Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Adeno ilişkili virüs, süspansiyon hücre kültüründe üretilir ve çift iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırılır. Toplam virüs verimini artırmak, virüs çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da konsantre etmek için adımlar dahil edilmiştir. Beklenen nihai titreler 1012 viral partikül/mL'ye ulaşır ve klinik öncesi in vivo kullanım için uygundur.

Özet

Bu protokol, ilk olarak 1999'da tanımlanan AAV'yi saflaştırmak için serotipten bağımsız bir yöntem olan iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjleme ile rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) üretimini ve saflaştırılmasını açıklar. rAAV vektörleri, transgenleri çeşitli insan hücre tiplerine iletmek için gen terapisi uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, rekombinant virüs, transgen, vektör kapsid ve adenoviral yardımcı genleri kodlayan plazmitlerle süspansiyon kültüründe Expi293 hücrelerinin transfeksiyonu ile üretilir. İodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjü, partikül yoğunluğuna dayalı olarak tam AAV partiküllerini saflaştırır. Ek olarak, toplam virüs verimini artırmak, kontamine proteinler nedeniyle çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da yoğunlaştırmak için şu anda her yerde bulunan bu metodolojiye sırasıyla üç adım dahil edilmiştir: bir polietilen glikol (PEG) ve sodyum klorür çözeltisi kullanılarak hücre ortamından viral partiküllerin çökeltilmesi, ikinci bir iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüj turunun tanıtılması, ve santrifüj filtre ile tampon değişimi. Bu yöntemi kullanarak, in vivo kullanım için 1012 viral partikül / mL aralığında olağanüstü saflıkta titreleri tutarlı bir şekilde elde etmek mümkündür.

Giriş

Rekombinant adeno ilişkili viral (rAAV) vektörler, spinal müsküler atrofi, retina distrofisi ve hemofili Adahil olmak üzere genetik hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılan araçlardır 1,2,3. rAAV vektörleri, doğrusal tek sarmallı 4.7 kb DNA genomuna sahip küçük, zarfsız bir ikosahedral virüs olan vahşi tip AAV4'te bulunan viral genlerden yoksun olacak şekilde tasarlanmıştır. AAV ilk olarak 1960'larda adenovirüs preparatlarının bir kontaminantı olarak keşfedildi5. ITR'ler6 hariç maksimum 4.9 kb ile paketlenebilen transgenin boyutunu sınırlayan küçük kapsid boyutuna rağmen, AAV, insanlarda patojenik olmadığı, birçok bölünen ve bölünmeyen hücre tipinde transgen ekspresyonuna izin verdiği ve sınırlı immünojenik etkilere sahip olduğu için transgen iletimi için yararlıdır7.

Dependoparvovirus cinsinin üyeleri olarak, rAAV'lerin üretimi, adenovirüs veya herpes simpleks virüsünde bulunan yardımcı genlerin ekspresyonuna dayanır8. rAAV üretmek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir, ancak adenoviral E1A/E1B yardımcı genleri ile dönüştürülen HEK293 hücrelerinde üretim günümüzde kullanılan en yaygın yöntemdir9. rAAV üretiminin genel yaklaşımı, HEK293 hücrelerinin, sırasıyla ters terminal tekrarlar (ITR'ler), AAV rep ve cap genleri ve ek adenoviral yardımcı genler içinde transgeni içeren üç plazmid ile transfeksiyonu ile başlar. Transfeksiyondan yetmiş iki saat sonra, transgeni içeren rAAV'yi saflaştırmak için hücreler toplanır ve işlenir.

