Karaciğer Rejenerasyonunun Tümör Büyümesi Üzerindeki Etkisini Araştırmak İçin Hepatosellüler Kanser Hastasından Elde Edilen Bir Organoid Ksenogreft Modeli

Özet

Hasta tümörlerinden üretilen organoidler ortotopik olarak fare karaciğerine enjekte edilir. Tümör olmayan karaciğer dokusunun rezeksiyonu, tümörün bulunduğu karaciğer dokusunda rejeneratif bir ortama yol açar.

Özet

Nüks, hepatosellüler karsinom (HCC) tedavisinden sonra kayda değer bir zorluk teşkil eder ve cerrahi rezeksiyon uygulanan hastaların %70'inden fazlasını etkiler. Nüks, potansiyel olarak cerrahi sonrası karaciğer rejenerasyonu ile tetiklenen tespit edilmemiş mikro metastaz veya de novo kanserden kaynaklanır. Önceki araştırmalar, karaciğer rejenerasyonunun etkisini incelemek için ortotopik modellerde HCC hücre dizilerini kullandı, ancak sınırlı geçerlilikleri daha temsili bir modele ihtiyaç duyulmasına neden oldu. Burada, karaciğer rejenerasyonunun HCC üzerindeki etkisini araştırmak için hastadan türetilen HCC organoidlerini kullanan yeni bir yaklaşım sunuyoruz.

Hasta tümör dokuları, tümör organoidleri oluşturmak için işlenir, üç boyutlu bir bazal membran matrisine gömülür ve karaciğere özgü bir ortamda kültürlenir. İmmün yetmezliği olan farelerin sağ superior lobuna (RSL) bir milyon organoid enjekte edilir ve sonografi ile makroskopik tümör büyümesini doğrular. Müdahale grubu, tümör bölgesinde karaciğer rejenerasyonunu indüklemek için sol lateral lob (LLL) (toplam karaciğer hacminin %30'u) veya ek olarak orta lob (ML) (toplam karaciğer hacminin %65'i) rezeksiyonuna tabi tutulur. Kontrol grubu, karaciğer dokusu rezeksiyonu olmadan yeniden laparotomi yaşar. 2 hafta sonra, her iki gruba da tümör ve normal doku eksplantasyonu yapılır.

Sonuç olarak, bu hastadan türetilen HCC organoid modeli, kanser sonrası rezeksiyon sonrası karaciğer rejenerasyonunun etkisini araştırmak için sağlam bir platform sunmaktadır. Çok hücreli bileşimi, genetik çeşitliliği ve uzun süreli kültür yetenekleri, onu HCC nüks mekanizmalarını ve potansiyel müdahaleleri incelemek için paha biçilmez bir araç haline getirir.

Giriş

Hepatosellüler karsinom (HCC) tedavisini takiben nüks, cerrahi rezeksiyon uygulanan hastaların %70'inden fazlasını etkileyen önemli bir zorluktur ^1,2,3. Bu nüks, tespit edilemeyen mikro-metastaz (multisentrik tümör) veya de novo kanser⁴ gelişiminden kaynaklanabilir. Hem klinik hem de deneysel araştırmalar, cerrahi rezeksiyon ile tetiklenen karaciğer rejenerasyon sürecinin latent mikro-metastazları aktive ederek tümör nüksüne katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir.

Rejeneratif bir karaciğer ortamında normal ve malign karaciğer hücrelerinde gen ve protein ekspresyonunu karşılaştırmak için daha fazla araştırma gereklidir. Nüksün altında yatan mekanizmaları aydınlatmanın yanı sıra, kanser hücrelerine özgü hedeflenebilir sinyal yollarının belirlenmesi, önemli terapötik ilerlemeler için potansiyel taşır. Bu yaklaşım, anti-tümör mikroçevresi ve karaciğer rejenerasyonu için elverişli koşulların görünüşte çelişkili kavramlarını uzlaştırmayı amaçlamaktadır.

