Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا لإنشاء عضويات سرطان المبيض من مراحل المرض المختلفة ويعالج تحديات التباين الخاص بالمريض لزيادة الغلة وتمكين التوسع القوي على المدى الطويل للتطبيقات اللاحقة. يتضمن خطوات مفصلة لمعالجة الأنسجة ، والبذر ، وضبط متطلبات الوسائط ، وتلطيخ التألق المناعي.

Abstract

في حين أن إنشاء بنك حيوي لسرطان المبيض من المواد العضوية المشتقة من المريض جنبا إلى جنب مع معلومات الخلفية السريرية الخاصة بهم يعد بالتقدم في البحث ورعاية المرضى ، إلا أن التوحيد القياسي لا يزال يمثل تحديا بسبب عدم تجانس هذا الورم الخبيث القاتل ، جنبا إلى جنب مع التعقيد المتأصل في التكنولوجيا العضوية. يوفر هذا البروتوكول القابل للتكيف إطارا منهجيا لتحقيق الإمكانات الكاملة لعضويات سرطان المبيض مع الأخذ في الاعتبار التباين الخاص بالمريض للأسلاف. من خلال تنفيذ سير عمل تجريبي منظم لتحديد ظروف الاستزراع المثلى وطرق البذر ، مع الاختبار المتوازي للبذر ثلاثي الأبعاد المباشر مقابل مسار 2D / 3D ، نحصل ، في معظم الحالات ، على خطوط توسيع قوية طويلة الأجل مناسبة لمجموعة واسعة من تطبيقات المصب.

والجدير بالذكر أن البروتوكول قد تم اختباره وإثبات كفاءته في عدد كبير من الحالات (N = 120) من المواد الأولية غير المتجانسة للغاية ، بما في ذلك سرطان المبيض عالي الدرجة ومنخفض الدرجة ومراحل المرض مع إزالة الانتفاخ الأولية ، والمرض المتكرر ، والعينات الجراحية بعد النيو المساعدة. ضمن بيئة إشارات خارجية منخفضة Wnt و BMP عالية ، لاحظنا أن الأسلاف معرضون بشكل مختلف لتنشيط مسار Heregulin 1 ß (HERß-1) ، مع تعزيز HERß-1 لتشكيل الأعضاء في البعض بينما تثبيطه في البعض الآخر. بالنسبة لمجموعة فرعية من عينات المريض ، يستلزم التكوين العضوي الأمثل والنمو طويل الأجل إضافة عامل نمو الخلايا الليفية 10 و R-Spondin 1 إلى الوسط.

علاوة على ذلك ، نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة لهضم الأنسجة وعزل السلف ونشير إلى أمثلة حيث تكون الزراعة القصيرة في 2D على البلاستيك مفيدة لتشكيل عضوي لاحق في مصفوفة مستخلص الغشاء القاعدي من النوع 2. وبشكل عام، يتطلب البنك الحيوي الأمثل اختبارا منهجيا لجميع الظروف الرئيسية بالتوازي لتحديد بيئة نمو مناسبة للخطوط الفردية. يصف البروتوكول أيضا إجراء المناولة للتضمين والتقسيم والتلوين بكفاءة للحصول على صور عالية الدقة للمواد العضوية ، وهو أمر مطلوب للتنميط الظاهري الشامل.

Introduction

لا تزال الإدارة السريرية لمرضى سرطان المبيض الظهاري صعبة بسبب عرضه السريري غير المتجانس في المراحل المتقدمة ومعدلات التكرار العالية1. يتطلب تحسين فهمنا لتطور سرطان المبيض والسلوك البيولوجي مناهج بحثية تعالج التباين الخاص بالمريض أثناء مسار المرض ، والاستجابة للعلاج ، والسمات النسيجية المرضية وكذلك الجزيئية2.

إن البنوك الحيوية، التي تتميز بالجمع المنهجي والحفظ طويل الأجل لعينات الورم المشتقة من مرضى سرطان المبيض جنبا إلى جنب مع معلوماتهم السريرية، توفر الحفاظ على مجموعة كبيرة من المرضى في مراحل المرض المختلفة، بما في ذلك عينات الورم من جراحات إزالة الانتفاخ الأولية، وبعد العلاج الكيميائي المساعد الجديد ومن الأمراض المتكررة. إنه يحمل إمكانات قيمة للنهوض بأبحاث السرطان بمثابة مورد للمؤشرات الحيوية الواعدة والأهداف العلاجية3. ومع ذلك ، فإن طرق البنوك الحيوية التقليدية ، مثل تثبيت الفورمالين والتجميد ، ليست قابلة لإجراء دراسات وظيفية على عينات الورم الأصلية بسبب فقدان الصلاحية وتعطيل بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد الأصلية 4,5.