Terapötik amaçlar için yeni rAAV vektörlerinin geliştirilmesinde, ana hedef, artan transdüksiyon verimliliğine sahip vektörler üretmektir. Hedef hücrelerin transdüksiyon verimliliğindeki bir artış, gerekli klinik rAAV dozunda bir azalma anlamına gelir, böylece antikor aracılı nötralizasyondan akut toksisitelere kadar değişen olumsuz immünojenik etkilerin olasılığını azaltır10,11. rAAV vektörlerinin transdüksiyon etkinliğini arttırmak için, paketlenmiş genomda veya kapsidde değişiklikler yapılabilir. Paketlenmiş genom tasarımı yoluyla transdüksiyon etkinliğini ayarlamak için uygulanabilir yöntemler arasında güçlü ve dokuya özgü promotörlerin dahil edilmesi, mRNA işleme elemanlarının dikkatli seçimi ve çeviri verimliliğini artırmak için kodlama dizisi optimizasyonu yer alır12. Kapsidde yapılan değişiklikler, hedef insan hücre tipleri için tropizmi artırmak amacıyla yapılır. Yeni rAAV transgen iletim vektörü kapsidleri geliştirmeye yönelik çabalar, genellikle, belirli hücre reseptörlerini hedefleyen spesifik mutasyonlara sahip AAV kapsidlerinin rasyonel tasarımına veya belirli bir reseptörü hedeflemeden yüksek karmaşıklıktaki kombinatoryal kapsid kütüphanelerinden belirli hücre tipleri için tropizmli kapsidleri tanımlamak için yönlendirilmiş evrime odaklanarak karakterize edilir (bazı gruplar bu yaklaşımları birleştirse de)13, 14,15. Yönlendirilmiş evrim yaklaşımında, kombinatoryal kapsid kütüphaneleri, kapsid dış16 üzerinde mutasyona uğramış değişken bölgelere sahip belirli bir serotip omurgası kullanılarak oluşturulur. Kombinatoryal kapsid kütüphaneleri genellikle insanlardan kaynaklanmayan AAV serotiplerinden oluşturulur ve klinik kullanım sırasında önceden var olan bağışıklık riskini azaltır10. Bu nedenle, herhangi bir serotipe uygulanabilen saflaştırma yöntemleri, bu kütüphaneler için omurga görevi gören daha az kullanılan serotipler için serotipe özgü optimizasyon ihtiyacını ortadan kaldırmak için idealdir.

İodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjü, yüksek enfektiviteye sahip yüksek rAAV titrelerini saflaştırmak için kullanılır17. Bu protokolde, büyük AAV titreleri üretmek için gereken emek miktarını azaltmak için süspansiyon hücre kültüründe rAAV üretilir. Kirletici proteinlerin varlığını azaltmak ve virüs çökelmesi riskini azaltmak için hücre lizatını temizlemek için bir santrifüjleme adımı da dahildir. Bu protokol, klinik öncesi kullanıma uygun yüksek saflıkta rAAV preparatları üretmek için uygun maliyetli bir yöntemdir.

Protokol

Bu protokolde kullanılan çözeltilerin ve tamponların bileşimi Tablo 1'de verilmiştir.

ÇözümKompozisyon
AAV lizis tamponu1.2 mL 5 M NaCl çözeltisi
2 mL 1 M Tris-HCl pH 8.5 çözeltisi
80 uL 1 M MgCl2 çözeltisi
40 mL'ye kadar mQ su
AAV çökeltme çözeltisi40 g PEG 8000
50 mL 5 M NaCl çözeltisi
mQ su ila 100 mL
% 15 iyodiksanol fraksiyonu7,5 mL OptiPrep
3 mL 10X DPBS
6 mL 5 M NaCl çözeltisi
30 uL 1 M MgCl2 çözeltisi
mQ ila 30 mL
% 25 iyodiksanol fraksiyonu12. 5 mL OptiPrep
3 mL 10X DPBS
30 uL 1 M MgCl2 çözeltisi
60 uL fenol kırmızısı çözelti
mQ ila 30 mL
% 40 iyodiksanol fraksiyonu33.3 mL OptiPrep
5 mL 10X DPBS
50 uL 1 M MgCl2 çözeltisi
mQ ila 50 mL
% 60 iyodiksanol fraksiyonu50 mL OptiPrep
100 uL fenol kırmızısı çözelti
AAV tampon çözeltisi8 mL 5 M NaCl
20 uL %10 Pluronic F-68
PBS için 200 mL

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözeltiler için çözelti bileşimleri.