Önceki modeller, karaciğer rejenerasyonunun etkisini araştırmak için HCC hücre hatlarının ortotopik enjeksiyonunu kullanmıştır⁵. Bu öncü model, geleneksel hücre hatlarına göre çeşitli avantajlar sunan, hastadan türetilen HCC organoidlerini kullanır. Organoidler, hücre dizileri ve sferoidlerin aksine, model şablonunun yapısını ve işlevini yansıtarak çeşitli hücre popülasyonlarını korur. Genetik çeşitlilikleri temsiliyeti artırır. Ek olarak, organoidler genişletilmiş kültür için stabilite sağlayarak uzun süreli müdahale çalışmalarına olanak tanır. Sağ inferior loba (RIL) kıyasla daha üstün rejenerasyon potansiyeli nedeniyle RSL enjeksiyonunu öneriyoruz. Burada açıklanan yöntem, yukarıda bahsedilen araştırma sorusunu araştırmak için kanser hücre dizilerine kıyasla belirgin avantajlara sahip kanser organoidlerini kullanan bir platform sağlar.

Protokol

Organoid üretimi için kullanılan karaciğer örnekleri, Kuzeybatı ve Orta İsviçre Etik Komitesi'nin onayı altında yazılı bilgilendirilmiş onamın ardından Basel Üniversite Hastanesi'nde (USB) ameliyat edilen hastalardan alındı (BASEC numarası 2019-02118). Tüm fare deneyleri, İsviçre Kanton Basel-Stadt Hayvan Bakım Komitesi'nin (3123-33896) yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Tüm fareler obez olmayan diyabetik (NOD) SCID gama fare suşuna sahipti ve bu nedenle genetik olarak immünosuprese olacak şekilde modifiye edildi; Sadece erkek hayvanlar kullanıldı. Protokolde kullanılan çözeltiler, reaktifler, malzemeler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Tablo 1 ve Malzeme Tablosuna bakın. Deneye genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.

1. Fare yetiştiriciliği

1. Hayvan tesisindeki fareleri, 12 saatlik gündüz ve 12 saatlik bir gece programında, yiyecek ve içme suyuna ad libitum erişimi ile belirli patojen içermeyen koşullar altında yetiştirin ve bakımını yapın.
   NOT: Organoidlerin implantasyonu 6-8 haftalıkken yapılır.

