Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Zusammenfassung

Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10^{bis 12} Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Aufreinigung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren (rAAV) durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, eine serotypagnostische Methode zur Aufreinigung von AAV, die erstmals 1999 beschrieben wurde. rAAV-Vektoren werden häufig in Gentherapieanwendungen verwendet, um Transgene an verschiedene menschliche Zelltypen zu liefern. In dieser Arbeit wird das rekombinante Virus durch Transfektion von Expi293-Zellen in Suspensionskultur mit Plasmiden hergestellt, die für das Transgen, das Vektorkapsid und die adenoviralen Helfergene kodieren. Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation reinigt vollständige AAV-Partikel basierend auf der Partikeldichte. Darüber hinaus sind drei Schritte in dieser inzwischen allgegenwärtigen Methodik enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Ausfällungen aufgrund kontaminierender Proteine zu verringern bzw. das Endprodukt des Virus weiter zu konzentrieren: Ausfällung von Viruspartikeln aus Zellmedien unter Verwendung einer Lösung aus Polyethylenglykol (PEG) und Natriumchlorid, Einführung einer zweiten Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation, und Pufferaustausch über einen Zentrifugalfilter. Mit dieser Methode ist es möglich, konsistent Titer im Bereich von 10^{bis 12} Viruspartikeln/ml von außergewöhnlicher Reinheit für die In-vivo-Anwendung zu erreichen.

Einleitung

Rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren sind weit verbreitete Instrumente zur Behandlung genetischer Erkrankungen, einschließlich spinaler Muskelatrophie, Netzhautdystrophie und Hämophilie A ^1,2,3. rAAV-Vektoren sind so konstruiert, dass ihnen virale Gene fehlen, die in Wildtyp-AAV⁴ vorhanden sind, einem kleinen, nicht umhüllenden Ikosaedervirus mit einem linearen einzelsträngigen 4,7 kb DNA-Genom. AAV wurde erstmals in den 1960er Jahren als Kontaminante von Adenovirus-Präparaten entdeckt⁵. Trotz seiner kleinen Kapsidgröße, die die Größe des Transgens, das ohne ITRs verpackt werden kann, auf maximal 4,9 kb begrenzt⁶, ist AAV für die Transgenabgabe nützlich, da es beim Menschen nicht pathogen ist, die Expression des Transgens in vielen sich teilenden und nicht teilenden Zelltypen ermöglicht und begrenzte immunogene Wirkungen hat⁷.

Als Mitglieder der Gattung Dependoparvovirus hängt die Produktion von rAAVs von der Expression von Helfergenen ab, die im Adenovirus oder Herpes-simplex-Virus^{vorhanden sind 8}. Es wurden mehrere Strategien zur Herstellung von rAAV entwickelt, aber die Produktion in HEK293-Zellen, die mit den adenoviralen E1A/E1B-Helfergenen transformiert wurden, ist die etablierteste Methode, die heute verwendet wird⁹. Der allgemeine Ansatz der rAAV-Produktion beginnt mit der Transfektion von HEK293-Zellen mit drei Plasmiden, die das Transgen in invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs), AAV-Rep- und Cap-Genen bzw. zusätzlichen adenoviralen Helfergenen enthalten. Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion werden die Zellen geerntet und verarbeitet, um rAAV zu reinigen, das das Transgen enthält.