1. Expi293 hücrelerinin üçlü transfeksiyonu

  1. Tohum Expi293 hücreleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) 5 x 105 canlı hücre (vc) / mL başlangıç yoğunluğunda.
  2. Hücrelerin 37 °C'de %8 CO2 ve 125 rpm çalkalayıcı hızı ile 3-5 x 106 vc/mL yoğunluğa ulaşana kadar inkübe etmesine izin verin. Otomatik bir hücre sayacı ile tripan mavisi dışlamasını kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını izleyin (bkz.
  3. Hücreler istenen hücre yoğunluğuna ulaştığında, toplam hacimleri orijinal hacminin on katı olacak şekilde yeni ortam ekleyerek bunları 1'den 10'a bölün. Gerekirse, hücreleri daha büyük bir şişeye aktarın. Kuluçkaya geri dönün.
  4. Hücreleri, 1 L'lik bir şişede 250 mL ortamda en az 2 x 106 vc/mL yoğunluğa ulaşana kadar 1.2-1.3 adımlarında açıklandığı gibi genişletmeye devam edin.
  5. Transfeksiyondan bir gün önce, hücreleri 250 mL ortamda 2 x 106 vc / mL'ye seyreltin ve gerektiğinde fazla hücreleri atın. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
  6. Transfeksiyon gününde, hücrelerin yarısını 18 ° C'de 5 dakika boyunca 58 x g'de santrifüjleyin. Hücre peletini aynı hacimde (125 mL) taze ortamda yeniden süspanse edin. Hücre canlılığı %98'e yakın olmalıdır.
  7. İki adet 50 mL konik tüp hazırlayın. Birini "PEI" ve diğerini "DNA" olarak etiketleyin.
  8. PEI etiketli konik tüpte, 1,2 mL PEI'yi (Polietilenimin, Malzeme Tablosuna bakınız) OptiMEM ortamında toplam 12,5 mL hacme kadar seyreltin.
  9. DNA etiketli konik tüpte, OptiMEM ortamında toplam 12,5 mL hacimde toplam 500 μg DNA'ya eşmolar bir plazmit DNA çözeltisi hazırlayın.
  10. DNA çözeltisini PEI çözeltisine ekleyin, iyice birleştirmek için birkaç kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    NOT: PEI'nin DNA ile yüklü kompleksler oluşturması için DNA-PEI çözeltisinin tam 10 dakika inkübe edilmesine izin verilmesi çok önemlidir.
  11. DNA-PEI çözeltisi 10 dakika inkübe edildikten sonra, DNA-PEImax çözeltisini Expi293 hücrelerine yavaşça uygulamak için serolojik bir pipet kullanın. Transfekte edilmiş hücreleri inkübatöre geri koyun ve 72 saat inkübe etmelerine izin verin (Şekil 1).

figure-protocol-4622
Şekil 1: Transfeksiyondan iki gün sonra GFP eksprese eden Expi293 hücreleri. GFP için bir gen içeren bir plazmit ile transfeksiyondan sonra, Expi293 hücreleri geçici olarak eGFP'yi eksprese eder. Hücre morfolojisi yuvarlaktır. Görüntü 15 ms pozlama süresiyle çekildi. Mikroskop görüntüleri, epi-floresan aydınlatma ve 10x/0.30 objektif ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak elde edilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. rAAV vektör saflaştırma