تعتمد دراسات الآليات الجزيئية ، في علم الأورام وما بعده ، بشكل حاسم على استخدام النماذج التجريبية المناسبة التي تعكس بأمانة بيولوجيا المرض وتحافظ على الخصائص المختبرية للأنسجة التي لوحظت في الجسم الحي. تقوم الكائنات العضوية المشتقة من المريض ، بناء على الحفاظ على إمكانات التجديد ، بإعادة إنتاج الهيكل الأصلي للظهارة ووظيفتها في المختبر وتسمح بالاختبار في سياق خاص بالمريض. لذلك ، فقد برزت كأدوات واعدة للغاية لأبحاث السرطان والطب الشخصي ، وسد الفجوة بين التنوع السريري والبحوث المختبرية6،7،8،9. يمكن تطبيق الاستراتيجيات العلاجية المصممة خصيصا بناء على الاستجابات الدوائية الفردية للخطوط العضوية واختبار الأهمية الوظيفية للملامح الجزيئية مباشرة على رعاية المرضى10,11. إن إمكانية الزراعة طويلة الأجل بما في ذلك الخصائص الخاصة بالمريض وجمع البيانات السريرية المستقبلية ذات الصلة بمرور الوقت تبشر بخير كبير لتحديد العوامل النذير والتنبؤية الجديدة التي ينطوي عليها تطور المرض وآليات المقاومة 3,9.

ومع ذلك ، فإن بناء بنك حيوي يتضمن عضويات من عينات أورام مختلفة يتطلب مزيجا من الالتزام الصارم بالمنهجية المعقدة ووضع بروتوكولات لسهولة الصيانة12. يضمن توحيد العمليات إمكانية إنشاء البنك الحيوي وصيانته بكفاءة من قبل موظفين مدربين حتى في حالة الدوران المرتفع ، مع الالتزام في نفس الوقت بأعلى معايير الجودة13. أفادت العديد من الدراسات عن الجيل الناجح من الخطوط العضوية المستقرة لسرطان المبيض المقابلة للملف الطفري والظاهري للورم الأصلي بمعدلات كفاءة متفاوتة. ومع ذلك ، لا تزال البنوك الحيوية الروتينية تمثل تحديا في الممارسة العملية ، لا سيما بالنسبة للنمو المستقر طويل الأجل للخطوط ، وهو شرط أساسي للتوسع على نطاق واسع أو التحرير الجينومي الناجح.

على وجه الخصوص ، لا تزال مسألة قابلية التوسع معرفة غامضة في هذا المجال حيث يتم أحيانا احتساب المواد العضوية التي تظهر إمكانات نمو بطيئة ومحدودة كخطوط ثابتة. كما أوضح في البداية هوفمان وآخرون ، وهي دراسة وفرت نتائجها الرئيسية الأساس لهذا البروتوكول الأكثر تطورا ، فإن المعالجة المثلى لأنسجة سرطان المبيض تتطلب استراتيجية فريدة لاستيعاب عدم التجانس14. تم تأكيد التوصيف الظاهري للعضويات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة والتشابه الوثيق مع أنسجة الورم الأبوي من خلال تسلسل الحمض النووي للوحة وتحليل النسخ للثقافات الناضجة (4-10 أشهر من الزراعة) مما يدل على استقرار النموذج8،9،12،14.

على النقيض من بيئة paracrine التي تنظم التوازن في قناة فالوب الصحية ، فإن الطبقة الظهارية ، التي من المحتمل أن تنتج سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) ، وإمكانية تجديد السرطان ، وقدرة تكوين الأعضاء ، أقل اعتمادا على مكملات Wnt الخارجية. علاوة على ذلك ، أثبتت إشارات البروتين المورفولوجي النشط للعظام (BMP) ، والتي تتميز بغياب Noggin في الوسط العضوي ، أنها مفيدة لإنشاء ثقافات طويلة الأجل من رواسب الأنسجة الصلبة لسرطان المبيض14,15. خلال البنوك الحيوية المنهجية للرواسب الصلبة لسرطان المبيض ، أكدنا هذه النتائج وأنشأنا خط الأنابيب ، مع التفاصيل الموضحة في هذا البروتوكول الذي يضمن التوسع المستدام على المدى الطويل في معظم الحالات. نجد أن الاختبار المتوازي لتركيبات الوسائط المختلفة وطرائق البذر عند العمل مع العزلات الأولية ضروري لتحسين إنشاء خطوط عضوية مستقرة طويلة الأجل وزيادة الغلة مما يتيح انتشارا قويا وتوسعا إلى تنسيقات الآبار المتعددة المطلوبة للتجارب النهائية16.