2. Hasta ve klinik numuneler

1. Başlamadan önce 12, 24 ve 6 oyuklu plakaları 37 °C'de inkübatöre yerleştirin. Mümkünse bunu 1 gün önceden yapın.
   1. RPMI 1640 besiyerinde rezeksiyondan sonra 1 saat içinde dokuyu toplayın ve ayrışma sürecini hemen başlatmak için laboratuvara taşıyın. Dokuyu 10 cm'lik bir Petri kabına (önceden ısıtılmış tabak) yerleştirin ve dokunun kurumasını önlemek için yeterli miktarda steril salin ekleyin.
2. Organoidlerin oluşumu için karaciğer kanseri doku ayrışması
   1. Dokuyu neşter kullanarak 1-2 mm'lik² küçük parçalar halinde doğrayın. Kesmenin zor olması durumunda dokuyu stabilize etmek için ek doku forsepsleri kullanın.
   2. Doku parçalarını 5 mL ayrışma tamponu (fizyolojik pH) ile 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. 37 °C'de (ısıtma kabini/inkübatör) bir döndürme cihazına yerleştirin.
   3. Her 10 dakikada bir pipetleyerek karıştırın ve karıştırma işlemini her 10 dakikada bir tekrarlayarak yaklaşık 1-1,5 saat bekletin.
      NOT: Karıştırma, delik çapını artırmak ve böylece aşırı büyük dokunun pipet ucuna sıkışmasını önlemek için pipetin ucunun kesilmesini gerektirebilir.
   4. 0.5 mL'lik bir plastik tüpte adım 2.2.3'ten 10 μL hücre ayrışma tamponu karışımı toplayın, 10 μL Tripan Mavisi ekleyin ve hücre canlılığını ve hücre kümelerini değerlendirmek için otomatik hücre sayacını kullanın. Kümeler görünüyorsa, karıştırma işlemini tekrarlayın (adım 3.3.); Aksi takdirde, bir sonraki adıma geçin.
   5. 50 mL'lik bir tüp alın, üstüne 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve karışımı içinden geçirin. 5 mL'lik bir şırınganın pistonu ile kalan tüm doku parçalarını filtreden geçirin. Her şeyi 5 mL Ad-DF+++ ile yıkayın ve filtrenin altındaki damlayı topladığınızdan emin olun.
   6. Süzüntüyü 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 300 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı dikkatlice aspire edin, pelete dokunmamaya dikkat edin. 5 mL Kırmızı Kan hücresi lizis tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.
   8. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL ileri ortamda yeniden süspanse edin.
3. Hücrelerin sayılması ve hücre canlılığının değerlendirilmesi
   1. 1.5 mL'lik bir tüpe 10 μL Tripan mavisi ekleyin ve 10 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini sayma slaytlarına yerleştirin ve hücreleri sayın.
   2. Organoid oluşumu için gerekli sayıda hücreyi ayırın ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Genel olarak, kubbe başına 80.000 hücre ve kubbe başına 20 μL bazal membran matrisi tohumlayın (6 oyuklu plaka başına oyuk başına 10 damla).
   3. Süspansiyonda fazla hücre kalırsa, peleti Hücre Süspansiyonu Dondurma ortamında (FBS'de %10 DMSO) askıya alın, bir kriyotüpe aktarın ve bir dondurma kabına koyun. Tüpü hemen gece boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın. Ertesi gün, ihtiyaç duyulana kadar sıvı nitrojene aktarın.
4. Organoid üretimi için kaplama
   1. Süpernatanı çıkarın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve peleti bir bazal membran matrisi ile yeniden süspanse edin.
   2. Önceden ısıtılmış plakayı inkübatörden çıkarın (gece boyunca önceden ısıtılmış). Plakaya küçük damlalar yapın (kubbe başına 20 μL bazal membran matrisi [oyuk başına 10 damla]). Plakayı ters çevirin ve plakayı akış kabininde 5 dakika bekletin.
   3. 5 dakika sonra, plakayı 37 °C inkübatöre aktarın ve plakayı ~ 20 dakika bekleterek matrisin katılaşmasına izin verin. 2 mL organoid kültür ortamı ^6,7 ekleyin.
5. Organoid kültürün bakımı
   1. Ortamı her 2 günde bir değiştirin. Organoidler bazal membran matris kubbesinde birleştiğinde ve genişlemeye hazır olduğunda, buna göre 2x veya 3x gibi bölünme oranını hesaplayın.
      NOT: Bu bilgileri kaydedin; Sonraki adımlarda buna ihtiyaç duyulacaktır.
   2. Matris kubbelerine dokunmamaya dikkat ederek bir P1000 ucu kullanarak ortamı kuyu köşesinden çıkarın.
   3. Kubbe başına 100 μL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin, kazıyın, 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve her şeyi toplamak için kuyuya tekrar az miktarda tripsin ekleyin. ~ 10x pipetleyin.
   4. 37 °C su banyosunda 3 dakika inkübe edin ve hücreleri P1000 ucu ile ayırmak için 10x pipetleyin. Bu adımı en fazla 10 dakika boyunca her 3 dakikada bir tekrarlayın.
   5. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM)/%10 Fetal sığır serumu (FBS)/%1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) besiyerini en az aynı hacimde ekleyin ve 2 kez yavaşça yukarı ve aşağı karıştırın. DPBS ile doldurun.
   6. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Organoid birleşmesine dayalı olarak kararlaştırılan bölünme oranına göre yeniden süspansiyon yapın, örneğin, başlangıçtaki bazal membran matrisi miktarının 2 katı veya 3 katı.
   7. Önceden ısıtılmış plakayı inkübatörden çıkarın (gece boyunca önceden ısıtılmış). Plakaya küçük damlalar yapın (kubbe başına 20 μL bazal membran matrisi [oyuk başına 10 damla]). Plakayı ters çevirin ve plakayı akış kabininde 5 dakika bekletin.
   8. 5 dakika sonra plakayı 37 °C inkübatöre aktarın. Plakayı ~ 20 dakika bekletin ve matrisin katılaşmasına izin verin. 2 mL organoid kültür ortamı ekleyin.
6. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) bir blok yapmak için organoidlerin hazırlanması
   1. Matris kubbelerine dokunmamaya dikkat ederek bir P1000 ucu kullanarak ortamı kuyu köşesinden çıkarın. 200 μL Dispase (2 mg / mL) ekleyin ve damlaları bir P1000 pipet ucu ile parçalayın. Kuluçka makinesinde 80 dakika bekletin.
   2. Kuyuya 2 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) ekleyin, 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve DPBS ile doldurun. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL% 4 paraformaldehit içinde yeniden süspanse edin. En az 1 saat buzdolabında bekletin.
   3. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, paraformaldehiti aspire edin ve bir damla oluşturmak için peleti numune işleme jeli ile yeniden süspanse edin. Damlaların katılaşması için 40 dakika bekleyin. Hücreleri içeren jel damlasını bir histoloji kasetine yerleştirin. Kaseti kurutmak için hareket ettirin ve ardından kesmek için parafine ve H/E boyama ^8,9'a gömün.
7. Enjeksiyon için organoidlerin hazırlanması
   1. Büyüyen organoidi içeren plakayı inkübatörden çıkarın ve akış kabinine yerleştirin.
   2. 2.5.2 ila 2.5.4 arasındaki adımları izleyin.
   3. 2 mL DMEM ekleyin ve karıştırın.
   4. 1.5 mL'lik bir tüpe 10 μL Tripan mavisi ekleyin ve 10 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın.
   5. Karışımın 10 μL'sini sayma slaytlarına yerleştirin ve hücreleri sayın. Her iki odanın ortalama hücre sayısını hesaplayın. İki oda arasındaki fark çok büyükse, sayımı yeniden yapmayı düşünün.
   6. 10⁶ hücre için gerekli hücre süspansiyon hacmini hesaplayın ve bu hacmi 1.5 mL tüplere dağıtın. 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
   7. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 5 μL DMEM ve 5 μL bazal membran matrisi ekleyin. İşlem sırasında süspansiyonu soğuk tutarken pipetleme yaparak süspansiyonu dikkatlice karıştırın.
   8. Organoidleri içeren 1.5 mL'lik tüpleri farelere taşıma sırasında buz üzerine yerleştirin ve enjeksiyona devam edin.