  1. 72 saat sonra, süspansiyon halindeki hücreleri iki adet 250 mL'lik konik tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 415 x g'de döndürün.
  2. Süpernatan ortamı 500 mL'lik taze bir konik tüpe dökün ve daha sonra işlenmek üzere buz üzerinde 0 °C'de saklayın.
  3. Her hücre peletini 10 mL AAV lizis tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 1). İki lizatı tüplerden birinde bir araya getirin. Diğer tüpü ilave 5 mL AAV lizis tamponu ile durulayın, ardından havuzlanmış lizatlara ekleyin. -70 °C'de dondurun.
    NOT: Deneme bu noktada duraklatılabilir. Süpernatan ortamı buz yerine -70 °C'de saklayın.
  4. Adım 2.2'den süpernatan ortama 1:4 hacim AAV çökeltme çözeltisi ekleyin. İyice karıştırmak için birkaç kez ters çevirin ve buz üzerinde 0 °C'de en az 2 saat veya gece boyunca inkübe edin.
  5. İnkübe edilmiş çözeltiyi 4 ° C'de 1 saat boyunca 3000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı atın ve viral çökelti içeren peleti 5 mL AAV lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
  7. Hücre lizatını 37 °C'de bir su banyosunda çözdürün.
  8. Viral çökeltiyi hücre lizatı ile bir araya getirin. Bu ham lizattır. Viral çökeltiyi içeren santrifüj tüpünü ilave 5 mL AAV lizis tamponu ile durulayın ve ham lizat ile havuzlayın.
  9. Ham lizatı -70 °C'de dondurun, ardından 37 °C'de çözdürün. Bu döngüyü bir kez daha tekrarlayın.
    NOT: Ham lizat, 37 °C'de çözülmesi gerekenden daha uzun süre bırakılmamalıdır.
  10. Üçüncü kez çözüldükten sonra, ham lizata hemen 4 μL benzonaz ekleyin, karıştırmak için ters çevirin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  11. Ham lizatı 18 ° C'de 650 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
  12. Süpernatanı temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. Bu ham virüstür. Peleti atın.
  13. Kirletici proteinleri temizlemek için ham virüsü 18 ° C'de 3000 x g'de 30 dakika daha santrifüjleyin.
  14. Süpernatanı temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. Bu açıklığa kavuşturulmuş virüstür.
    NOT: Deneme bu noktada duraklatılabilir. Arıtılmış virüsü -70 °C'ye kadar dondurun.
  15. Çok kanallı peristaltik pompayı dört peristaltik tüple kurun (Malzeme Tablosuna bakın). Kılcal damarları her tüpün her iki ucuna takın.
  16. Kılcal damarları pompanın giriş tarafında, deiyonize suyla dolu bir behere yerleştirin. Pompanın çıkış tarafındaki kılcal damarları boş bir behere yerleştirin. Hortumu deiyonize (DI) suyla yıkamak için peristaltik pompayı 25.0 rpm'de çalıştırın.
  17. İyice yıkandığında, hortum sadece hava ile dolana kadar pompayı çalıştırarak peristaltik boruyu boşaltın. Tüm kılcal damarları temiz, tüy bırakmayan bir mendil üzerine koyun.
  18. Dört ultrasantrifüj tüpünü pompanın çıkış tarafındaki bir rafa yerleştirin.
  19. Her bir ultrasantrifüj tüpüne 10 mL arıtılmış virüsü dikkatlice dağıtmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanın. Hava kabarcıkları girmemesine dikkat edin.
    NOT: Her tüpteki arıtılmış virüs hacmi, gerekirse tüp başına 12 mL'ye kadar uzatılabilir. Aşağıdaki 2.25 adımında% 60 iyodiksanol miktarını uygun şekilde azaltın.
  20. Arıtılmış virüs, peristaltik pompa kullanılarak en düşük yoğunluktan en yüksek yoğunluğa kadar iyodiksanol fraksiyonları (Tablo 1) ile kaplanmıştır. Önce %15 kesir, ardından %25 kesir, %40 kesir ve son olarak %60 kesir eklenir. % 15 iyodiksanol fraksiyonunun 22 mL'sini (ultrasantrifüj tüpü başına 5.5 mL) temiz bir 50 mL konik tüpe aktarın. Pompanın giriş tarafındaki kılcal damarları, tüm kılcal damarların borunun dibine temas etmesine dikkat ederek boruya yerleştirin.
  21. Pompayı çalıştırın ve borunun iyodiksanol fraksiyonu ile dolmasına izin verin. İodiksanol fraksiyonu, pompanın çıkış tarafındaki kılcal damarların uçlarına ulaştığında, pompayı durdurun.
  22. Kılcal damarların her bir ultrasantrifüj tüpünün dibine temas etmesine dikkat ederek, arıtılmış virüslü her bir ultrasantrifüj tüpüne bir çıkış kılcal yerleştirin.