Bei der Entwicklung neuer rAAV-Vektoren für therapeutische Zwecke ist ein wesentliches Ziel die Herstellung von Vektoren mit erhöhter Transduktionseffizienz. Eine Erhöhung der Transduktionseffizienz von Zielzellen würde eine Verringerung der erforderlichen klinischen Dosis von rAAV bedeuten und somit die Wahrscheinlichkeit unerwünschter immunogener Wirkungen verringern, die von Antikörper-vermittelter Neutralisation bis hin zu akuten Toxizitäten reichen^10,11. Um die Transduktionseffizienz von rAAV-Vektoren zu verbessern, können Änderungen am verpackten Genom oder am Kapsid vorgenommen werden. Praktikable Methoden zur Abstimmung der Transduktionswirksamkeit über das Design des verpackten Genoms umfassen den Einbau starker und gewebespezifischer Promotoren, die sorgfältige Auswahl von mRNA-Verarbeitungselementen und die Optimierung der Kodierungssequenz zur Verbesserung der Translationseffizienz¹². Veränderungen am Kapsid werden mit dem Ziel vorgenommen, den Tropismus für menschliche Zielzelltypen zu erhöhen. Die Bemühungen zur Entwicklung neuer rAAV-Transgen-Verabreichungsvektor-Kapside sind im Allgemeinen gekennzeichnet durch einen Fokus entweder auf das rationale Design von AAV-Kapsiden mit spezifischen Mutationen, die auf spezifische Zellrezeptoren abzielen, oder auf die gerichtete Evolution zur Identifizierung von Kapsiden mit Tropismus für bestimmte Zelltypen aus hochkomplexen kombinatorischen Kapsidbibliotheken, ohne auf einen bestimmten Rezeptor abzuzielen (obwohl einige Gruppen diese Ansätze kombinieren)^{13, 14,15}. Beim gerichteten Evolutionsansatz werden kombinatorische Kapsidbibliotheken unter Verwendung eines bestimmten Serotyp-Rückgrats mit mutierten variablen Regionen an der Kapsidaußenseite^{konstruiert 16}. Kombinatorische Kapsidbibliotheken werden häufig aus AAV-Serotypen konstruiert, die nicht vom Menschen stammen, wodurch das Risiko einer bereits bestehenden Immunität während der klinischen Anwendung verringert^{wird 10}. Daher sind Aufreinigungsmethoden, die auf jeden Serotyp angewendet werden können, ideal, um die Notwendigkeit einer serotypspezifischen Optimierung für die weniger häufig verwendeten Serotypen, die als Rückgrat für diese Bibliotheken dienen, zu eliminieren.

Die Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation wird verwendet, um hohe Titer von rAAV mit hoher Infektiosität^{zu reinigen 17}. In diesem Protokoll wird rAAV in Suspensionszellkultur hergestellt, um den Arbeitsaufwand für die Herstellung großer AAV-Titer zu verringern. Ein Zentrifugationsschritt ist ebenfalls enthalten, um Zelllysat zu reinigen, um das Vorhandensein kontaminierender Proteine zu reduzieren und das Risiko einer Virusausfällung zu verringern. Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Methode zur Herstellung von Präparaten aus hochreinem rAAV, die für den präklinischen Einsatz geeignet sind.

Protokoll

Die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Puffer ist in Tabelle 1 angegeben.

Lösung	Zusammensetzung
AAV-Lyse-Puffer	1,2 ml 5 M NaCl-Lösung
	2 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5 Lösung
	80 μl 1 M MgCl2-Lösung
	mQ Wasser bis 40 mL
AAV-Fällungslösung	40 g PEG 8000
	50 ml 5 M NaCl-Lösung
	mQ Wasser bis 100 mL
15% Iodixanol-Fraktion	7,5 ml OptiPrep
	3 ml 10X DPBS
	6 ml 5 M NaCl-Lösung
	30 μl 1 M MgCl2-Lösung
	mQ bis 30 mL
25% Iodixanol-Fraktion	12. 5 ml OptiPrep
	3 ml 10X DPBS
	30 μl 1 M MgCl2-Lösung
	60 μl Phenolrotlösung
	mQ bis 30 mL
40% Iodixanol-Fraktion	33,3 ml OptiPrep
	5 ml 10X DPBS
	50 μl 1 M MgCl2-Lösung
	mQ bis 50 mL
60% Iodixanol-Fraktion	50 ml OptiPrep
	100 μl Phenolrotlösung
AAV-Pufferlösung	8 ml von 5 M NaCl
	20 μl 10 % Pluronic F-68
	PBS bis 200 ml

Tabelle 1: Lösungszusammensetzungen für Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Dreifache Transfektion von Expi293-Zellen