3. Fareye organoid enjeksiyonu

1. Perioperatif adımlar
   1. Deney hayvanını ana kafesten çıkarın ve suyla izole, taze bir kafese koyun.
   2. Fareyi %1.5 ila %2.5 İzofluran ile uyuşturun.
   3. Ameliyatın başlamasından 30 dakika önce 10 μL Buprenorfin (0.3 mg / mL) ile boynunuza deri altı enjeksiyonu yapın.
   4. Ameliyatın başlamasından hemen önce, ameliyat sırasında gözlerde herhangi bir kuruluğu önlemek için hayvanların gözlerini Karbomerum (örneğin Lacrinorm) ile dikkatlice boyayın. Korneada herhangi bir erozyon oluşmaması için uygulama sırasında korneaya dokunmayınız.
   5. Hayvanları temiz ve steril bir yüzeye koyun ve onlara taze plastik eldivenler, saç filesi ve yalnızca fare tesisinde kullanılan özel bir laboratuvar çalışma önlüğü ile tutun.
   6. Yeterli bir görüş sağlamak için hayvana yakın iki ısı yayan far kullanın. Ameliyat sırasında hipotermi ile ilgili herhangi bir şüphe veya endişe varsa, başka bir ısıtma lambası veya ısıtma matı kullanın.
2. Laparotomi
   NOT: Cerrahi işlem başlamadan önce ayak parmağı sıkışma testi ile anestezinin derinliği kontrol edildi. İşlem sırasında rutin kontroller ve solunum hızının izlenmesi ile yeterli anestezi sağlandı ve uygun bir artış varsa ayarlandı. Cerrahi ekipman, hayvan tesisimizin kurum içi yönergelerine göre temizlendi ve dezenfekte edildi.
   1. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyona getirin, dört ekstremiteyi uzatın ve bantla sabitleyin. Tüy dökücü bir krem uygulayarak kürkü çıkarın ve fazla krem ve kürkü çıkarmak için ıslak bir mendil kullanın.
      NOT: Epilasyon, kremi tahıllara karşı kürkün içine masaj yapmak için bir pamuklu çubuk kullanıldığında en iyi sonucu verir.
   2. Laparotomi için hedef olan linea alba'yı lokalize edin. Üst ve alt epigastrik arterleri de tanımlayın. Yaralanmaları önlemek için damarlara zarar vermemeye dikkat edin.
   3. Alt karın bölgesinden ksifoid kıkırdağa kadar forseps ve mikrocerrahi makasla linea alba boyunca bir kesi yapın.
   4. Ekartörleri takın ve üst karnın optimum pozlaması için çekiş yönünü ayarlayın (Şekil 2A,B).
      NOT: Sabitleme için ekli lastik bantlara sahip ekartör olarak bükülmüş ataş kullanıyoruz.
3. Organoidlerin enjeksiyonu
   1. Kesiğin hemen yanına temiz bir peçete yerleştirin ve üzerine birkaç damla tuzlu su damlatın. İnce bağırsağı ve çekumu dıştan çıkarın ve ıslak peçetenin üzerine yerleştirin.
   2. Enjeksiyon mümkün olana kadar sağ üst lobu (RSL) açığa çıkarın.
   3. Hamilton şırıngasını hazırlayın, suyla durulayın ve enjeksiyon için referans olarak uçtan 2-3 mm'lik bir işaret yerleştirin.
   4. Şırıngayı hazırlanan organoid karışımı ile çizin ve iğneyi işarete kadar enjekte edin. Organoidleri yavaşça sabit bir pozisyonda enjekte edin; Bu süre zarfında iğneyi hareket ettirmeyin.
   5. Karışımın geri akışını önlemek için 15-20 saniye bekleyin. İğneyi çıkarın ve enjeksiyon bölgesine pamuklu çubukla biraz baskı uygulayın. Karnı karaciğer lobunda yırtılma ve geri akış açısından kontrol edin. Karnı 0,5 mL steril salin ile durulayın ve emilebilir bir sütür kullanarak karnı çalışan bir sütürle kapatın.
      NOT: Ameliyat bölgesi steril bir örtü ile kapatıldı. İşlem sırasında kullanılan cerrahi aletler öncelikle su ve temizlik maddeleri ile temizlenerek makroskopik kalıntıların uzaklaştırılması sağlandı. Aletler daha sonra bir sterilizasyon çözeltisinde işlendi. İplik, eldiven veya pamuklu çubuk gibi sarf malzemeleri hijyenik nedenlerle yalnızca bir kez kullanıldı ve sterildi.

