Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Resumo

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10^{a 12} partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Resumo

Este protocolo descreve a produção e purificação de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, um método agnóstico de sorotipo para purificação de AAV descrito pela primeira vez em 1999. Os vetores rAAV são amplamente utilizados em aplicações de terapia gênica para entregar transgenes a vários tipos de células humanas. Neste trabalho, o vírus recombinante é produzido pela transfecção de células Expi293 em cultura de suspensão com plasmídeos que codificam os genes transgene, capsídeo vetorial e adenoviral auxiliar. A centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol purifica partículas completas de AAV com base na densidade de partículas. Além disso, três etapas são incluídas nesta metodologia agora onipresente para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação devido a proteínas contaminantes e concentrar ainda mais o produto final do vírus, respectivamente: precipitação de partículas virais do meio celular usando uma solução de polietilenoglicol (PEG) e cloreto de sódio, a introdução de uma segunda rodada de centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, e troca de buffer através de filtro centrífugo. Usando este método, é possível obter consistentemente títulos na faixa de 10^{a 12} partículas virais/mL de pureza excepcional para uso in vivo .

Introdução

Os vetores virais adenoassociados recombinantes (rAAV) são ferramentas amplamente utilizadas para o tratamento de doenças genéticas, incluindo atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana e hemofilia A ^1,2,3. Os vetores rAAV são projetados para não ter genes virais presentes no AAV⁴ selvagem, um vírus icosaédrico pequeno e não envelope com um genoma linear de DNA de fita simples de 4,7 kb. O AAV foi descoberto na década de 1960 como contaminante de preparações de adenovírus⁵. Apesar de seu pequeno tamanho do capsídeo, que limita o tamanho do transgene que pode ser empacotado a um máximo de 4,9 kb excluindo ITRs⁶, o AAV é útil para a liberação de transgênicos porque não é patogênico em humanos, permite a expressão de transgênicos em muitos tipos celulares em divisão e não em divisão e tem efeitos imunogênicos limitados⁷.

Como membros do gênero dependoparvovirus, a produção de rAAVs depende da expressão de genes auxiliares presentes no adenovírus ou herpes simplex^{vírus 8}. Várias estratégias para produzir o rAAV têm sido desenvolvidas, mas a produção em células HEK293 transformadas com os genes auxiliares adenovirais E1A/E1B é o método mais utilizado^atualmente9. A abordagem geral da produção de rAAV começa com a transfecção de células HEK293 com três plasmídeos contendo o transgene dentro de repetições terminais invertidas (ITRs), genes de AAV rep e cap e genes auxiliares adenovirais adicionais, respectivamente. Setenta e duas horas após a transfecção, as células são colhidas e processadas para purificar o rAAV contendo o transgene.

No desenvolvimento de novos vetores de rAAV para fins terapêuticos, um dos principais objetivos é a produção de vetores com maior eficiência de transdução. Um aumento na eficiência de transdução das células-alvo significaria uma diminuição na dose clínica necessária de rAAV, diminuindo, assim, a probabilidade de efeitos imunogênicos adversos que vão desde a neutralização mediada por anticorpos até toxicidades agudas^10,11. Para melhorar a eficácia da transdução de vetores rAAV, alterações podem ser feitas no genoma empacotado ou no capsídeo. Métodos viáveis para ajustar a eficácia da transdução via projeto de genoma empacotado incluem a incorporação de promotores fortes e tecido-específicos, seleção cuidadosa de elementos de processamento de mRNA e otimização de sequência de codificação para melhorar a eficiência da tradução¹². Alterações no capsídeo são feitas com o objetivo de aumentar o tropismo por tipos celulares humanos alvo. Os esforços para o desenvolvimento de novos capsídeos do vetor de entrega de transgenes rAAV são geralmente caracterizados por um foco no planejamento racional de capsídeos de AAV com mutações específicas visando receptores celulares específicos ou evolução direcionada para identificar capsídeos com tropismo para tipos celulares específicos de bibliotecas combinatórias de capsídeos de alta complexidade sem ter como alvo um receptor específico (embora alguns grupos combinem essas abordagens)^{13, 14,15}. Na abordagem de evolução dirigida, bibliotecas combinatórias do capsídeo são construídas usando uma espinha dorsal do sorotipo particular com regiões variáveis mutadas no exterior do capsídeo¹⁶. Bibliotecas combinatórias de capsídeos são frequentemente construídas a partir de sorotipos de AAV não originários de humanos, diminuindo o risco de imunidade preexistente durante o uso clínico¹⁰. Portanto, métodos de purificação que podem ser aplicados a qualquer sorotipo são ideais para eliminar a necessidade de otimização sorotipo-específica para os sorotipos menos comumente usados servindo como espinhas dorsais para essas bibliotecas.

A centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol é utilizada para purificar altos títulos de VAr com alta infectividade¹⁷. Nesse protocolo, o rAAV é produzido em cultura de células de suspensão para diminuir a quantidade de trabalho necessário para produzir grandes títulos de AAV. Uma etapa de centrifugação também está incluída para limpar o lisado celular para reduzir a presença de proteínas contaminantes e diminuir o risco de precipitação do vírus. Este protocolo é um método custo-efetivo para produzir preparações de rAAV de alta pureza, adequadas para uso pré-clínico.

Protocolo

A composição das soluções e buffers utilizados neste protocolo são apresentados na Tabela 1.

Solução	Composição
Tampão de lise AAV	1,2 mL de solução de NaCl 5 M
	2 mL de solução 1 M Tris-HCl pH 8,5
	80 uL de solução de 1 M MgCl2
	mQ água até 40 mL
Solução de precipitação AAV	40 g PEG 8000
	50 mL de solução de NaCl 5 M
	mQ água até 100 mL
Fração de iodixanol a 15%	7,5 mL de OptiPrep
	3 mL de 10X DPBS
	6 mL de solução de NaCl 5 M
	30 uL de solução de 1 M MgCl2
	mQ a 30 mL
Fração de 25% de iodixanol	12. 5 mL de OptiPrep
	3 mL de 10X DPBS
	30 uL de solução de 1 M MgCl2
	60 uL de solução vermelha de fenol
	mQ a 30 mL
Fração iodixanol 40%	33,3 mL OptiPrep
	5 mL de 10X DPBS
	50 uL de solução de 1 M MgCl2
	mQ a 50 mL
Fração de iodixanol 60%	50 mL de OptiPrep
	Solução vermelha de fenol 100 uL
Solução tampão AAV	8 mL de NaCl 5 M
	20 uL de 10% Pluronic F-68
	PBS até 200 mL

Tabela 1: Composições das soluções utilizadas neste protocolo.

1. Tripla transfecção de células Expi293

1. Sementes Expi293 células (ver Tabela de Materiais) a uma densidade inicial de 5 x 10⁵ células viáveis (vc)/mL.
2. Deixar incubar as células a 37 °C com 8% de CO₂ e uma velocidade de agitação de 125 rpm até atingirem uma densidade de 3-5 x 10⁶ vc/mL. Monitore a densidade e a viabilidade celular usando a exclusão de azul de tripano com um contador de células automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
3. Quando as células atingirem a densidade celular desejada, divida-as de 1 a 10 adicionando meios frescos para que seu volume total seja dez vezes maior do que o volume original. Se necessário, transferir as células para um balão maior. Retorno à incubação.
4. Continuar a expandir as células conforme descrito nos passos 1.2-1.3 até atingirem uma densidade de pelo menos 2 x 10⁶ vc/ml em 250 ml de meio num balão de 1 L.
5. Na véspera da transfecção, diluir as células para 2 x 10⁶ vc/mL em 250 mL de meio, descartando o excesso de células conforme necessário. Incubar as células durante a noite.
6. No dia da transfecção, centrifugar metade das células a 58 x g por 5 min a 18 °C. Ressuspender o pellet celular no mesmo volume (125 mL) do meio fresco. A viabilidade celular deve ser próxima de 98%.
7. Preparar dois tubos cônicos de 50 mL. Rotule um "PEI" e o outro "DNA".
8. No tubo cônico marcado com PEI, diluir 1,2 mL de PEI (Polietilenimina, ver Tabela de Materiais) para um volume total de 12,5 mL em meio OptiMEM.
9. No tubo cônico marcado com DNA, preparar uma solução equimolar de DNA plasmidial para um total de 500 μg de DNA em um volume total de 12,5 mL em meio OptiMEM.
10. Adicione a solução de DNA à solução de PEI, inverta várias vezes para combinar completamente e deixe incubar à temperatura ambiente por 10 min.
    NOTA: É fundamental que a solução de DNA-PEI seja incubada por 10 min para que o PEI forme complexos carregados com o DNA.
11. Após a incubação da solução de DNA-PEI por 10 min, use uma pipeta sorológica para aplicar lentamente a solução de DNA-PEImax nas células Expi293. Retornar as células transfectadas à incubadora e deixá-las incubar por 72 h (Figura 1).