علاوة على ذلك ، فإن نقاء وجودة العينات التي تم جمعها أثناء الجراحة لهما أهمية حاسمة للإمكانات الانتقالية لعضويات سرطان المبيض في الأبحاث الأساسية والتشخيص الجزيئي. يتطلب تعقيد العرض السريري ل HGSOC تعاونا وثيقا بين الجراحين وأطباء الأورام والعلماء في المختبر لضمان تحديد المواد ذات الصلة بشكل صحيح ، والحفاظ على ظروف النقل ثابتة ، ويتم إنشاء خطوط عضوية بكفاءة عالية تمثل أهم خصائص مرض كل مريض. يوفر هذا البروتوكول إطارا موحدا ولكنه قابل للتكيف لالتقاط الإمكانات الكاملة لعضويات سرطان المبيض ، مع الأخذ في الاعتبار عدم التجانس الذي يميز سرطان المبيض16,17. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يتيح البنوك الحيوية الموثوقة لمجموعة واسعة من العرض السريري لسرطان المبيض ، بما في ذلك الأنواع النسيجية المختلفة (سرطان المبيض عالي الدرجة ومنخفض الدرجة ، LGSOC) ، ورواسب مختلفة من نفس المرضى الذين يظهرون اختلافات في تنظيم الجذعية ، والأنسجة من العمليات الجراحية في إعداد ما بعد المساعد الجديد ، ومواد الخزعة ، وعينات من العمليات الجراحية في المرحلة المتكررة من تطور المرض.

Protocol

تم جمع عينات أنسجة الورم من جراحات سرطان المبيض وتم إنشاء عضويات مشتقة من المريض وفقا للجنة الأخلاقيات بجامعة LMU (17-471) ، مع الالتزام باللوائح الحالية المعمول بها في الاتحاد الأوروبي والوطنية والمحلية. وافق كل مريض مشارك في الدراسة في شكل مكتوب. عند العمل مع عينات الأنسجة الطازجة ، يلزم الحصول على إذن أمان من المستوى 2 للسلامة البيولوجية وخزانات التدفق الصفحي. ونظرا للطبيعة المعدية المحتملة لعينات الأنسجة، التي لا يمكن استبعادها بسبب عدم وجود اختبارات روتينية للأمراض المعدية ذات الصلة، فمن الضروري ضمان التقيد الصارم بلوائح السلامة البيولوجية المؤسسية وتوافر معدات الحماية الشخصية الكافية للموظفين الذين يجرون التجارب.

1. الاستعدادات

  1. إعداد متوسطة
    1. قم بإعداد وسائط 2D و 3D طازجة مرة واحدة في الأسبوع وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم سرد التركيب الدقيق للمكونات لكل وسيط في الجدول 1. يمكن استكمال كل من وسط سرطان المبيض 1 (OCM1) و OCM2 بالإضافة إلى HER1ß (التركيز النهائي: 50 نانوغرام / مل) ، مما يؤدي إلى أربع حالات مختلفة: OCM1 ، OCM1 + HER1ß ، OCM2 ، OCM2 + HER1ß.
    2. إنشاء حلول مخزون من كواشف عامل النمو والاحتفاظ بها عند 20 درجة مئوية و A83-01 ونيكوتيناميد (التخزين عند +4 درجة مئوية). نظرا لحساسية عوامل النمو لدرجة الحرارة ، استخدم محاليل المخزون المذاب على الفور للتحضير المتوسط وتجنب دورات الذوبان المتكررة عن طريق إنشاء قسامة.
      ملاحظة: يعد إعداد وسائل الإعلام خطوة حاسمة تحتاج إلى رقابة صارمة.
    3. إعداد الوسط المشروط RSPO-1
      1. قم بإذابة الخلايا التائية HA-R-Spondin1-Fc 293 (التخزين عند -80 درجة مئوية) بسرعة عند 37 درجة مئوية. اغسلها ب 10 مل من وسط الاستزراع القاعدي ، مع استكمال 10٪ مصل عجل الجنين (FCS) ، ويشار إليه من الآن فصاعدا باسم وسط الثقافة القاعدية ++.
      2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 12 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ وزرعها في دورق T75.
      3. تقسيم الخلايا بنسبة 1: 6 باستخدام كاشف تفكك يحتوي على التربسين (4 دقائق عند 37 درجة مئوية) عندما تصل الخلايا إلى التقاء. بذرها في قارورة T75 جديدة.
      4. في اليوم التالي ، أضف phleomycin D1 (1،25 ميكرولتر / مل) إلى الوسط.
      5. تقسيم الخلايا بنسبة 1:20 مع التربسين (4 دقائق عند 37 درجة مئوية) عندما تصل الخلايا إلى التقاء. قم بزرع الخلايا في قوارير T75 متعددة (عدد القوارير وفقا للحجم النهائي المستهدف) في 30 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ (يحتوي على 10٪ FCS) مع مكمل ب phleomycin D1.
      6. ابدأ إنتاج الوسائط المشروطة عندما تصل الخلايا إلى حوالي 50٪ من التقاء: استبدل الوسط ب 40 مل من وسط الثقافة القاعدية المكمل ب 5٪ FCS بدون phleomycin D1.
      7. جمع أول طاف بعد 3 أيام. لإزالة الحطام ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1200 × جم. احتفظ بالمادة الطافية في وعاء معقم عند 4 درجات مئوية.
      8. أضف وسط استزراع قاعدي جديد مكمل ب 5٪ FCS إلى الخلايا. جمع طاف الثاني بعد 3-4 أيام. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 1200 × غرام. أضف الطافي الثاني إلى الطافي الأول.
      9. صفي الوسط المكيف باستخدام مرشح أعلى الزجاجة 0.2 ميكرومتر.
      10. لمراقبة الجودة والقياس الكمي RSPO1 ، أضف الوسط المنتج إلى خط خلية 293T (293T WntR ، 7xTcf-eGFP) 14 ، يتم تحويله بثبات باستخدام GFP-plasmid الذي يحمل مراسل Wnt18.
        ملاحظة: اعتمادا على كمية وشدة إشارة GFP ، يتم اختبار نشاط RSPO1 كناهض لمسار Wnt عن طريق القياس الكمي لخط خلية مراسل Wnt.
      11. احتفظ بقسمة 15 مل للاستخدام الفوري (في غضون أسبوع واحد) عند 4 درجات مئوية. لتخزين أطول (6 أشهر) احتفظ بالوسط المكيف عند -20 درجة مئوية.