1. Expi293-Zellen (siehe Materialtabelle) mit einer Anfangsdichte von 5 x 10⁵ lebensfähigen Zellen (vc)/ml ausseeden.
2. Lassen Sie die Zellen bei 37 °C mit 8 % CO₂ und einer Schütteldrehzahl von 125 U/min inkubieren, bis sie eine Dichte von 3-5 x 10⁶ vc/ml erreichen. Überwachen Sie die Zelldichte und -viabilität mithilfe des Trypanblau-Ausschlusses mit einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle).
3. Wenn die Zellen die gewünschte Zelldichte erreicht haben, teilen Sie sie 1 bis 10 auf, indem Sie frisches Medium hinzufügen, so dass ihr Gesamtvolumen das Zehnfache ihres ursprünglichen Volumens beträgt. Falls erforderlich, werden die Zellen in einen größeren Kolben überführt. Zurück zur Inkubation.
4. Die Zellen werden wie in den Schritten 1.2 bis 1.3 beschrieben weiter expandiert, bis sie eine Dichte von mindestens 2 x 10⁶ vc/ml in 250 ml Medien in einem 1-Liter-Kolben erreichen.
5. Verdünnen Sie die Zellen am Tag vor der Transfektion auf 2 x 10⁶ vc/ml in 250 ml Medien und verwerfen Sie überschüssige Zellen nach Bedarf. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
6. Am Tag der Transfektion die Hälfte der Zellen bei 58 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet im gleichen Volumen (125 ml) Frischmedium. Die Zellviabilität sollte nahe bei 98% liegen.
7. Bereiten Sie zwei konische 50-ml-Röhrchen vor. Beschriften Sie einen mit "PEI" und den anderen mit "DNA".
8. In dem konischen Röhrchen mit der Bezeichnung PEI 1,2 ml PEI (Polyethylenimin, siehe Materialtabelle) auf ein Gesamtvolumen von 12,5 ml in OptiMEM-Medien verdünnen.
9. Bereiten Sie in dem konischen Röhrchen mit markierter DNA eine äquimolare Lösung von Plasmid-DNA zu insgesamt 500 μg DNA in einem Gesamtvolumen von 12,5 ml in OptiMEM-Medien vor.
10. Geben Sie die DNA-Lösung in die PEI-Lösung, invertieren Sie sie mehrmals, um sie gründlich zu kombinieren, und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die DNA-PEI-Lösung die vollen 10 Minuten inkubieren kann, damit PEI geladene Komplexe mit der DNA bilden kann.
11. Nachdem die DNA-PEI-Lösung 10 Minuten lang inkubiert wurde, tragen Sie die DNA-PEImax-Lösung mit einer serologischen Pipette langsam auf die Expi293-Zellen auf. Die transfizierten Zellen werden wieder in den Inkubator gegeben und 72 Stunden lang inkubiert (Abbildung 1).

Abbildung 1: Expi293-Zellen, die GFP zwei Tage nach der Transfektion exprimieren. Nach der Transfektion mit einem Plasmid, das ein Gen für GFP enthält, exprimieren die Expi293-Zellen vorübergehend eGFP. Die Zellmorphologie ist rund. Das Bild wurde mit einer Belichtungszeit von 15 ms aufgenommen. Die Mikroskopbilder werden mit einem inversen Mikroskop aufgenommen, das mit Epifluoreszenzbeleuchtung und einem 10x/0,30-Objektiv ausgestattet ist. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Aufreinigung von rAAV-Vektoren