Figura 1: Expi293 células expressando GFP dois dias após a transfecção. Após a transfecção com um plasmídeo contendo um gene para GFP, as células Expi293 expressam transitoriamente eGFP. A morfologia celular é redonda. A imagem foi capturada com um tempo de exposição de 15 ms. As imagens do microscópio são adquiridas utilizando-se microscópio invertido equipado com iluminação por epifluorescência e objetiva de 10x/0,30. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. purificação do vetor rAAV

1. Após 72 h, transferir as células em suspensão para dois tubos cônicos de 250 mL e girá-las para baixo a 415 x g por 10 min a 4 °C.
2. Despeje o sobrenadante em um tubo cônico fresco de 500 mL e armazene a 0 °C em gelo para processamento posterior.
3. Ressuspender cada pastilha celular em 10 mL de tampão de lise AAV (Tabela 1). Junte os dois lisados em um dos tubos. Enxaguar o outro tubo com mais 5 mL de tampão de lise AAV e, em seguida, adicioná-lo aos lisados agrupados. Congelar a -70 °C.
   Observação : o experimento pode ser pausado neste ponto. Conservar o sobrenadante a -70 °C em vez de no gelo.
4. Adicionar o volume 1:4 da solução de precipitação de AAV ao meio sobrenadante do passo 2.2. Inverter várias vezes para misturar completamente e incubar a 0 °C no gelo durante pelo menos 2 h ou durante a noite.
5. Centrifugar a solução incubada a 3000 x g durante 1 h a 4 °C.
6. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet contendo precipitado viral em 5 mL de tampão de lise AAV.
7. Descongelar o lisado celular a 37 °C em banho-maria.
8. Junte o precipitado viral com o lisado celular. Este é o lisado bruto. Enxaguar o tubo de centrifugação que continha o precipitado viral com mais 5 mL de tampão de lise AAV e agrupar com o lisado bruto.
9. Congelar o lisado bruto a -70 °C e, em seguida, descongelar a 37 °C. Repita este ciclo mais uma vez.
   NOTA: O lisado bruto não deve ser deixado a 37 °C durante mais tempo do que o necessário para o descongelar.
10. Uma vez descongelado pela terceira vez, adicionar imediatamente 4 μL de benzonase ao lisado bruto, inverter para misturar e incubar durante 30 minutos a 37 °C.
11. Centrifugar o lisado bruto durante 10 min a 650 x g a 18 °C.
12. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico limpo de 50 mL. Este é o vírus bruto. Descarte o pellet.
13. Centrifugar o vírus bruto durante mais 30 minutos a 3000 x g a 18 °C para eliminar as proteínas contaminantes.
14. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico limpo de 50 mL. Este é o vírus esclarecido.
    Observação : o experimento pode ser pausado neste ponto. Congelar o vírus clarificado a -70 °C.
15. Configure a bomba peristáltica multicanal com quatro tubos peristálticos (ver Tabela de Materiais). Fixar capilares em ambas as extremidades de cada tubo.
16. Coloque os capilares no lado de entrada da bomba em um copo cheio de água deionizada. Coloque os capilares no lado de saída da bomba em um copo vazio. Acione a bomba peristáltica a 25,0 rpm para lavar a tubulação com água deionizada (DI).
17. Quando estiver completamente lavado, esvazie a tubulação peristáltica acionando a bomba até que a tubulação seja preenchida apenas com ar. Coloque todos os capilares em um lenço limpo sem fiapos.
18. Coloque quatro tubos de ultracentrífuga em um rack no lado de saída da bomba.
19. Use uma pipeta sorológica de 10 mL para distribuir cuidadosamente 10 mL de vírus clarificado em cada tubo de ultracentrífuga. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar.
    NOTA: O volume de vírus clarificado em cada tubo pode ser esticado até 12 mL por tubo, se necessário. Reduza a quantidade de iodixanol a 60% adequadamente no passo 2.25 abaixo.
20. O vírus clarificado é coberto com frações de iodixanol (Tabela 1) da menor densidade para a maior densidade usando a bomba peristáltica. A fração de 15% é adicionada primeiro, seguida pela fração de 25%, a fração de 40% e, finalmente, a fração de 60%. Transferir 22 mL (5,5 mL por tubo de ultracentrífuga) da fração de iodixanol a 15% para um tubo cônico limpo de 50 mL. Coloque os capilares no lado de entrada da bomba para dentro do tubo, tomando cuidado para que todos os capilares estejam tocando o fundo do tubo.