2. بدء ثقافة عضوية سرطان المبيض

  1. عزل الأنسجة الأولية
    1. نقل الأنسجة الطازجة والقابلة للحياة ويفضل مباشرة بعد الجراحة وإجراء العزل في غضون 20 ساعة كحد أقصى بعد جمعها. تأكد من حالة النقل المناسبة في وسط جمع الأنسجة باستخدام صندوق نقل مجهز بكمادات باردة عند حوالي 4 درجات مئوية.
    2. في المختبر ، قم بإعداد الكواشف والمعدات اللازمة لتسهيل معالجة العينات في الوقت المناسب:
      1. مصفوفة مستخلص غشاء القاع من النوع الثاني (مصفوفة BME 2) على الجليد (حوالي 2 ساعة).
      2. قم بإعداد المشارط التي تستخدم لمرة واحدة ، وأدوات التشريح المعقمة (المقص والملاقط) ، وإدخالات مرشح بحجم 400 ميكرومتر لأنابيب 50 مل.
      3. قم بإعداد وعاء يحتوي على كمية صغيرة من النيتروجين السائل للتجميد المفاجئ وحمام مائي مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: العمل داخل غطاء التدفق الصفحي لزراعة الخلايا.
    3. اغسل المنديل الطازج في طبق بتري جيدا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (بدون Ca++ و Mg ++). داخل طبق بتري ، قم بتفتيت الأنسجة باستخدام المشارط و / أو المقص القابل للتصرف إلى قطع صغيرة بحجم 3-5 مم.
    4. افصل الأنسجة التي تم الحصول عليها إلى ثلاثة أقسام للأغراض التالية:
      1. جمع الأنسجة في الأنابيب المبردة. انقل الأنابيب المبردة إلى الحاوية المحضرة المملوءة بالنيتروجين السائل لتجميد الصدمات.
      2. جمع الأنسجة (2-3 مم) في حاوية عينات نسيجية مملوءة بالفورمالين للتثبيت (24 ساعة) وتضمينها في البارافين لأغراض تلطيخ19،20.
      3. علاوة على ذلك ، تجانس الأنسجة قبل الهضم الأنزيمي. تعظيم التفكك الميكانيكي بمشرط ونقله إلى أنبوب نسيج سعة 50 مل.
        ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة غارقة دائما في برنامج تلفزيوني أثناء التجانس لتجنب جفاف الأنسجة.
    5. الجمع بين الأنسجة المتجانسة مع خليط الهضم الذي يحتوي على PBS (بدون Ca ++ و Mg ++) ، كولاجيناز I (محلول مخزون 5 وحدة / ميكرولتر ، التركيز النهائي 1 وحدة / ميكرولتر) ، ومثبط انتقائي ROCK1 و 2 (تركيز نهائي 3 ميكرومتر) (المكونات المدرجة في الجدول 1). استخدم 15 مل من خليط الهضم في أنبوب سعة 50 مل لكل 2 سم3 من الورم.
      ملاحظة: تتطلب المواد المحدودة (مثل عينات الخزعة) كميات صغيرة فقط (حوالي 2-3 مل) من خليط الهضم لضمان التفكك الأنزيمي.
    6. للتفكك الأنزيمي ، احتضان الأنبوب لمدة 1.5 ساعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إجراء دوامة متقطعة وقوية (كل 20 دقيقة تقريبا لمدة 10-15 ثانية) لدعم التفكك الميكانيكي.
    7. بعد الحضانة ، أضف 15 مل من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++ إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق عند 300 × جم.
    8. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي الجديد ++. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مرشح 400 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل.
    9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. إزالة طاف والحفاظ على بيليه الخلية.
    10. لإزالة كريات الدم الحمراء ، أضف 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) إلى حبيبات الخلية. احتضان في حمام مائي لمدة 5 دقائق على 37 درجة مئوية.
    11. أضف 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ لتعطيل التحلل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. أضف 3 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ إلى حبيبات الخلية.
    12. عد الخلايا القابلة للحياة بعد تخفيف 1: 1 باستخدام محلول صبغة تريبان الزرقاء (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر من العينة + 10 ميكرولتر من محلول البقع الزرقاء تريبان) في عداد خلية أوتوماتيكي أو يدويا في غرفة نيوباور.