    NOT: Kılcal damarlarda hava kalmaması kritik öneme sahiptir. İodiksanol, peristaltik borudan biraz farklı oranlarda akabilir, bu nedenle her bir çıkış kılcalının arıtılmış virüse yerleştirmeden önce tamamen iyodiksanol ile doldurulduğundan emin olun. Pompayı birkaç kez durdurmak ve çalıştırmak gerekebilir.
  23. Pompayı çalıştırın ve ultrasantrifüj tüplerinin dolmasına izin verin. %15'lik fraksiyonun sonuncusu giriş kılcal damarlarına alınmak üzereyken pompayı durdurun. Peristaltik boruya hava kabarcığı girmemesi çok önemlidir.
    NOT: Giriş kılcal damarlarına hava kabarcıkları girerse, pompa bunları geri itmek için kısa bir süre ters yönde çalıştırılabilir.
  24. % 25 iyodiksanol fraksiyonunun 22 mL'sini (ultrasantrifüj tüpü başına 5.5 mL) 50 mL konik tüpe aktarın. Tüm kılcal damarların borunun dibine temas etmesine dikkat edin ve pompayı çalıştırın. %25'lik fraksiyonun sonuncusu giriş kılcal damarlarına alınmak üzereyken pompayı durdurun.
  25. Adım 2.24'ü% 40 iyodiksanol fraksiyonunun 20 mL'si (ultrasantrifüj tüpü başına 5 mL) ve ardından% 60 fraksiyonunun 24 mL'si (ultrasantrifüj tüpü başına 6 mL) ile tekrarlayın.
  26. Ultrasantrifüj tüpünde hala doldurulmamış hacim varsa, ultrasantrifüj tüpleri tamamen sıvı ile dolana kadar% 60 fraksiyondan daha fazlasını eklemeye devam edin.
  27. Lizat üstte bir kubbe yapana kadar her tüpü doldurun, ancak tüpten taşmayın. Pompayı durdurun ve iyodiksanol gradyanını bozmamaya dikkat ederek her bir çıkış kılcal damarını dikkatlice çıkarın.
  28. Her ultrasantrifüj tüpünü bir ara parça ile kapatın ve Tip 70 Ti rotora yükleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Rotorun uygun şekilde dengelendiğinden emin olun. Uygun eğitim olmadan ultrasantrifüjü çalıştırmaya çalışmayın.
  29. Tip 70 Ti rotoru ultrasantrifüje yükleyin ve 18 °C'de 1 saat boyunca 489.000 x g'da santrifüj edin.
  30. Santrifüjlemeden sonra rotoru ultrasantrifüjden boşaltın. İodiksanol gradyanını bozmamaya dikkat ederek her bir ultrasantrifüj tüpünü rotordan dikkatlice çıkarmak için iğne burunlu pense kullanın.
  31. Bir ultrasantrifüj tüpünü sabitlemek için kelepçeli bir destek halkası standı kullanın.
  32. 5 mL'lik bir şırıngaya 20 GA'lık bir iğne takın ve bir kenara koyun. Kapağı ultrasantrifüj tüpünden çıkarmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın.
  33. Ultrasantrifüj tüpünün duvarına iğne ile% 40 -% 60 iyodiksanol arayüzünün yaklaşık 3 mm altına nüfuz edin (Şekil 2).
  34. Arayüzü ve% 40 fraksiyonunun bir kısmını yavaşça aspire edin. Yaklaşık 4 mL'lik bir toplam çekiş için %40'lık fraksiyonun tepesini aspire etmekten kaçının.
  35. Bir parmağınızı ultrasantrifüj tüpünün açık üst kısmı üzerinde tutarak şırıngayı dışarı çekin ve aspire edilen AAV fraksiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Şırıngayı keskin bir kaba atın. Ultrasantrifüj tüpünü atın.
  36. Her ultrasantrifüj tüpü için 2.31-2.35 adımlarını tekrarlayın.
  37. Aspire edilen AAV fraksiyonunu AAV lizis tamponunda yaklaşık iki kat 40 mL'lik bir hacme seyreltin.
  38. Peristaltik boruyu 2.16-2.17 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın.
    NOT: Deneme bu noktada duraklatılabilir. Seyreltilmiş AAV fraksiyonunu gece boyunca 0 °C'de saklayın.
  39. Seyreltilmiş AAV fraksiyonunun her birini 20 mL'yi iki yeni ultrasantrifüj tüpüne yükleyin.
  40. İodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesinin ikinci turu için, seyreltilmiş AAV fraksiyonu, %40 fraksiyonun sadece 10 mL'si (ultrasantrifüj tüpü başına 5 mL) ve %60 fraksiyonun 14 mL'si (ultrasantrifüj tüpü başına 7 mL) kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi altlanır. Ultrasantrifüj ve aspirasyon için 2.29-2.36 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Peristaltik pompayı ve hortumu saklamadan önce, 2.16-2.17 adımlarında açıklandığı gibi hortumu DI suyla yıkayın.