21. Ligue a bomba e deixe a tubulação encher com a fração de iodixanol. Quando a fração iodixanol atingir as extremidades dos capilares no lado de saída da bomba, pare a bomba.
22. Insira um capilar de saída em cada tubo de ultracentrífuga com vírus clarificado, tomando cuidado para que os capilares estejam tocando o fundo de cada tubo de ultracentrífuga.
    OBS: É de fundamental importância que não haja mais ar nos capilares. O iodixanol pode fluir através da tubulação peristáltica a taxas ligeiramente diferentes, portanto, certifique-se de que cada capilar de saída individual seja completamente preenchido com iodixanol antes de inseri-lo no vírus clarificado. Pode ser necessário parar e ligar a bomba várias vezes.
23. Ligue a bomba e deixe os tubos ultracentrífugos encherem. Quando o último da fração de 15% estiver prestes a ser levado para os capilares de entrada, pare a bomba. É fundamental que nenhuma bolha de ar entre na tubulação peristáltica.
    NOTA: Se bolhas de ar entrarem nos capilares de entrada, a bomba pode ser executada brevemente no sentido inverso para empurrá-los de volta para fora.
24. Transferir 22 mL (5,5 mL por tubo ultracentrífugo) da fração de iodixanol a 25% para o tubo cônico de 50 mL. Tome cuidado para que todos os capilares estejam tocando o fundo do tubo e ligue a bomba. Quando o último da fração de 25% estiver prestes a ser levado para os capilares de entrada, pare a bomba.
25. Repetir o passo 2,24 com 20 mL (5 mL por tubo de ultracentrífuga) da fração iodixanol 40% e, em seguida, com 24 mL (6 mL por tubo ultracentrífugo) da fração 60%.
26. Se ainda houver volume não preenchido no tubo da ultracentrífuga, continue a adicionar mais da fração de 60% até que os tubos da ultracentrífuga estejam completamente cheios de líquido.
27. Encha cada tubo até que o lisado faça uma cúpula por cima, mas não transborde do tubo. Pare a bomba e remova cuidadosamente cada capilar de saída, tomando cuidado para não perturbar o gradiente de iodixanol.
28. Tampe cada tubo ultracentrífugo com um espaçador e carregue-o em um rotor Tipo 70 Ti (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Certifique-se de que o rotor está adequadamente equilibrado. Não tente operar a ultracentrífuga sem o treinamento adequado.
29. Coloque o rotor Tipo 70 Ti na ultracentrífuga e centrifugar a 489.000 x g por 1 h a 18 °C.
30. Após a centrifugação, descarregue o rotor da ultracentrífuga. Use alicates nasais de agulha para remover cuidadosamente cada tubo ultracentrífugo do rotor, tomando cuidado para não perturbar o gradiente de iodixanol.
31. Use um suporte de anel de apoio com braçadeira para fixar um tubo ultracentrífugo.
32. Coloque uma agulha de 20 GA a uma seringa de 5 mL e reserve. Use um lenço sem fiapos para remover a tampa do tubo de ultracentrífuga.
33. Penetrar na parede do tubo de ultracentrífuga com a agulha cerca de 3 mm abaixo da interface iodixanol 40%-60% (Figura 2).
34. Aspirar lentamente a interface e parte da fração de 40%. Evite aspirar o topo da fração de 40%, para um sorteio total de cerca de 4 mL.
35. Segurando um dedo sobre a parte superior aberta do tubo de ultracentrífuga, puxe a seringa e transfira a fração de AAV aspirado para um tubo cônico de 50 mL. Descarte a seringa em um recipiente para materiais perfurocortantes. Descarte o tubo ultracentrífugo.
36. Repita as etapas 2.31-2.35 para cada tubo de ultracentrífuga.
37. Diluir a fração aspirada de AAV aproximadamente duas vezes em tampão de lise de AAV para um volume de 40 mL.
38. Lavar a tubulação peristáltica conforme descrito nas etapas 2.16-2.17.
    Observação : o experimento pode ser pausado neste ponto. Conservar a fracção de AAV diluída a 0 °C durante a noite.
39. Carregar 20 mL de cada fração diluída de AAV em dois novos tubos de ultracentrífuga.
40. Para a segunda rodada de centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, a fração diluída de AAV é submersa como descrito acima usando apenas 10 mL (5 mL por tubo de ultracentrífuga) da fração de 40% e 14 mL (7 mL por tubo de ultracentrífuga) da fração de 60%. Repita os passos 2.29-2.36 para ultracentrifugação e aspiração.
    NOTA: Antes de armazenar a bomba peristáltica e a tubulação, lave a tubulação com água DI conforme descrito nas etapas 2.16-2.17.