    13. حساب عدد الخلايا اللازمة للبذر 3D المباشر. لكل رواسب الورم ، قم بالبذور في صفيحة مكونة من 48 بئرا على الأقل 2-3 آبار لكل وسط سرطان المبيض ، وهو ما يتوافق مع إجمالي 8-12 بئرا في مصفوفة البذر (OCM1 ، OCM1 + HER1ß ، OCM2 ، OCM2 + HER1ß). احسب 30000 خلية لكل بئر في قطرة 25 ميكرولتر من مصفوفة BME Type 2. اختياريا ، اختر تنسيق 24 بئرا مع 50 ميكرولتر من مصفوفة BME 2 و 50000 خلية مصنفة لكل بئر.
    14. قم بزرع الخلايا المتبقية في 2D (انظر الخطوة 2.1.13).
    15. ماصة كمية تعليق وسط الثقافة القاعدية ++ الذي يحتوي على العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة في أنبوب جديد وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. إزالة طاف والحفاظ على بيليه الخلية.
    16. على الجليد ، أضف الكمية الإجمالية من مصفوفة BME 2 الباردة (25 ميكرولتر لكل بئر في لوحة تنسيق 48 بئرا ؛ وبالتالي ، 100 ميكرولتر ل 4 آبار) إلى الحبيبات واخلطها جيدا لتحقيق توزيع متساو للخلايا لكل بئر عن طريق سحب الحبيبات برفق لأعلى ولأسفل دون إنشاء فقاعات.
    17. قم بزرع الخلايا في قطرات من مصفوفة BME 2 (25 ميكرولتر) إلى لوحة 48 بئر الفارغة المدفأة مسبقا. لتحقيق توزيع متساو بين الآبار ، حرك الماصة برفق وببطء لأعلى ولأسفل (3-4x) داخل الأنبوب قبل نقل قطرة مصفوفة BME 2 إلى كل بئر لمنع ترسيب الخلية أثناء التوزيع.
    18. بعد احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لدمج قطرات مصفوفة BME 2 ، ماصة 250 ميكرولتر لكل من وسائط سرطان المبيض الأربعة (OCM1 ، OCM1 + HER1ß ، OCM2 ، OCM2 + HER1ß) في الآبار المقابلة.
    19. بالتوازي مع إجراء البذر المباشر 3D ، حافظ على الخلايا المعزولة المتبقية عن طريق بدء ثقافة 2D.
      1. بعد الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، أضف الحبيبات إلى وسيط 2D. حدد التنسيق (قارورة T75 أو قارورة T25) ، اعتمادا على عدد الخلايا المتاحة بعد البذر ثلاثي الأبعاد.
      2. احتضان القارورة لمدة 3-5 أيام عند 37 درجة مئوية للتصاق الخلايا. احتفظ بنفس الوسط لأول 72 ساعة.
      3. عندما تصل الخلايا إلى نقطة التقاء ، انقل الثقافة إلى مصفوفة BME 2. لا تقم بتوسيع العزلات الأولية في ثقافة 2D عن طريق الانقسام لأن الانتشار طويل المدى على 2D يضر بإمكانية الجذعية.
  2. نقل من ثقافة 2D إلى ثقافة 3D
    1. في قارورة T75 أو T25 ، اغسل الطبقة الأحادية 2x ب 5 مل من PBS لفصل الخلايا عن السطح السفلي. احتضان مع 1 مل من التربسين لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 5 مل من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++ لتعطيل كاشف التفكك. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام.
    3. أضف 3 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ إلى الحبيبات. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1.12-2.1.13. بذرة لتركيبات الوسائط المختلفة (انظر الشكل 1) كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.18.
  3. تقييم النمو العضوي
    1. صور الآبار مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتوثيق نمو المواد العضوية. اصنع صورا قابلة للمقارنة عالية الجودة لثقافة 2D / 3D وألواح البذر المباشر بواسطة مجهر تباين الطور. احرص على الاتساق في التكبير واستخدم 4x للحصول على نظرة عامة على الآبار (القياس الكمي) و 10x و 20x لتوثيق مورفولوجيا الكائنات العضوية.
    2. تنظيم تخزين الصور في مجلدات مخصصة للخطوط الفردية.
    3. اختر أفضل خط عضوي للزراعة طويلة الأجل من خلال التقييم المقارن لتكوين الأعضاء في طرق البذر المختلفة (2D متبوعا بالبذر ثلاثي الأبعاد مقابل البذر ثلاثي الأبعاد المباشر) وتركيبات الوسائط المختلفة (OCM1 و OCM1 + HER1ß و OCM2 و OCM2 + HER1ß).
      1. في المتوسط ، بعد 14-21 يوما من العزلة ، قم بتقييم إمكانات تكوين الأعضاء (الكمية) بالإضافة إلى الحجم والنمط الظاهري الخلوي للعضويات المزروعة في ظل ظروف مختلفة. ابحث عن الميزات التالية: عدم وجود فجوات ، أو فحم الغشاء أو فقدان الالتصاق ، وتقريب الخلايا.

