inserte los retractores y ajuste la dirección de tracción para una exposición óptima de la parte superior del abdomen (Figura 2A, B).
      NOTA: Utilizamos clips de papel doblados como retractores con bandas de goma adjuntas para la fijación.
3. Inyección de organoides
   1. Coloque una servilleta limpia justo al lado de la incisión y coloque unas gotas de solución salina sobre ella. Exterioriza el intestino delgado y el ciego y colócalo sobre la servilleta húmeda.
   2. Exponga el lóbulo superior derecho (RSL) hasta que sea posible una inyección.
   3. Prepare la jeringa Hamilton, enjuáguela con agua y coloque una marca a 2-3 mm de la punta como referencia para la inyección.
   4. Extrae la jeringa con la mezcla de organoides preparada e inyecta la aguja hasta la marca. Inyecte lentamente los organoides en una posición estable; No mueva la aguja durante este tiempo.
   5. Espere 15-20 s para evitar el reflujo de la mezcla. Retire la aguja y ejerza un poco de presión con un bastoncillo de algodón en el lugar de la inyección. Revise el abdomen para ver si hay una ruptura del lóbulo hepático y reflujo. Enjuague el abdomen con 0,5 mL de solución salina estéril y cierre el abdomen con una sutura corrida utilizando una sutura reabsorbible.
      NOTA: El sitio quirúrgico estaba cubierto por un paño estéril. Los instrumentos quirúrgicos utilizados durante el procedimiento se limpiaron principalmente con agua y agentes de limpieza para eliminar los restos macroscópicos. A continuación, los instrumentos se procesaron en una solución de esterilización. Los consumibles, como hilos, guantes o bastoncillos de algodón, solo se utilizaron una vez por razones higiénicas y eran estériles.

4. Resección menor (30% del tejido hepático)

1. Realice la laparotomía como se indicó anteriormente en el paso 3.2.
2. Utilice bastoncillos de algodón húmedos y empuje el ML cranealmente para crear más espacio en el campo quirúrgico de la LLL.
3. Voltear la LLL cranealmente y exponer el lóbulo caudado (CL) y el ligamento, que habitualmente está presente entre la CL y la LLL (Figura 2C).
4. Corte el ligamento por completo e inserte la ligadura (hilo fino no reabsorbible, por ejemplo, Prolene 5-0) por debajo de la LLL. Para asegurarse de que permanezca en esta posición, humedezca la ligadura y muévala hacia el cuadrante superior derecho.
5. Dale la vuelta a la LLL caudalmente. Guíe el extremo libre izquierdo de la ligadura alrededor de la punta izquierda de la LLL. Guíe el extremo libre derecho de la ligadura alrededor de la punta derecha de la LLL. Aplique la tracción caudal sobre la LLL con un bastoncillo de algodón y asegure la posición correcta y central de la ligadura.
6. Haz un medio nudo doble. Asegure el nudo con un segundo medio nudo atado en la otra dirección sin apretarlo completamente. Apriete un poco los nudos, verifique la colocación correcta de la abrazadera y vuelva a colocarla para garantizar un buen posicionamiento.
7. Apriete el nudo completamente sosteniendo el extremo libre del cráneo en su posición con pinzas de punta roma y tire del extremo libre caudal con otro par de pinzas (Figura 2D). Asegure el nudo con un segundo medio nudo atado en la dirección opuesta.
8. Reseca el lóbulo del hígado. Corte cerca de la ligadura sin cortarla.

5. Resección mayor (65% del tejido hepático)

1. Realice la resección menor de la LLL como se indicó anteriormente (pasos 3.4.1-3.4.8).
2. Transecte el ligamento falciforme para movilizar el ML. Voltea el lóbulo cranealmente. Inserte la ligadura por debajo del lóbulo y voltee el lóbulo caudalmente.
3. Enrolla los extremos libres alrededor del lóbulo. Repetir la colocación de la ligadura en caso de extravío durante la manipulación. Una vez que la ligadura esté colocada correctamente, coloque un medio nudo doble, átelo lentamente y vuelva a colocar la ligadura si es necesario.
4. Haz un segundo medio nudo en la dirección opuesta y apriétalo completamente. Añade un tercer medio nudo en la dirección opuesta.
5. Reseca el lóbulo.
6. Enjuague el abdomen con solución salina estéril y coloque los intestinos en su lugar anatómico.

6. Cierre del abdomen

1. Agarre la piel y el peritoneo con pinzas y haga una sutura con una sutura reabsorbible (p. ej., Monocryl 5-0) en el extremo superior de la línea de incisión. Asegúrese de salir por el lado peritoneal.
2. Realice el segundo punto en la parte posterior de la incisión, saliendo por el lado de la piel. Haz el nudo con fuerza dejando el extremo libre sin la aguja corto y el extremo con la aguja largo. Corta el extremo corto a una longitud de 2 mm.
3. Continúe la sutura continua y termine con un nudo en el extremo inferior de la incisión.
4. Limpia el abdomen del ratón de cualquier resto de sangre.

7. Cuidados postoperatorios

1. Después del cierre del abdomen, inyecte otros 10 μL de Buprenorfina (0,3 mg/mL) por vía subcutánea en el cuello. Coloque a los animales en la jaula aislada utilizada anteriormente, parcialmente colocada sobre una alfombra calefactora. Proporcione algo de comida de fácil acceso en el piso de la jaula.
   NOTA: No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia.
2. Realizar controles postoperatorios a las 2 h y a las 6 h después de la cirugía. Observar de cerca el comportamiento con especial atención a cualquier signo de dolor; administrar otros 10 μL de Bupivacaína si es necesario.
3. Una vez que el ratón esté completamente recuperado, pero no antes de 6 horas después de la cirugía y no más tarde de 24 horas después de la cirugía, vuelva a introducirlo en la jaula principal. Vigile de cerca el comportamiento de todos los animales involucrados con respecto a cualquier agresión u otro comportamiento sospechoso. En caso de duda de cualquier debilidad postoperatoria del animal, dejarlo aislado durante la noche para que se recupere hasta la reintroducción final.
4. Tras el último control postoperatorio 1 día después de la cirugía, se procede al pesaje regular de los animales.
   NOTA: La analgesia se administró a las 4 y 8 horas del postoperatorio. Se realizó un seguimiento adicional a las 12, 24 y 48 horas después de la operación, y se revisó a los ratones para detectar cualquier tipo de dolor o angustia. Si se observaba algún signo de dolor, se administraba otra dosis de buprenorfina.

8. Seguimiento del crecimiento tumoral

1. Inmovilice a los ratones con anestesia con isoflurano y utilice la ecografía para visualizar la implantación del tumor a partir de las 2 semanas posteriores a la inyección^.
2. Sacrificar a los ratones con CO₂.

Resultados

Observamos la contribución de los lóbulos hepáticos individuales al volumen hepático total y encontramos que la LLL representa el 33% del volumen hepático total. El ML representa el 32% del volumen hepático total, el RSL el 13%, el RIL el 10% y el CL el 10% (Tabla 2). Los diagramas de caja muestran que la contribución relativa de los lóbulos del hígado es comparable entre los diferentes ratones de la misma cepa (Figura 3B). Por lo t...

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Anestesia para ratones
El objetivo de la anestesia es convertir al ratón de forma segura en un estado en el que tolere la manipulación quirúrgica. Al mismo tiempo, el efecto de la anestesia no debe ser demasiado fuerte, para evitar el paro cardiorrespiratorio y la consiguiente muerte. La anestesia inhalante es más fácil de dosificar, lo que permite al investigador ajustar la dosis manipulando el caudal del vapo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817