1. Nach 72 h werden die Zellen in Suspension in zwei konische 250-ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 415 x g bei 4 °C heruntergeschleudert.
2. Das überstehende Medium wird in ein frisches konisches 500-ml-Röhrchen gegossen und zur späteren Verarbeitung bei 0 °C auf Eis gelagert.
3. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 10 ml AAV-Lysepuffer (Tabelle 1). Sammeln Sie die beiden Lysate zusammen in einem der Röhrchen. Spülen Sie das andere Röhrchen mit zusätzlichen 5 ml AAV-Lysepuffer und fügen Sie es dann zu den gepoolten Lysaten hinzu. Bei -70 °C einfrieren.
   HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Lagern Sie die überstehenden Medien bei -70 °C und nicht auf Eis.
4. Geben Sie 1:4 Volumen AAV-Fällungslösung in das überstehende Medium aus Schritt 2.2. Mehrmals umdrehen, gründlich mischen und bei 0 °C auf Eis mindestens 2 h oder über Nacht inkubieren.
5. Die inkubierte Lösung bei 3000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugieren.
6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit viralem Niederschlag in 5 ml AAV-Lysepuffer.
7. Das Zelllysat bei 37 °C im Wasserbad auftauen.
8. Poolen Sie den Virusniederschlag mit dem Zelllysat. Dies ist das Rohlysat. Spülen Sie das Zentrifugationsröhrchen, das den viralen Niederschlag enthielt, mit zusätzlichen 5 ml AAV-Lysepuffer und füllen Sie es mit dem Rohlysat.
9. Das Rohlysat auf -70 °C einfrieren und dann bei 37 °C auftauen. Wiederholen Sie diesen Zyklus noch einmal.
   HINWEIS: Das Rohlysat sollte nicht länger bei 37 °C belassen werden, als es zum Auftauen erforderlich ist.
10. Nach dem dritten Auftauen sofort 4 μl Benzonase zum Rohlysat geben, zum Mischen invertieren und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
11. Das Rohlysat wird 10 min lang bei 650 x g bei 18 °C zentrifugiert.
12. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen. Das ist das rohe Virus. Entsorgen Sie das Pellet.
13. Zentrifugieren Sie das Rohvirus für weitere 30 Minuten bei 3000 x g bei 18 °C, um kontaminierende Proteine zu entfernen.
14. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen. Dies ist das geklärte Virus.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Frieren Sie das geklärte Virus auf -70 °C ein.
15. Richten Sie die Mehrkanal-Schlauchpumpe mit vier Schlauchschläuchen ein (siehe Materialtabelle). Befestigen Sie Kapillaren an beiden Enden jedes Röhrchens.
16. Legen Sie die Kapillaren auf der Eingangsseite der Pumpe in ein mit deionisiertem Wasser gefülltes Becherglas. Legen Sie die Kapillaren auf der Ausgangsseite der Pumpe in ein leeres Becherglas. Lassen Sie die Schlauchpumpe mit 25,0 U/min laufen, um den Schlauch mit deionisiertem (DI) Wasser zu spülen.
17. Entleeren Sie nach gründlicher Spülung den Schlauch, indem Sie die Pumpe laufen lassen, bis der Schlauch nur noch mit Luft gefüllt ist. Legen Sie alle Kapillaren auf ein sauberes, fusselfreies Tuch.
18. Legen Sie vier Ultrazentrifugenröhrchen in ein Gestell auf der Ausgangsseite der Pumpe.
19. Verwenden Sie eine serologische 10-ml-Pipette, um vorsichtig 10 ml geklärtes Virus in jedes Ultrazentrifugenröhrchen zu dosieren. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
    HINWEIS: Das Volumen des geklärten Virus in jedem Röhrchen kann bei Bedarf auf bis zu 12 ml pro Röhrchen gedehnt werden. Reduzieren Sie die Menge von 60% Iodixanol entsprechend in Schritt 2.25 unten.
20. Das geklärte Virus wird mit Hilfe der Peristaltikpumpe mit Iodixanolfraktionen (Tabelle 1) von der niedrigsten bis zur höchsten Dichte unterlegt. Zuerst wird die 15%-Fraktion hinzugefügt, gefolgt von der 25%-Fraktion, der 40%-Fraktion und schließlich der 60%-Fraktion. 22 ml (5,5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 15%igen Iodixanolfraktion in ein sauberes konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Legen Sie die Kapillaren auf der Eingangsseite der Pumpe in den Schlauch und achten Sie darauf, dass alle Kapillaren den Boden des Schlauchs berühren.
21. Starten Sie die Pumpe und lassen Sie den Schlauch mit der Iodixanolfraktion füllen. Wenn die Iodixanolfraktion die Enden der Kapillaren auf der Ausgangsseite der Pumpe erreicht, stoppen Sie die Pumpe.
22. Führen Sie eine Ausgangskapillare in jedes Ultrazentrifugenröhrchen mit geklärtem Virus ein und achten Sie darauf, dass die Kapillaren den Boden jedes Ultrazentrifugenröhrchens berühren.