3. زراعة العضوية على المدى الطويل

  1. المرور العضوي
    1. تجنب تقسيم المواد العضوية بشكل متكرر وأثناء المرحلة التكاثرية. إجراء إجراءات الهضم الميكانيكية والأنزيمية مع فترات تزيد عن 10 أيام.
    2. لتعطيل كل قطرة مصفوفة BME 2 ، أضف 250 ميكرولتر (تنسيق 48 بئرا) أو 500 ميكرولتر (تنسيق 24 بئرا) من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++. تأكد من الذوبان الكامل للقطرة والماصة بشكل متقطع لأعلى ولأسفل وكشط الجزء السفلي من اللوحة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وضعه على الثلج. أضف 1 مل من وسط الاستزراع القاعدي المثلج ++.
      ملاحظة: تعتمد كفاءة إزالة مصفوفة BME 2 بشدة على درجة الحرارة المتوسطة حيث يتم تحقيق أفضل ذوبان أقل من 4 درجات مئوية.
    3. تجمع 2-3 آبار تقنية مكررة للتوسع المتساوي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. افحص محتوى التعليق مقابل مصدر الضوء لمعرفة ما إذا كان جل BME 2 لا يزال مرئيا. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الغسيل بوسط بارد إذا كانت مصفوفة BME 2 لا تزال مرئية.
    4. احتضان مع 1 مل من التربسين (المخزنة في 20-25 درجة مئوية) في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7-10 دقائق. دوامة بشكل متقطع لمدة 10 ثوان لتعزيز التفكك. افحص الأنبوب بشكل دوري بصريا لمعرفة ما إذا كان التفكك يتقدم.
    5. اسحب تعليق الخلية لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة من خلال إبرة بحجم يتراوح من 23 جم إلى 27 جم. تحقق مما إذا كانت كتل الخلايا الكبيرة لا تزال موجودة وكرر الإجراء إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: التجزئة من خلال حقنة اختيارية ، ويعتمد حجم الإبرة على فعالية التفكك المطلوبة. يؤدي تعليق الخلية المتجانس إلى التوزيع المتساوي بين الآبار.
    6. أضف 1 مل من وسط الاستزراع القاعدي البارد ++ لتعطيل التفاعل.
    7. اختياري: عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1.12-2.1.13 وحدد نسبة الانقسام إلى الممر الأبوي (على سبيل المثال ، 1: 3 آبار).
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام. إزالة الطاف.
    9. إجراء البذر كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.18 وتطبيق الوسط العضوي الأمثل لسرطان المبيض وفقا للثقافة طويلة الأجل القائمة بالفعل. تغيير وسط سرطان المبيض كل 3-4 أيام.
    10. في حالة تعطل قطرة مصفوفة BME 2 أثناء التغيير المتوسط ، فكر في إعادة البذر دون هضم إنزيمي. لتجنب تعطيل القطرة ، قم بإجراء إجراء التغيير الوسيط بعناية دون سحب مباشر على قطرة مصفوفة BME 2. بالإضافة إلى ذلك ، تجنب ترك كمية زائدة من وسط الاستزراع القاعدي المتبقي ++ على الحبيبات قبل التخفيف باستخدام مصفوفة BME 2 في الخطوة 2.1.16 لأنها قد تؤثر على هشاشة القطرات.
  2. الحفظ بالتبريد للمواد العضوية
    ملاحظة: إجراء الحفظ بالتبريد للعضويات أثناء مرحلة الانتشار في الأسبوع الأول بعد المرور.
    1. قم بتعطيل قطرة مصفوفة BME 2 باستخدام وسط الاستزراع القاعدي البارد المثلج ++ وفقا للخطوة 3.1.2. بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية كما هو موضح في الخطوة 3.1.3 ، اعمل على الثلج وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد المثلج. انقل معلق الخلية إلى أنابيب مبردة سعة 1.8 مل محددة مسبقا.
    2. قم بتخزين الأنابيب في حاوية تجميد تحتوي على كحول الأيزوبروبيل مبرد مسبقا وضعها في -80 درجة مئوية طوال الليل.
    3. الحفاظ على أنابيب الأسهم في -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 أشهر. نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين مستقر على المدى الطويل.
  3. ذوبان المخزونات العضوية
    1. قم بتسخين 9 مل من وسط الاستزراع القاعدي ++ في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية في أنبوب مكتوب عليه 15 مل.
    2. انقل قارورة المخزون المطلوبة من التخزين عند -80 درجة مئوية أو إلى النيتروجين السائل إلى حاوية نقل مملوءة بالنيتروجين السائل.
    3. انقل أنبوب التبريد إلى حمام مائي عند 37 درجة مئوية وحركه برفق حتى تبدأ المادة المجمدة بالقرب من جدران الأنبوب في الذوبان.
