Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

Riepilogo

Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono^10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .

Abstract

Questo protocollo descrive la produzione e la purificazione di virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) mediante centrifugazione a gradiente di densità dello iodio, un metodo sierotipo-agnostico di purificazione dell'AAV descritto per la prima volta nel 1999. I vettori rAAV sono ampiamente utilizzati nelle applicazioni di terapia genica per veicolare transgeni a vari tipi di cellule umane. In questo lavoro, il virus ricombinante è prodotto dalla trasfezione di cellule Expi293 in coltura in sospensione con plasmidi che codificano per il transgene, il capside vettore e i geni helper adenovirali. La centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo purifica le particelle AAV complete in base alla densità delle particelle. Inoltre, in questa metodologia ormai onnipresente sono incluse tre fasi al fine di aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione a causa della contaminazione delle proteine e concentrare ulteriormente il prodotto virale finale, rispettivamente: precipitazione di particelle virali da terreni cellulari utilizzando una soluzione di polietilenglicole (PEG) e cloruro di sodio, l'introduzione di un secondo ciclo di centrifugazione a gradiente di densità dello iodixanolo, e lo scambio di tamponi tramite un filtro centrifugo. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere costantemente titoli nell'intervallo di^10-12 particelle virali/mL di eccezionale purezza per l'uso in vivo .

Introduzione

I vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) sono strumenti ampiamente utilizzati per il trattamento di malattie genetiche, tra cui l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica e l'emofilia A ^1,2,3. I vettori rAAV sono ingegnerizzati per mancare dei geni virali presenti nell'AAV⁴ wild-type, un piccolo virus icosaedrico senza involucro con un genoma lineare di DNA a singolo filamento di 4,7 kb. L'AAV è stato scoperto per la prima volta negli anni '60 come contaminante dei preparati di adenovirus⁵. Nonostante le sue ....

Protocollo

La composizione delle soluzioni e dei tamponi utilizzati in questo protocollo è fornita nella Tabella 1.

Soluzione	Composizione
Tampone di lisi AAV	1,2 mL di soluzione 5 M di NaCl
	2 mL di soluzione 1 M Tris-HCl pH 8,5
	80 uL di soluzione di 1 M di MgCl2
	mQ acqua fino a 40 mL
Soluzione di precipitazione AAV

Discussione

Il protocollo di purificazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo è il metodo universale perché è applicabile a qualsiasi variante mutante AAV, indipendentemente dalla loro specificità recettoriale. I primi metodi di purificazione dell'AAV si basavano sulla densità delle particelle e includevano la centrifugazione isopicnica in CsCl e la centrifugazione continua a gradiente di densità del saccarosio¹⁹. Successivamente, sono stati sviluppati approcci sierotipo-specifici, che hanno fa.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C