    HINWEIS: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass sich keine Luft mehr in den Kapillaren befindet. Iodixanol kann mit leicht unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch den Peristaltikschlauch fließen, stellen Sie also sicher, dass jede einzelne Ausgangskapillare vollständig mit Iodixanol gefüllt ist, bevor Sie es in das geklärte Virus einführen. Es kann erforderlich sein, die Pumpe mehrmals zu stoppen und zu starten.
23. Starten Sie die Pumpe und lassen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen füllen. Wenn der letzte Teil der 15%igen Fraktion in die Eingangskapillaren aufgenommen werden soll, stoppen Sie die Pumpe. Es ist wichtig, dass keine Luftblasen in den Schlauch gelangen.
    Anmerkungen: Wenn Luftblasen in die Eingangskapillaren gelangen, kann die Pumpe kurz in umgekehrter Richtung betrieben werden, um sie wieder herauszudrücken.
24. 22 ml (5,5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 25%igen Iodixanolfraktion in das konische 50-ml-Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, dass alle Kapillaren den Boden des Schlauchs berühren, und starten Sie die Pumpe. Wenn der letzte Teil der 25%igen Fraktion in die Eingangskapillaren aufgenommen werden soll, stoppen Sie die Pumpe.
25. Schritt 2.24 wird mit 20 ml (5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 40%igen Iodixanolfraktion und dann mit 24 ml (6 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 60%igen Fraktion wiederholt.
26. Wenn im Ultrazentrifugenröhrchen noch ungefülltes Volumen vorhanden ist, fügen Sie weitere 60%ige Fraktion hinzu, bis die Ultrazentrifugenröhrchen vollständig mit Flüssigkeit gefüllt sind.
27. Füllen Sie jedes Röhrchen, bis das Lysat eine Kuppel bildet, aber nicht aus dem Röhrchen überläuft. Stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie vorsichtig jede Ausgangskapillare, wobei Sie darauf achten, den Iodixanolgradienten nicht zu stören.
28. Verschließen Sie jedes Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Abstandshalter und laden Sie es in einen Ti-Rotor vom Typ 70 (siehe Materialtabelle).
    Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass der Rotor richtig ausgewuchtet ist. Versuchen Sie nicht, die Ultrazentrifuge ohne entsprechende Schulung zu bedienen.
29. Laden Sie den Typ 70 Ti-Rotor in die Ultrazentrifuge und zentrifugieren Sie ihn bei 489.000 x g für 1 h bei 18 °C.
30. Entladen Sie den Rotor nach der Zentrifugation von der Ultrazentrifuge. Entfernen Sie jedes Ultrazentrifugenröhrchen vorsichtig mit einer Spitzzange vom Rotor und achten Sie darauf, den Iodixanolgradienten nicht zu stören.
31. Verwenden Sie einen Stützringständer mit Klemme, um ein Ultrazentrifugenröhrchen zu sichern.
32. Befestigen Sie eine 20-GA-Nadel an einer 5-ml-Spritze und legen Sie sie beiseite. Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Kappe vom Ultrazentrifugenröhrchen zu entfernen.
33. Durchdringen Sie die Wand des Ultrazentrifugenröhrchens mit der Nadel etwa 3 mm unterhalb der 40%-60%igen Iodixanol-Grenzfläche (Abbildung 2).
34. Saugen Sie die Grenzfläche und einen Teil der 40%-Fraktion langsam an. Vermeiden Sie es, die Oberseite der 40%igen Fraktion anzusaugen, um eine Gesamtentnahme von etwa 4 ml zu erzielen.
35. Halten Sie einen Finger über die offene Oberseite des Ultrazentrifugenröhrchens, ziehen Sie die Spritze heraus und übertragen Sie die aspirierte AAV-Fraktion in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Entsorgen Sie die Spritze in einem Behälter für scharfe Gegenstände. Entsorgen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen.
36. Wiederholen Sie die Schritte 2.31-2.35 für jedes Ultrazentrifugenröhrchen.
37. Verdünnen Sie die aspirierte AAV-Fraktion ungefähr um das Zweifache in AAV-Lysepuffer auf ein Volumen von 40 ml.
38. Spülen Sie den Schlauch wie in den Schritten 2.16-2.17 beschrieben.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle angehalten werden. Die verdünnte AAV-Fraktion über Nacht bei 0 °C lagern.
39. Laden Sie jeweils 20 ml der verdünnten AAV-Fraktion in zwei neue Ultrazentrifugenröhrchen.
40. Für die zweite Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation wird die verdünnte AAV-Fraktion wie oben beschrieben mit nur 10 ml (5 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 40%igen Fraktion und 14 ml (7 ml pro Ultrazentrifugenröhrchen) der 60%igen Fraktion unterlegt. Wiederholen Sie die Schritte 2.29-2.36 für die Ultrazentrifugation und Aspiration.
    Anmerkungen: Spülen Sie vor der Lagerung der Schlauchpumpe und des Schlauchs den Schlauch mit DI-Wasser aus, wie in den Schritten 2.16-2.17 beschrieben.