figure-protocol-13359
Şekil 2: %40-60 iyodiksanol arayüzü etiketli iyodiksanol gradyanı. (A) İlk iyodiksanol gradyanı. Fenol kırmızısı, %40 iyodiksanol ve %60 iyodiksanol fraksiyonlarında kullanılır. İki fraksiyon arasındaki pH farkından dolayı farklı bir renk olarak görünür. Ok, %40-%60 iyodiksanol arayüzünün hemen altında, rAAV fraksiyonunu hasat etmek için şırınganın nereye yerleştirilmesi gerektiğini gösterir. (B) İkinci iyodiksanol gradyanı. Bu adımda sadece %40 ve %60 iyodiksanol fraksiyonları kullanılır. Ok, rAAV fraksiyonunu hasat etmek için şırınganın nereye yerleştirilmesi gerektiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Tampon değişimi ve virüs konsantrasyonu

  1. İodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesinin ikinci turundan AAV fraksiyonunu elde ettikten sonra, AAV tampon çözeltisi ile iki kat seyreltin.
  2. Filtrenin üstüne 20 mL AAV tampon çözeltisi ekleyerek santrifüj filtreyi dengeleyin. Aparatı 3000 x g'de 18 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve akışı atın.
  3. Seyreltilmiş AAV fraksiyonunu santrifüj filtreye ekleyin. Aparatı 3000 x g'de 18 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve akışı atın.
  4. Filtrenin üstüne 20 mL AAV tampon çözeltisi ekleyin. Aparatı 3000 x g'de 18 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve akışı atın.
    NOT: Santrifüj filtre membranı tıkanır ve çözeltinin verimsiz bir şekilde akmasına neden olursa, çözeltiyi filtrenin üst kısmında yukarı ve aşağı çekmek için dikkatli bir şekilde bir P200 mikropipet kullanın. Mikropipet ucuyla filtreye dokunmamaya çok dikkat edin.
  5. Adım 3.4'ü iki kez daha tekrarlayın.
    NOT: Filtrenin üst kısmında en az 1 mL hacim bırakarak AAV'nin aşırı konsantre olmadığından emin olun. Aşırı konsantrasyonu önlemek için santrifüj sürelerini ayarlamak gerekebilir. AAV aşırı konsantre ise, yağış meydana gelebilir.
  6. 1012 vg / mL aralığında son bir titre için, virüsü yaklaşık 1 mL'lik bir son hacme döndürün.
    NOT: Kullanılan serotip omurgasına ve virüsün paketleme verimliliğine bağlı olarak, virüsü daha küçük bir hacimde konsantre etmeniz gerekebilir.
  7. Konsantre AAV'yi santrifüj filtrenin üstünden bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir p1000 mikropipet kullanın. Kalan virüsleri toplamak ve konsantre AAV'nin geri kalanıyla bir araya getirmek için santrifüj filtreyi 50 μL AAV tamponu ile yıkamak için bir p200 mikropipet kullanın.
  8. Titre için konsantre AAV'nin 2 μL'lik bir alikotunu bir kenara koyun. qPCR için kullanılabilecek ITR primerlerini görüntülemek için Ek Tablo 1'e bakın.
  9. Konsantre AAV'yi sterilize etmek için 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin.
    NOT: Küçük bir hacmi sterilize ederken, virüs kaybını en aza indirmek için küçük çaplı bir şırınga filtresi seçmeye dikkat edin. Küçük çaplı düşük proteinli bağlayıcı bir filtrenin kullanılması, minimum viral kayba neden olacaktır (veriler gösterilmemiştir).
  10. Sterilize edilmiş AAV, hücreleri dönüştürmek için hemen kullanılabilir veya dört hafta içinde kullanılmak üzere 4 ° C'de saklanabilir. Daha uzun süreli depolama için -70 °C'de saklanmalıdır.

