İn Vivo Uygulamalar için İodiksanol Yoğunluk Gradyan Santrifüjü ile Adeno İlişkili Virüsün Süspansiyon Kültürü Üretimi ve Saflaştırılması

Özet

Adeno ilişkili virüs, süspansiyon hücre kültüründe üretilir ve çift iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırılır. Toplam virüs verimini artırmak, virüs çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da konsantre etmek için adımlar dahil edilmiştir. Beklenen nihai titreler 10¹² viral partikül/mL'ye ulaşır ve klinik öncesi in vivo kullanım için uygundur.

Özet

Bu protokol, ilk olarak 1999'da tanımlanan AAV'yi saflaştırmak için serotipten bağımsız bir yöntem olan iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjleme ile rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) üretimini ve saflaştırılmasını açıklar. rAAV vektörleri, transgenleri çeşitli insan hücre tiplerine iletmek için gen terapisi uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, rekombinant virüs, transgen, vektör kapsid ve adenoviral yardımcı genleri kodlayan plazmitlerle süspansiyon kültüründe Expi293 hücrelerinin transfeksiyonu ile üretilir. İodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjü, partikül yoğunluğuna dayalı olarak tam AAV partiküllerini saflaştırır. Ek olarak, toplam virüs verimini artırmak, kontamine proteinler nedeniyle çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da yoğunlaştırmak için şu anda her yerde bulunan bu metodolojiye sırasıyla üç adım dahil edilmiştir: bir polietilen glikol (PEG) ve sodyum klorür çözeltisi kullanılarak hücre ortamından viral partiküllerin çökeltilmesi, ikinci bir iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüj turunun tanıtılması, ve santrifüj filtre ile tampon değişimi. Bu yöntemi kullanarak, in vivo kullanım için 10¹² viral partikül / mL aralığında olağanüstü saflıkta titreleri tutarlı bir şekilde elde etmek mümkündür.

Giriş

Rekombinant adeno ilişkili viral (rAAV) vektörler, spinal müsküler atrofi, retina distrofisi ve hemofili A^dahil olmak üzere genetik hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılan araçlardır ^1,2,3. rAAV vektörleri, doğrusal tek sarmallı 4.7 kb DNA genomuna sahip küçük, zarfsız bir ikosahedral virüs olan vahşi tip AAV^4'te bulunan viral genlerden yoksun olacak şekilde tasarlanmıştır. AAV ilk olarak 1960'larda adenovirüs preparatlarının bir kontaminantı olarak keşfedildi⁵. ITR'ler⁶ hariç maksimum 4.9 kb i....

Protokol

Bu protokolde kullanılan çözeltilerin ve tamponların bileşimi Tablo 1'de verilmiştir.

Çözüm	Kompozisyon
AAV lizis tamponu	1.2 mL 5 M NaCl çözeltisi
	2 mL 1 M Tris-HCl pH 8.5 çözeltisi
	80 uL 1 M MgCl2 çözeltisi
	40 mL'ye kadar mQ su
AAV çökeltme çözeltisi	40 g PEG 8000

Tartışmalar

Çift iyodiksanol yoğunluk gradyan saflaştırma protokolü evrensel yöntemdir, çünkü reseptör özgüllüklerine bakılmaksızın herhangi bir AAV mutant varyantına uygulanabilir. AAV saflaştırmanın erken yöntemleri, partikül yoğunluğuna dayanıyordu ve CsCl'de izopiknik santrifüjleme ve sürekli sükroz yoğunluk gradyan santrifüjünü^{içeriyordu 19}. Daha sonra, Sefaroz kolonlarına²⁰ bağlı monoklonal antikorları kullanan serotipe özgü yaklaşımlar ge.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C