Abbildung 2: Iodixanol-Gradient mit markierter 40%-60%-Iodixanol-Grenzfläche. (A) Erster Iodixanol-Gradient. Phenolrot wird in den Fraktionen 40% Iodixanol und 60% Iodixanol verwendet. Es erscheint aufgrund des unterschiedlichen pH-Werts zwischen den beiden Fraktionen als eine andere Farbe. Der Pfeil zeigt an, wo die Spritze eingeführt werden sollte, um die rAAV-Fraktion zu ernten, direkt unter der Grenzfläche von 40 % bis 60 % Iodixanol. (B) Zweiter Iodixanol-Gradient. In diesem Schritt werden nur die 40%igen und 60%igen Iodixanolfraktionen verwendet. Der Pfeil zeigt an, wo die Spritze eingeführt werden sollte, um die rAAV-Fraktion zu ernten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Pufferaustausch und Viruskonzentration

1. Nachdem Sie die AAV-Fraktion aus der zweiten Runde der Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation erhalten haben, verdünnen Sie sie zweifach mit AAV-Pufferlösung.
2. Äquilibrieren Sie den Zentrifugalfilter, indem Sie 20 ml AAV-Pufferlösung auf die Oberseite des Filters geben. Das Gerät wird bei 3000 x g bei 18 °C 5 min lang zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
3. Geben Sie die verdünnte AAV-Fraktion in den Zentrifugalfilter. Das Gerät wird bei 3000 x g bei 18 °C 5 min lang zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
4. Geben Sie 20 ml AAV-Pufferlösung oben in den Filter. Das Gerät wird bei 3000 x g bei 18 °C 5 min lang zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
   Anmerkungen: Wenn die Zentrifugalfiltermembran verstopft ist und die Lösung ineffizient durchfließt, verwenden Sie vorsichtig eine P200-Mikropipette, um die Lösung oben im Filter auf und ab zu ziehen. Achten Sie darauf, den Filter nicht mit der Mikropipettenspitze zu berühren.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.4 noch zweimal.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass das AAV nicht überkonzentriert ist, indem Sie mindestens 1 ml Volumen oben im Filter halten. Es kann notwendig sein, die Zentrifugationszeiten anzupassen, um eine Überkonzentration zu vermeiden. Wenn AAV überkonzentriert ist, kann es zu Niederschlägen kommen.
6. Für einen Endtiter im Bereich von 10^{bis 12} vg/ml wird das Virus auf ein Endvolumen von etwa 1 ml heruntergeschleudert.
   HINWEIS: Abhängig vom verwendeten Serotyp-Rückgrat und der Verpackungseffizienz des Virus müssen Sie das Virus möglicherweise in einem kleineren Volumen konzentrieren.
7. Verwenden Sie eine p1000-Mikropipette, um das konzentrierte AAV von der Oberseite des Zentrifugalfilters in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Verwenden Sie eine p200-Mikropipette, um den Zentrifugalfilter mit 50 μl AAV-Puffer zu waschen, um verbleibende Viren aufzufangen und mit dem Rest des konzentrierten AAV zu sammeln.
8. Ein 2 μl Aliquot des konzentrierten AAV zum Titern beiseite stellen. In der ergänzenden Tabelle 1 finden Sie ITR-Primer, die für die qPCR verwendet werden können.
9. Führen Sie das konzentrierte AAV durch einen 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter, um es zu sterilisieren.
   HINWEIS: Achten Sie bei der Sterilisation eines kleinen Volumens darauf, einen Spritzenvorsatzfilter mit kleinem Durchmesser zu wählen, um den Virusverlust zu minimieren. Die Verwendung eines proteinarmen Bindungsfilters mit kleinem Durchmesser führt zu minimalem Virusverlust (Daten nicht gezeigt).
10. Das sterilisierte AAV kann sofort zur Zelltransduktion verwendet oder bei 4 °C gelagert werden, um innerhalb von vier Wochen verwendet zu werden. Für eine längerfristige Lagerung sollte es bei -70 °C gelagert werden.

Ergebnisse

Mit dieser Methode können Titer von mindestens 10^{bis 12} Viruspartikeln pro ml erhalten werden. Ein Titer kann (Abbildung 3) durch qPCR unter Verwendung der in der ergänzenden Tabelle 1 angegebenen ITR-Primer, durch ddPCR oder durch eine andere Titermethode erhalten werden. Suboptimale Titer könnten sich aus der Verwendung eines Cap-Gens ergeben, das für ein Kapsid mit schlechter Verpackungseffizienz kodiert.

Eine weitere m?...

Diskussion

Das Protokoll zur doppelten Iodixanol-Dichtegradientenreinigung ist die universelle Methode, da es auf alle AAV-Mutantenvarianten anwendbar ist, unabhängig von ihrer Rezeptorspezifität. Frühe Methoden der AAV-Reinigung beruhten auf der Partikeldichte und umfassten die isopyknische Zentrifugation in CsCl und die kontinuierliche Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation¹⁹. Später wurden Serotyp-spezifische Ansätze entwickelt, bei denen monoklonale Antikörper verwendet wurden, die an Sepharoses...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C