Sonuçlar

Bu yöntem, mL başına en az 1012 viral partikül titresi elde etmek için kullanılabilir. Ek Tablo 1'de verilen ITR primerleri kullanılarak, ddPCR ile veya başka herhangi bir titre yöntemi ile qPCR ile bir titre elde edilebilir (Şekil 3). Yetersiz titreler, zayıf paketleme verimliliğine sahip bir kapsidi kodlayan bir kapak geninin kullanılmasından kaynaklanabilir.

Optimal olmayan sonuçların bir başka olası kayna?...

Tartışmalar

Çift iyodiksanol yoğunluk gradyan saflaştırma protokolü evrensel yöntemdir, çünkü reseptör özgüllüklerine bakılmaksızın herhangi bir AAV mutant varyantına uygulanabilir. AAV saflaştırmanın erken yöntemleri, partikül yoğunluğuna dayanıyordu ve CsCl'de izopiknik santrifüjleme ve sürekli sükroz yoğunluk gradyan santrifüjünüiçeriyordu 19. Daha sonra, Sefaroz kolonlarına20 bağlı monoklonal antikorları kullanan serotipe özgü yaklaşımlar ge...

Açıklamalar

Yazarların bildirecek herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5810 R benchtop centrifugeEppendorf22625501
8-channel peristaltic pump Watson-Marlow020.3708.00A
Automated cell counter NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifugeBeckman Coulter369001
BenzonaseThermo Scientific88701
Biological safety cabinetLabconco322491101
CO2 incubator with shaker Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965250 mL
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965015 mL
Disposable micro-pipetsFisherbrand21-164-2GCapillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscopeNikon
Expi293 Expression MediumGibcoA1435101
Expi293F cellsGibcoA14527
Filter tipsUSA Scientific1126-78101000 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-8810200 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-181020 µL
Filter tipsUSA Scientific1121-381010 µL
Hypodermic needlesTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lidVWR10146-184
JS-5.3 rotorBeckman Coulter368690
Magnesium chloride solution (1 M)Millipore SigmaM1028-100ML
Metal stand and clamp Fisherbrand05-769-6Q
Microcentrifuge tubesEppendorf226000281.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced-Serum MediumGibco31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)SerumwerkAXS-111454260% iodixanol solution
P1000 PipetGilsonF144059M
P2 PipetGilsonF144054M
P20 PipetGilsonF144056M
P200 PipetGilsonF144058M
Phenol red solutionSigma-AldrichP0290
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP4474
Pipet-Aid XP pipette controllerDrummond Scientific4-000-101
Plasmid pCapsidDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pACGrh74. 
Plasmid pHelperAddgene112867
Plasmid pTransgeneDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)Mp Biomedicals92750049
Polyethylene glycol 8000Research Products InternationalP48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)PolysciencesNC1038561Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning431123500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning430776250 mL
Polypropylene Optiseal tubesBeckman Coulter361625
Serological pipettesAlkali ScientificSP250-B50 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP225-B25 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP210-B10 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP205-B5 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV10001 L
Shaker flasksFisherbrandPBV50-0500 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV250250 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV12-5125 mL
Sodium chloride solution (5 M)Fisher ScientificNC1752640
Sterile syringesFisherbrand14-955-4585 mL
Syringe filterMilliporeSLGV013SL0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)Kd MedicalRGE3363
Trypan blue solutionGibco15250061
Tube rack assemblyBeckman Coulter361646
Tube spacers (x4)Beckman Coulter361669
Tubing for peristaltic pumpFisher Scientific14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotorBeckman Coulter337922
Ultra low temperature freezerSet at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentratorSartoriusVS2041
Water bath Set at 37 °C

Referanslar

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
  3. George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
  4. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  5. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. c. D. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  6. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  7. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
  8. Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
  9. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
  10. Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
  11. Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
  12. Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
  13. Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
  14. Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
  15. Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
  16. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
  17. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
  18. Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
  19. Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
  20. Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
  21. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  22. Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  23. Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
  24. Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
  25. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  26. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  27. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
  28. Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
  29. Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
  30. Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
  31. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  32. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  33. Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
  34. Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
  35. Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
  36. Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
  37. Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
  38. Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
  39. De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
  40. Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır