إنتاج ثقافة التعليق وتنقية الفيروسات المرتبطة بالغدين بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول للتطبيقات في الجسم الحي

Summary

يتم إنتاج الفيروس المرتبط بالغدي في زراعة الخلايا المعلقة ويتم تنقيته عن طريق الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول المزدوج. يتم تضمين خطوات لزيادة إجمالي محصول الفيروس ، وتقليل خطر هطول الأمطار ، وزيادة تركيز المنتج النهائي للفيروس. يصل التتر النهائي المتوقع إلى 10¹² جسيما فيروسيا / مل وهو مناسب للاستخدام قبل السريري في الجسم الحي .

Abstract

يصف هذا البروتوكول إنتاج الفيروس الغدي المؤتلف وتنقيته بواسطة الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول ، وهي طريقة محايدة مصلية لتنقية AAV تم وصفها لأول مرة في عام 1999. تستخدم ناقلات rAAV على نطاق واسع في تطبيقات العلاج الجيني لتوصيل جينات التحوير إلى أنواع مختلفة من الخلايا البشرية. في هذا العمل ، يتم إنتاج الفيروس المؤتلف عن طريق نقل خلايا Expi293 في مزرعة معلقة مع البلازميدات التي تشفر الجينات المحورة ، والقفيصة المتجهة ، والجينات المساعدة للفيروسات الغدية. يعمل الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول على تنقية جزيئات AAV الكاملة بناء على كثافة الجسيمات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تضمين ثلاث خطوات في هذه المنهجية المنتشرة في كل مكان الآن من أجل زيادة إجمالي إنتاج الفيروس ، وتقليل خطر هطول الأمطار بسبب البروتينات الملوثة ، وزيادة تركيز المنتج النهائي للفيروس ، على التوالي: ترسيب الجسيمات الفيروسية من وسائط الخلية باستخدام محلول البولي إيثيلين جلايكول (PEG) وكلوريد الصوديوم ، إدخال جولة ثانية من الطرد المركزي المتدرج لكثافة اليوديكسانول ، وتبادل المخزن المؤقت عبر مرشح الطرد المركزي. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن تحقيق التتر باستمرار في حدود 10¹² جسيما فيروسيا / مل من النقاء الاستثنائي للاستخدام في الجسم الحي .

Introduction

النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي المؤتلف (rAAV) هي أدوات تستخدم على نطاق واسع لعلاج الأمراض الوراثية ، بما في ذلك ضمور العضلات الشوكي وضمور الشبكية والهيموفيليا A^1،2،3. تم تصميم ناقلات rAAV لتفتقر إلى الجينات الفيروسية الموجودة في AAV⁴ من النوع البري ، وهو فيروس صغير غير مغلف مع جينوم DNA خطي أحادي الشريط 4.7 كيلو بايت. تم اكتشاف AAV لأول مرة في ستينيات القرن العشرين كملوث لمستحضرات الفيروس الغدي⁵. وعلى الرغم من صغر حجم قفيصة النسخة، الذي يحد من حجم جين التحوير الذي يمكن تعبئته بحد أقصى قدره 4,9 كيلوبايت باستثناء لوائح الاتصالا....

Protocol

يتم توفير تكوين الحلول والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.

حل	تكوين
العازلة تحلل AAV	1.2 مل من محلول كلوريد الصوديوم 5 M
	2 مل من محلول Tris-HCl pH 8.5 1 M
	80 ميكرولتر من محلول 1 M MgCl2
	mQ الماء إلى 40 مل
حل هطول الأمطار AAV	40 جرام بيج 8000

النتائج

يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على عيار لا يقل عن 10¹² جسيما فيروسيا لكل مل. يمكن الحصول على عيار (الشكل 3) بواسطة qPCR باستخدام بادئات ITR الواردة في الجدول التكميلي 1 ، بواسطة ddPCR ، أو بأي طريقة معايرة أخرى. يمكن أن ينتج التتر دون المستوى الأمثل عن استخدام جين غط.......

Discussion

بروتوكول تنقية تدرج كثافة اليوديكسانول المزدوج هو الطريقة العالمية لأنه ينطبق على أي متغيرات متحولة AAV ، بغض النظر عن خصوصية مستقبلاتها. اعتمدت الطرق المبكرة لتنقية AAV على كثافة الجسيمات وشملت الطرد المركزي isopycnic في CsCl والطرد المركزي المتدرج المستمر لكثافة السكروز¹⁹. في وقت ل?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C