Figura 2: Gradiente de iodixanol com interface iodixanol marcada com 40%-60%. (A) Primeiro gradiente de iodixanol. O vermelho de fenol é usado nas frações de iodixanol 40% e iodixanol 60%. Aparece como uma cor diferente por causa da diferença de pH entre as duas frações. A seta indica onde a seringa deve ser inserida para colher a fração rAAV, logo abaixo da interface iodixanol 40%-60%. (B) Segundo gradiente de iodixanol. Apenas as frações iodixanol 40% e 60% são utilizadas nesta etapa. A seta indica onde a seringa deve ser inserida para colher a fração rAAV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Troca de tampão e concentração do vírus

1. Após obter a fração AAV da segunda rodada de centrifugação do gradiente de densidade de iodixanol, dilua-a duas vezes com solução tampão de AAV.
2. Equilibrar o filtro centrífugo adicionando 20 mL de solução tampão AAV à parte superior do filtro. Centrifugar o aparelho a 3000 x g a 18 °C durante 5 min e eliminar o fluxo.
3. Adicionar a fracção AAV diluída ao filtro centrífugo. Centrifugar o aparelho a 3000 x g a 18 °C durante 5 min e eliminar o fluxo.
4. Adicionar 20 ml de solução tampão AAV à parte superior do filtro. Centrifugar o aparelho a 3000 x g a 18 °C durante 5 min e eliminar o fluxo.
   NOTA: Se a membrana do filtro centrífugo ficar bloqueada, fazendo com que a solução flua de forma ineficiente, use cuidadosamente uma micropipeta P200 para puxar para cima e para baixo a solução na parte superior do filtro. Tome extremo cuidado para não tocar no filtro com a ponta da micropipeta.
5. Repita a etapa 3.4 mais duas vezes.
   NOTA: Certifique-se de que o AAV não está excessivamente concentrado, mantendo pelo menos 1 mL de volume na parte superior do filtro. Pode ser necessário ajustar os tempos de centrifugação para evitar a concentração excessiva. Se o AAV estiver superconcentrado, pode ocorrer precipitação.
6. Para um título final na faixa de 10^{a 12} vg/mL, gire o vírus para um volume final de cerca de 1 mL.
   NOTA: Dependendo da espinha dorsal do sorotipo usado e da eficiência da embalagem do vírus, você pode ter que concentrar o vírus em um volume menor.
7. Use uma micropipeta p1000 para transferir o AAV concentrado da parte superior do filtro centrífugo para um tubo de microcentrífuga. Use uma micropipeta p200 para lavar o filtro centrífugo com 50 μL de tampão AAV para coletar qualquer vírus restante e agrupar com o restante do AAV concentrado.
8. Separe uma alíquota de 2 μL do AAV concentrado para titulação. Consulte a Tabela Suplementar 1 para visualizar os primers ITR que podem ser usados para qPCR.
9. Passe o AAV concentrado através de um filtro de seringa de 0,2 μm para esterilizá-lo.
   NOTA: Ao esterilizar um pequeno volume, tenha o cuidado de selecionar um filtro de seringa com um diâmetro pequeno, a fim de minimizar a perda de vírus. O uso de um filtro de ligação de baixa proteína de um pequeno diâmetro resultará em perda viral mínima (dados não mostrados).
10. O AAV esterilizado pode ser usado imediatamente para transduzir células ou armazenado a 4 °C para uso dentro de quatro semanas. Deve ser armazenado a -70 °C para armazenamento a longo prazo.

Resultados

Este método pode ser usado para obter títulos de pelo menos^{10 a 12} partículas virais por mL. Um título pode ser obtido (Figura 3) por qPCR usando os primers ITR fornecidos na Tabela Suplementar 1, por ddPCR ou por qualquer outro método de titulação. Títulos subótimos podem resultar do uso de um gene de tampa que codifica um capsídeo com baixa eficiência de embalagem.

Outra possível fonte de resultados subótimos é ...

Discussão

O protocolo de purificação com gradiente de densidade de iodixanol duplo é o método universal, pois é aplicável a qualquer variante mutante do AAV, independentemente de sua especificidade receptora. Os primeiros métodos de purificação de AAV baseavam-se na densidade de partículas e incluíam centrifugação isopicnica em CsCl e centrifugação contínua por gradiente de densidade de sacarose¹⁹. Posteriormente, foram desenvolvidas abordagens sorotipo-específicas, que utilizaram anticorpo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C