    4. وزع المعلق العضوي ببطء في الأنبوب المسمى المملوء ب 9 مل من الوسط. هز الأنبوب برفق. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × غرام وإزالة الطاف.
    5. إجراء البذر كما هو موضح في الخطوات 2.1.16-2.1.18 وتطبيق الوسط العضوي الأمثل لسرطان المبيض وفقا لظروف الاستزراع طويلة الأجل المحددة بالفعل للخط الفردي.
  4. تثبيت المواد العضوية
    1. قم بإجراء جمع المواد العضوية كما هو موضح في الخطوات 3.1.2-3.1.3.
    2. أضف 3 مل من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في PBS (درجة الحموضة 7.4) واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. اغسل 2x ب 5 مل من PBS ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم ، وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 4 مل من برنامج تلفزيوني طازج إلى الحبيبات واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى التضمين.
      ملاحظة: المواد العضوية الثابتة مستقرة والتخزين عند 4 °C ممكن لمدة 1 شهر قبل التضمين.
    4. سخني الجل النسيجي (المخزن في -20 درجة مئوية) عند 65 درجة مئوية حتى يتم تسييله.
    5. كشف المواد العضوية الثابتة المستقرة والمرئية في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة الطاف. في حالة تعطل حبيبات الخلية ، قم بإجراء الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم وتخلص من PBS الطاف.
    6. الحبيبات في 100 ميكرولتر من الجل الدافئ عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. انقل القطرة إلى قطعة من فيلم الختم واسمح بحدوث التصلب بعد ~ 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. انقل قطرة الهلام الثابتة إلى علبة البارافين النسيجية. إجراء بروتوكولات تضمين الأنسجة القياسية19،20.
    8. قطع شرائح بسمك 5-10 ميكرومتر باستخدام أداة قطع التقسيم المجهري. نقل التخفيضات على شرائح الأنسجة. تجفيف الشرائح لمدة 1 ساعة عند 65 درجة مئوية ؛ احتفظ بها في مكان جاف.
  5. تلطيخ المناعي للأقسام العضوية
    1. انقل الشرائح المعدة عبر صواني زجاجية بسلسلة التخفيف التالية: 2 × 15 دقيقة عامل مسح للأنسجة ؛ 15 دقيقة 100٪ إيثانول ؛ 1 دقيقة 100٪ إيثانول ؛ 10 دقيقة 96٪ إيثانول ؛ 5 دقائق 70٪ إيثانول ؛ 5 دقائق 50٪ إيثانول.
    2. أضف برنامج تلفزيوني واحتفظ ب 5 دقائق على الخلاط عند 100 دورة في الدقيقة. كرر الغسيل 2x.
    3. أضف محلول استرجاع المستضد (Tris (hydroxymethyl) aminomethane-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - المخزن المؤقت [pH 9.0] أو Citrate [pH 6.0]) إلى الشرائح الموضوعة في الغرفة القابلة للحرارة. في قدر بخاري ، احتفظ بالحاوية مع الشرائح لمدة 30 دقيقة ، تليها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. كرر الخطوة 3.5.2.
    5. انقل الحجرة التي تحتوي على الشرائح لمدة 15 دقيقة إلى محلول منظف نفاذية 1٪ (في PBS).
    6. كرر الخطوة 3.5.2.
    7. حدد موقع المواد العضوية على الشرائح باستخدام قلم شمعي مناعي للحفاظ على القطرة خلال الخطوات التالية.
    8. أضف على كل شريحة 100 ميكرولتر من مصل 10٪ في وسط تخفيف ، اعتمادا على أنواع الجسم المضاد الثانوي.
    9. كرر الخطوة 3.5.2.
    10. تمييع الأجسام المضادة الأولية في وسط ، مما يؤدي إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. يحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل في صينية الحضانة / غرفة الرطوبة.
    11. كرر الخطوة 3.5.2.
    12. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في وسط ، مما يؤدي إلى قطرات 100 ميكرولتر ، والاحتفاظ بها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في صينية الحضانة.
    13. كرر الخطوة 3.5.2.
    14. أضف محلول مضاد للبقع النووية DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dihydrochloride) المخفف في وسط تخفيف 1:1,000. يحفظ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحضانة.
    15. كرر الخطوة 3.5.2.
    16. أضف وسيط التثبيت وقم بتغطيته بغطاء الغطاء. ثبت الشرائح بطلاء أظافر شفاف بمجرد أن يجف (حوالي 8-12 ساعة).
    17. صورة مع مجهر متحد البؤر أو مجهر مضان آخر. قم بعمل صور عامة بالإضافة إلى صور مفصلة للهياكل تحت الخلوية التي تلتقط الخصائص الرئيسية لمورفولوجيا العضوية.