4. Minör rezeksiyon (karaciğer dokusunun% 30'u)

1. Laparotomiyi yukarıda adım 3.2'de belirtildiği gibi gerçekleştirin.
2. Nemli pamuklu çubuklar kullanın ve LLL'nin cerrahi alanında daha fazla alan yaratmak için ML'yi kraniyal olarak itin.
3. LLL'yi kraniyal olarak çevirin ve CL ile LLL arasında alışılmış olarak bulunan kaudat lobu (CL) ve ligamenti ortaya çıkarın (Şekil 2C).
4. Bağı tamamen kesin ve bağı (emilmeyen ince iplik, örneğin Prolene 5-0) LLL'nin altına yerleştirin. Bu pozisyonda kalmasını sağlamak için bağı nemlendirin ve sağ üst kadrana doğru hareket ettirin.
5. LLL'yi kaudally çevirin. Bağın sol serbest ucunu LLL'nin sol ucunun etrafına yönlendirin. Bağın sağ serbest ucunu LLL'nin sağ ucunun etrafına yönlendirin. Pamuklu çubukla LLL'ye kaudal çekiş uygulayın ve ligatun doğru ve merkezi konumlandırılmasını sağlayın.
6. Çift yarım düğüm atın. Düğümü tam olarak sıkmadan diğer yönde bağlanmış ikinci bir yarım düğüm ile sabitleyin. Düğümleri biraz sıkın, bağın doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin ve iyi konumlandırmayı garanti etmek için yeniden konumlandırın.
7. Künt uçlu forseps ile kraniyal serbest ucu yerinde tutarak düğümü tamamen sıkın ve kaudal serbest ucu başka bir forseps çifti ile çekin (Şekil 2D). Düğümü, ters yönde bağlanmış ikinci bir yarım düğüm ile sabitleyin.
8. Karaciğer lobunu rezeke edin. Kesmeden bağa yakın kesin.

5. Majör rezeksiyon (karaciğer dokusunun% 65'i)

1. LLL'nin küçük rezeksiyonunu yukarıda belirtildiği gibi gerçekleştirin (adım 3.4.1-3.4.8).
2. ML'yi harekete geçirmek için falsiform ligamenti transekt. Lobu kraniyal olarak çevirin. Bağı lobun altına yerleştirin ve lobu kaudal olarak çevirin.
3. Serbest uçları lobülün etrafına dolaştırın. Manipülasyon sırasında yanlış yerleştirme durumunda bağın yerleştirilmesini tekrarlayın. Ligatür doğru bir şekilde yerleştirildikten sonra, çift yarım düğüm yerleştirin, yavaşça bağlayın ve gerekirse ligatürü yeniden konumlandırın.
4. İkinci bir yarım düğümü ters yönde bağlayın ve tamamen sıkın. Ters yönde üçüncü bir yarım düğüm ekleyin.
5. Lob rezeke edin.
6. Karnı steril tuzlu su çözeltisiyle yıkayın ve bağırsakları anatomik yerlerine yerleştirin.

6. Karnın kapatılması

1. Cildi ve peritonu forseps ile tutun ve insizyon hattının üst ucunda emilebilir bir sütürle (örneğin, Monocryl 5-0) bir dikiş yapın. Periton tarafından çıktığınızdan emin olun.
2. İkinci dikişi, cilt tarafından çıkarak insizyonun karşı tarafında gerçekleştirin. Düğümü sıkıca bağlayın, serbest ucu iğnesiz kısa ve ucu iğne ile uzun bırakırken. Kısa ucu 2 mm uzunluğunda kesin.
3. Çalışan dikişe devam edin ve insizyonun alt ucunda bir düğüm ile bitirin.
4. Farenin karnını kalan kanın temizliğini yapın.

7. Ameliyat sonrası bakım

1. Karnın kapanmasından sonra, boynun altına deri altından 10 μL Buprenorfin (0.3 mg / mL) daha enjekte edin. Hayvanları daha önce kullanılmış, izole edilmiş kafese, kısmen bir ısıtma matı üzerine yerleştirin. Kafesin zemininde kolayca erişilebilen yiyecekler sağlayın.
   NOT: Bilinci yerine gelene kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
2. Ameliyat sonrası kontrollerinizi 2 saat ve 6 saat sonra yapınız. Herhangi bir ağrı belirtisine özel dikkat göstererek davranışı yakından gözlemleyin; Gerekirse 10 μL daha Bupivakain uygulayın.
3. Fare tamamen iyileştikten sonra, ancak ameliyattan 6 saat sonra ve ameliyattan en geç 24 saat sonra olmak üzere, ana kafese yeniden yerleştirin. İlgili tüm hayvanların herhangi bir saldırganlık veya diğer şüpheli davranışlarla ilgili davranışlarını yakından izleyin. Hayvanın ameliyat sonrası herhangi bir zayıflığından şüphe duyduğunuzda, son yeniden girişe kadar iyileşmesi için gece boyunca izole bırakın.
4. Ameliyattan 1 gün sonra ameliyat sonrası son kontrolden sonra hayvanların düzenli tartımına devam edin.
   NOT: Analjezi ameliyat sonrası 4 ve 8 saat sonra uygulandı. Ameliyat sonrası 12, 24 ve 48 saatlerde daha fazla izleme yapıldı ve fareler herhangi bir ağrı veya sıkıntı açısından kontrol edildi. Herhangi bir ağrı belirtisi gözlenirse, başka bir doz Buprenorfin uygulandı.

8. Tümör büyümesinin izlenmesi

1. İzofluran anestezisi kullanarak fareleri hareketsiz hale getirin ve enjeksiyondan 2 hafta sonra başlayan tümör implantasyonunu görselleştirmek için sonografi kullanın¹⁰.
2. CO₂ kullanarak fareleri ötenazi yapın.

Sonuçlar

Tek karaciğer loblarının toplam karaciğer hacmine katkısına baktık ve LLL'nin toplam karaciğer hacminin %33'ünü temsil ettiğini bulduk. ML toplam karaciğer hacminin %32'sini, RSL %13'ünü, RIL %10'unu ve CL %10'unu temsil eder (Tablo 2). Kutu çizimleri, karaciğer loblarının nispi katkısının, aynı suşun farklı fareleri arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir (Şekil 3B). Bu nedenle, LLL'nin rezeksiy...

Tartışmalar

Protokoldeki kritik adımlar
Fare anestezisi
Anestezinin amacı, fareyi güvenli bir şekilde cerrahi manipülasyonu tolere edeceği bir duruma dönüştürmektir. Aynı zamanda, kardiyopulmoner arrest ve ardından ölümü önlemek için anestezinin etkisi çok güçlü olmamalıdır. Uçucu anestezinin dozu daha kolaydır ve araştırmacının buharlaştırıcının akış hızını manipüle ederek dozu ayarlamasına izin verir. Değişimin etk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817