النتائج

بعد تفكك الأنسجة الأولي ، والترشيح ، والعد ، يتم زرع الخلايا بالتوازي مباشرة في شكل 3D ، كما هو موضح أعلاه ، وكذلك التعليق في القارورة لتوسيع 2D وجيزة. في بعض الحالات ، يؤثر التوسع 2D العابر بشكل إيجابي على تكوين العضو العضوي ، ويتم إنشاء الخط طويل الأجل بنجاح عبر هذا المسار بينما يمكن أن يؤدي ?...

Discussion

يعالج البروتوكول المصمم التحديات السابقة للبنوك الحيوية العضوية لسرطان المبيض فيما يتعلق بتكوين الأعضاء وإمكانية المرور على المدى الطويل ويضمن توليد خطوط قابلة للتوسيع بالكامل من غالبية رواسب الورم الصلبة. تؤثر عملية الجمع الجراحي لعينات الورم لاستخدامها في توليد المواد العضوية بشكل ?...

Disclosures

تم إدراج M.K. كمخترع على براءة اختراع تتعلق بوسيط لعضويات سرطان المبيض. تلقت F.T. تمويلا بحثيا ومجلسا استشاريا وأتعابا ونفقات سفر من AstraZeneca و Clovis و Eisai و ImmunoGen و Medac و MSD و PharmaMar و Roche و SAGA Diagnostics و Tesaro / GSK. تلقى S.M. تمويلا بحثيا أو مجلسا استشاريا أو نفقات فخرية أو نفقات سفر: AbbVie و AstraZeneca و Clovis و Eisai و GlaxoSmithKline و Hubro و Medac و MSD و Novartis و Nykode و Olympus و PharmaMar و Pfizer و Roche و Sensor Kinesis و Teva و Tesaro.

Acknowledgements

يتم تمويل الدراسة من قبل مركز أبحاث السرطان الألماني DKTK ، موقع شريك ميونيخ ، شراكة بين DKFZ ومستشفى جامعة LMU ميونيخ. يتم دعم الدراسة أيضا من خلال منحة مساعدة السرطان الألمانية (#70113426 و #70113433). تم إجراء تضمين البارافين للأنسجة والمواد العضوية في المنشأة الأساسية لمعهد التشريح ، كلية الطب ، LMU ميونيخ ، ميونيخ. تم إجراء التصوير البؤري في مرفق التصوير الحيوي الأساسي في المركز الطبي الحيوي (BMC). يريد المؤلفون أن يشكروا سيمون هوفمان وماريا فيشر وكورنيليا هيربست وسابين فينك ومارتينا رحمة على المساعدة التقنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
  3. Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
  4. Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  8. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  9. Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
  10. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
  11. Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
  12. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
  13. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).
  14. Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
  15. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
  16. Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
  17. Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
  18. Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
  19. . Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1 Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021)
  20. Thermo Scientific. . Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
  21. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved